CN104822382A - 用于治疗糖尿病性肾病和相关疾病的半乳糖分支的糖类化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明的方法和组合物涉及糖尿病性肾病和相关疾病的治疗。具体地说,所述方法和组合物单独使用药用级半乳糖分支的糖类或其药物组合物或者将其与其它治疗剂联合使用。在动物模型中观察到肾病标记有效减少。在本发明糖类的应用中所实现的有效剂量达到0.1-0.45mg/kg的下限。
Description
相关申请
本申请要求2012年10月10日提交的美国临时申请系列号61/711,929的权益和优先权,该文献的全部公开内容通过引用的方式完整地并入本文。
技术领域
本发明的多个方面涉及使用药用级半乳糖分支的多糖或其药物组合物治疗糖尿病性肾病和相关疾病的方法。
背景技术
糖尿病性肾病是由肾小球中毛细血管的血管病引起的进行性肾脏疾病。它在病理学上的特征为导致蛋白尿、肾病综合征、肾小球滤过率进行性降低并最终导致肾衰竭的弥散性肾小球硬化。
糖尿病性肾病是由长期存在的糖尿病所引起的,并且在许多西方国家是透析的主要适应症。
虽然控制血清葡萄糖水平和控制血压在减缓糖尿病性肾病的进展方面是有效的,但是肾衰竭依然是一个主要的健康问题。因此,对提供在糖尿病性肾病的预防、进展延缓或逆转方面有效的疗法存在需求。
发明内容
本发明的一些方面涉及在治疗糖尿病性肾病方面具有合适或增加的功效的治疗性制剂。在一些实施方案中,所述治疗性制剂包含有效量的半乳糖分支的多糖化合物。在一些实施方案中,所述治疗性制剂可以单独施用或在混合物或配方中与有效量的治疗剂共同施用。该制剂可以进一步包含额外的用于治疗糖尿病性肾病或者糖尿病的治疗剂或赋形剂,其中制剂处于粉末形式或处于液体形式。
在一些实施方案中,有效量的含有半乳糖的多糖可以在用于口服施用的制剂中施用。制剂可以包括物理改变化合物或添加各种增强含有半乳糖的多糖口服吸收的物质的方法。
在一些实施方案中,所述化合物是含有半乳糖的多糖并且可以与治疗有效量的可以抑制单一半乳糖凝集素蛋白或一组半乳糖凝集素蛋白的一种或多种其它半乳糖凝集素抑制剂联合使用。半乳糖凝集素抑制剂可以包含但不限于半乳糖凝集素的有机小分子抑制剂、单克隆抗体、RNA抑制剂、小结合肽、蛋白质抑制剂或它们的组合。
在一些实施方案中,所述治疗方法包括获得包含处于可接受药用载体中的半乳糖分支的糖类化合物的肠胃外或肠内施用药物组合物的步骤。
在一些实施方案中,所述化合物是可以在化学上定义为半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的多糖,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯是一种选择性解聚的支化杂聚物,其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成,伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成,其转而与任意数目的主要包含1,4-β-D-半乳糖(Gal)的侧链连接。其它侧链次要组分可以包括阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)。
在一些实施方案中,所述化合物是半乳糖分支的糖,该糖可以在化学上定义为称作半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的半乳糖-鼠李糖半乳糖酸酯的亚型,所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯是一种选择性解聚的支化杂聚物,其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成,伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成,其转而与任意数目的主要包含1,4-β-D-半乳糖(Gal)残基和1,5-α-L阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。其它的侧链次要组分可以包括木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)。
在一些实施方案中,所述化合物可以从天然果胶合成。另外,在一些实施方案中,所述化合物可以是合成性半乳糖分支的化合物。
在一些实施方案中,所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧基化的USP果胶合成,所述果胶可以来自任何植物来源,包括但不限于柑橘果、苹果或甜菜。
在一些实施方案中,所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧基化的USP果胶合成,如同从含有8-12%果胶的苹果渣制备出的那一种。
在一些实施方案中,所述化合物可以在充分受控且特异性碱(pH 8至12)和酸(pH 1-5)水解或借助过氧化物或其它化学的β-消除情况下或者通过合适的酶促水解和分离来合成。
在一些实施方案中,可以通过如下的方法产生所述化合物,即:该方法包括在1至100mM还原形式的额外过渡金属离子如Cu++存在或不存在的情况下,通过从抗坏血酸产生的离子化OH-和/或过氧化物定向过氧化裂解糖苷键所分解代谢的解聚。其它过渡金属离子如Ca ++ 或Fe++可以用于此目的。其它过渡金属离子如Ca++或Fe++也可以用于此目的。
在一些实施方案中,可以在糖苷连接的甲氧基化α-1,4-连接的GalA的充分受控和特异性水解情况下合成所述化合物,同时保留具有富集量的1,4-β-D-Gal和1,5-α-L-Ara的侧链。可以通过GC-MS(气相色谱-质谱法)和AELC-PAD(阴离子交换液相色谱-脉冲安培检测器)法定量地测定1,4-β-D-Gal和1,5-α-L-Ara的量。
在一些实施方案中,所述1,4-β-D-Gal残基和1,5-α-L-Ara残基在本发明化合物中的摩尔百分数分别可以超过总摩尔糖的10%,且二者的比例大约在1:1至3:1的范围内。
在一些实施方案中,本发明化合物中1,5-α-L-Ara残基的摩尔百分数可以是零或仅以至多1%的痕量存在。
在一些实施方案中,所述化合物是在化学上定义为半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯或半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的多糖,一种具有2,000至80,000、或20,000至70,000、或5,000至55,000道尔顿的平均分子量分布的支化杂聚物,如通过SEC-RI和/或SEC-MALLS法所测定。
在一些实施方案中,所述化合物可以是分子量范围大幅度降低(例如从约2,000至约80,000D)的高度可溶的改性多糖,从而与治疗性制剂相容以通过多种途径用于多种施用,所述途径包括但不限于静脉内、皮下、关节内、吸入和口服。
在一些实施方案中,所述半乳糖分支的糖类化合物可以包括半乳甘露聚糖多糖。在一些实施方案中,所述化合物是半乳甘露聚糖低聚糖,该低聚糖基本上由半乳糖残基和甘露糖残基组成并且由充分受控的半乳甘露聚糖的解聚作用产生,从而产生具有明确平均分子量的半乳甘露聚糖多糖组合物。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物基本上由半乳糖残基和甘露糖残基组成并且由半乳甘露聚糖的充分受控的解聚作用产生。在一些实施方案中,所述组合物包含均一半乳甘露聚糖多糖。在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖具有4,000至60,000D的平均重量,如由GPC-MALLS所测定(半乳甘露聚糖)。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物具有在1:1至1:4范围内的甘露糖分子与半乳糖分子比率。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物具有1.7:1的甘露糖分子与半乳糖分子比率。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物是通过这样的方法产生,即,该方法被设计成产生高纯的可溶性且均一的低聚物,所述低聚物具有大约48,000道尔顿的平均分子量和大约1.7:1的甘露糖与半乳糖比率。在一些实施方案中,所述产品呈半乳甘露聚糖(GM)的高度可溶性低聚物形式。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与其它药剂联合作为继发于全身性疾病的肾小球疾病的疗法,所述全身性疾病包括但不限于糖尿病性肾病、全身性红斑狼疮、淀粉样变、肺出血肾炎综合征、显微镜下多发性关节炎/多血管炎、Wegeners肉芽肿病、Henoch Schonlein紫癜和与肾中免疫复合物沉积相关的疾病。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与其它药剂联合作为原发性肾小球病的疗法,所述原发性肾小球病包括但不限于急性弥散增生性肾小球肾炎(链球菌后和非链球菌性)、快速进行性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、最小变化疾病、局灶节段性肾小球硬化、膜增生性肾小球肾炎和IgA肾病。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与其它药剂联合作为肾小管间质病或者全身性疾病(包括在间质隙中扩张和胞外基质沉积)的疗法,所述疾病包括但不局限于糖尿病性肾病、间质性肾炎和免疫学肝损伤(包括但不限于同种异体移植排斥)。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致蛋白尿减少至少10%或者蛋白尿(包括但不限于白蛋白)增高率下降至少10%。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球滤过率升高至少10%或者肾小球滤过率下降率降低至少10%,如由任何标准方法所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球系膜胞外基质减少至少10%或者肾小球系膜胞外基质增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少5%,如采用光学或电子显微镜在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球系膜的体积分数减少至少10%或者肾小球系膜体积分数的增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致间质小管容量减少至少10%或者间质容量增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%或者间质小管腔隙中胶原蛋白的增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致糖尿病性肾病血清生物标记的水平变化至少10%。这类标记包含但不限于炎性细胞因子和血液动力学细胞因子、TNF-α、TGF-β或IL-8、骨桥蛋白(osteopontin)、或表明糖尿病性肾病的存在或者严重性的血清成分的代谢谱(包括血清和尿标记)。如通过免疫测定法或采用LC质谱的蛋白质组评估所测量的一种或多种这些细胞因子谱可以提供对疾病活动性的评估和疾病治疗中追踪的标记。
本发明的一些方面涉及一种方法,其包括获得用于肠胃外或肠内施用的组合物,该组合物包含处于可接受药用载体中的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,和向有需要的受试者施用有效量的组合物。在一些实施方案中,所述有效量等同于0.1mg/kg至9.9mg/kg的动物剂量并且导致以下情况中的至少一种:蛋白尿减少至少10%或者蛋白尿增高率下降至少10%;肾小球滤过率升高至少10%或者肾小球滤过率下降率降低至少10%;肾小球系膜胞外基质减少至少10%或者肾小球系膜胞外基质增加率下降至少10%;肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少5%;肾小球系膜的体积分数减少至少10%或者肾小球系膜体积分数的增加率下降至少10%;间质小管容量减少至少10%或者间质容量增加率下降至少10%;间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%或者间质小管腔隙中胶原蛋白的增加率下降至少10%;糖尿病性肾病血清生物标记的水平变化至少10%。在一些实施方案中,所述有需要的受试者患有以下疾病中的至少一种:原发性肾小球疾病、继发性肾小球疾病和肾小管间质病。在一些实施方案中,所述糖尿病性肾病的血清生物标记包括炎性细胞因子和血液动力学细胞因子、TNF-α、TGF-β或IL-8、骨桥蛋白、或表明糖尿病性肾病的存在或者严重性的血清成分的代谢谱。在一些实施方案中,所述有效量的范围可以从0.05至0.49mg/kg。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基的低聚物的主要分支。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基的低聚物的主要分支。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以进一步包含木糖残基、葡萄糖残基、岩藻糖残基或其组合。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有2,000至80,000、20,000至70,000、或5,000至55,000道尔顿的平均分子量分布,如通过SEC-RI法和/或SEC-MALLS法所测定。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以基本上不含1,5-α-L-Ara残基。
在一些实施方案中,所述组合物还包含一种或多种半乳糖凝集素抑制剂。在一些实施方案中,所述半乳糖凝集素抑制剂可以包括半乳糖凝集素的有机小分子抑制剂、单克隆抗体、RNA抑制剂、小结合肽、蛋白质抑制剂或它们的组合。
本发明的一些方面涉及一种方法,其包括获得用于肠胃外或肠内施用的组合物,该组合物包含处于可接受药用载体中的半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,和向有需要的受试者施用有效量的等同于0.1mg/kg至1.99mg/kg动物剂量的组合物。在一些实施方案中,所述有效量导致以下情况中的至少一种:蛋白尿减少至少10%或者蛋白尿增高率下降至少10%;肾小球滤过率升高至少10%或者肾小球滤过率下降率降低至少10%;肾小球系膜胞外基质减少至少10%或者肾小球系膜胞外基质增加率下降至少10%;肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少5%;肾小球系膜的体积分数减少至少10%或者肾小球系膜体积分数的增加率下降至少10%;间质小管容量减少至少10%或者间质容量增加率下降至少10%;间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%或者间质小管腔隙中胶原蛋白的增加率下降至少10%;糖尿病性肾病血清生物标记的水平变化至少10%。在一些实施方案中,所述有需要的受试者患有以下疾病中的至少一种:原发性肾小球疾病、继发性肾小球疾病和肾小管间质病。在一些实施方案中,所述糖尿病性肾病的血清生物标记包括炎性细胞因子和血液动力学细胞因子、TNF-α、TGF-β或IL-8、骨桥蛋白、或表明糖尿病性肾病的存在或者严重性的血清成分的代谢谱。在一些实施方案中,所述有效量范围可以从0.05至0.19mg/kg。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯是包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支。在一些实施方案中,1,4-β-D-Gal残基、1,5-α-L-Ara残基和其组合的摩尔百分数至少是总摩尔糖的8%。在一些实施方案中,1,4-β-D-Gal残基和1,5-α-L-Ara残基可以按范围从1:1至3:1的比率存在。在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有2,000至80,000、20,000至70,000、或5,000至55,000道尔顿的平均分子量分布,如通过SEC-RI法和/或SEC-MALLS法所测定。在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有40%至70%的甲氧基化程度。在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有范围从4:1至7:1的半乳糖醛酸甲酯加上半乳糖醛酸与半乳糖的比率。
本发明的多个方面涉及一种组合物,其包含等同于0.1mg/kg至1.99mg/kg动物剂量的有效量的半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯处于可接受药用载体中,用于治疗糖尿病性肾病,其中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支。在一些实施方案中,所述有效量范围可以从0.05至0.19mg/kg。
本发明的多个方面涉及一种组合物,其包含等同于0.1mg/kg至9.99mg/kg动物剂量的有效量的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯处于可接受药用载体中,用于治疗糖尿病性肾病,其中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基的低聚物的主要分支。在一些实施方案中,所述有效量的范围可以从0.05至0.49mg/kg。
附图说明
将参考附图进一步解释本发明,其中,相同的结构在几个附图中始终由相同的数字表示。所示出的附图并不一定按比例绘制,反之,通常将重点放在示出本发明的原理。
图1示出用高碘酸西夫(PAS)试剂染色的小鼠肾组织学切片。图中显示了三个实验组的低放大率(x200)和高放大率(x400)图片:1)正常小鼠;2)用溶媒(磷酸盐缓冲液盐水,治疗对照)治疗的糖尿病小鼠;和3)用GR-MD-02/001B(IV40mg/kg)治疗的糖尿病小鼠。箭头指向肾小球。
图2示出用苦味酸天狼猩红试剂染色的小鼠肾组织学切片。图中显示了三个实验组的低放大率(x50)和高放大率(x200)图片:1)正常小鼠;2)用溶媒(磷酸盐缓冲液盐水,治疗对照)治疗的糖尿病小鼠;和3)用GR-MD-02/001B(IV 40mg/kg)治疗的糖尿病小鼠。箭头指向表明存在胶原蛋白类型的染色条带。
图3示出用苦味酸天狼猩红试剂染色的小鼠肾的数字式形态测量学结果,以定量天狼猩红染色百分数。图中显示了三个实验组的天狼猩红染色百分数的统计比较:1)正常小鼠;2)用溶媒(磷酸盐缓冲液盐水,治疗对照)治疗的糖尿病小鼠;和3)用GR-MD-02/001B(IV 40mg/kg)治疗的糖尿病小鼠。
具体实施方式
本文中公开了本发明的详细实施方案;然而,应当理解的是,所公开的实施方案仅是说明可以按多种方式体现的本发明。此外,所给出的与本发明的多个实施方案相关的每个实施例旨在进行说明,而非限制性的。另外,附图不必然地按比例绘制,可以放大一些特征以显示特定组分的细节。此外,图中所显示的任何量值、说明等旨在进行说明,而非限制性的。因此,本文中公开的特定结构和功能细节不应理解为限制性的,而仅理解为教导本领域的技术人员以多种方式实施本发明的代表性基础。
除非另外说明,否则本文中所表述的全部百分数均是重量/重量。
20%和40%之间的(I型和II型)糖尿病患者最终形成糖尿病性肾病。糖尿病性肾病(也称作Kimmelstiel-Wilson综合征,或结节性糖尿病肾小球硬化和毛细血管间肾小球肾炎)是由肾小球中毛细血管的血管病引起的进行性肾脏疾病。糖尿病性肾病是美国和其它西方社会中慢性肾脏疾病的主导原因,在美国导致30-40%的全部终末期肾病。就个体糖尿病患者的发病率和死亡率而言,它也是最明显的长期并发症之一。
糖尿病性肾病是特征如下的临床综合征:1)持续性白蛋白尿(>300mg/d或者>200μg/分钟),2)肾小球滤过率(GFR)进行性下降,3)动脉血压升高。
糖尿病性肾病通常在常规尿分析和在糖尿病背景下筛查微量白蛋白尿后诊断。
患者可以具有与长期糖尿病相关的身体表现,如,高血压、外周血管疾病、精细感觉降低和腱反射削弱形式的糖尿病性神经病迹象、心脏听音期间第四心音迹象或者不愈合的皮肤溃疡/骨髓炎。几乎全部肾病和I型糖尿病患者表现糖尿病性微血管疾病体征,如视网膜病变和神经病。
糖尿病性肾病患者具有进行性和不可阻挡的肾小球滤过率降低。糖尿病性肾病伴I型或II型糖尿病患者分别具有约9.6至12ml/分钟/年至约5.4至7.2ml/分钟/年的肾小球滤过率下降。
尽管存在良好证据显示早期治疗延迟或阻止糖尿病性肾病或糖尿病性肾脏疾病发作,但它仍是一个重大健康问题。因此,对可以预防本病、延迟其进展或造成其消退的治疗存在需求。
在糖尿病性肾病中的经典肾病变是结节性肾小球硬化。在患有糖尿病性肾病的人的肾小球中存在三种主要组织学变化:1)系膜细胞膨大和基质产生和/或基质蛋白的糖基化增加;2)在系膜细胞和基质扩张后出现的肾小球基底膜(GBM)增厚;3)肾小球硬化。这些不同的组织学形式似乎具有相似的预后意义。
糖尿病性肾小球病中的关键变化是胞外基质增长。最早的形态学畸形在糖尿病性肾病中是因胞外基质积累所致的肾小球基底膜增厚和系膜扩张。
随着肾小球病变进展,肾小管之间的间质中存在日益增加的病理学变化,包括胞外基质物质和胶原蛋白的沉积增加。
组织学研究结果显示肾小球实体腔中胞外基质物质和胶原蛋白的沉积增加,最频繁地作为实体的粗分支(阳性高碘酸西夫反应(PAS))物质而被观察到,但是还存在大量非细胞性积聚物或者结节(Kimmelstiel-Wilson病变/结节)。
可以通过外周基底膜及系膜和基质的厚度评估糖尿病性肾小球病的严重性,所述厚度表述为相应腔的分数(例如,系膜/肾小球、基质/系膜或基质/肾小球的体积分数)。
免疫荧光法显微术可以揭示白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白和其它血浆蛋白沿肾小球基底膜以线性模式沉积,这很可能由来自血管的渗出所致。
在晚期疾病中,电子显微术显示系膜区占据大部分肾小球,伴随明显的基质内容物。另外,毛细血管壁中的基底膜(即,外周基底膜)比正常的厚。
除肾小球病变外,糖尿病性肾病还导致肾脏的肾小管组织间隙中的基质物质增加。可以通过测定肾小管细胞之间基质物质的量确定间质性疾病的严重性,所述基质物质包括但不限于胶原蛋白I型、胶原蛋白IV型、透明质酸、透明质糖(hyaluronan)和蛋白聚糖。
导致病变的基础性病理生理学未被充分理解,但是可能包括高级糖化和氧化应激的产物。人们认为糖尿病性肾病的形成与高血糖有关。葡萄糖可以非酶促地与蛋白质反应以形成西夫碱基和Amadori产物和形成晚期糖基化终产物(AGE),这些产物被认为在糖尿病性肾病的形成中发挥重要作用。
病理生理学还可涉及多种炎性和细胞毒性细胞因子,包括但不限于转化生长因子β1、血管紧张素II和一氧化氮。
本发明的一些方面涉及用于治疗有需要的受试者中半乳糖凝集素参与其中的一种或多种疾病、病症或病状(例如,控制、减轻、缓解、改善或延缓其进展)的方法或用于预防所述疾病、病症或病状(例如,延迟其发作或降低其形成风险)的方法。在一些方面,所述方法包括向受试者施用有效量的半乳糖分支的糖类化合物,或者向患有糖尿病性肾病的受试者施用包含半乳糖分支的糖类化合物的组合物。
如本文所用,术语“有效剂量”指这样的量的化合物,即,该量的化合物单独或与某个量的治疗剂联合作为肠胃外、皮下、吸入、关节内、眼用或者口服制剂向患有糖尿病性肾病或相关疾病的动物或人类施用时,导致疾病活动性降低,如下文在多个实施方案中定义。例如,术语“有效量”意指当作为肠胃外剂量或者在口服制剂中向患有糖尿病性肾病的动物或者人类施用时导致以下至少一种情况的半乳糖分支的糖或者与半乳糖分支的糖联合的其它药物的量:蛋白尿(包括但不限于白蛋白)减少至少10%,肾小球滤过率升高至少10%,肾小球系膜胞外基质减少至少10%,肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少10%,肾小球系膜的体积分数减少至少10%,间质小管容量减少至少10%,和/或间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%。
术语“药学可接受载体”指可以与本发明化合物一起施用至受试者(例如,患者)并且不破坏其药理活性并且按足以递送治疗量或者有效量化合物的剂量施用时无毒的载体或者辅助剂。例如,术语“可接受药用载体”可以指生理相容的任何和全部溶剂、分散介质,例如,人白蛋白或交联型明胶多肽、包衣、抗细菌剂和抗真菌药化合物、等渗剂(例如,氯化钠或谷氨酸钠)和吸收延迟性化合物等。用于药学活性物质的此类介质和化合物的用途是本领域熟知的。优选地,载体适于口服、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或硬膜外施用(例如,通过注射或输注)。取决于施用途径,活性化合物可以包覆于保护该化合物免遭可能使这种化合物失活的酸和其它自然条件作用的材料中。
在一些实施方案中,术语“功效”指显示出改善糖尿病性肾病或其它原发性或继发性肾小球肾病的病变、疾病表现或临床表现。
在一些实施方案中,所述治疗方法包括获得包含处于可接受药用载体中的半乳糖分支的糖类化合物的肠胃外或肠内施用组合物的步骤。
在一些实施方案中,所述化合物是可以在化学上定义为半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的多糖,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯是一种选择性解聚的支化杂聚物,其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成,伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成,其转而与任意数目的主要包含1,4-β-D-半乳糖(Gal)的侧链连接。其它侧链次要组分可以包括阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)。
在一些实施方案中,所述化合物是半乳糖分支的糖,该糖可以在化学上定义为称作半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的半乳糖-鼠李糖半乳糖酸酯的亚型,所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯是一种选择性解聚的支化杂聚物,其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成,伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成,其转而与任意数目的主要包含1,4-β-D-半乳糖(Gal)残基和1,5-α-L阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。其它的侧链次要组分可以包括木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)。
在一些实施方案中,所述1,4-β-D-Gal残基和1,5-α-L-Ara残基在本发明化合物中的摩尔百分数分别可以超过总摩尔糖的10%,且二者的比例大约在1:1至3:1的范围内。
在一些实施方案中,本发明化合物中1,5-α-L-Ara残基的摩尔百分数可以是零或仅以至多1%的痕量存在。
在一些实施方案中,所述化合物是半乳糖分支的糖,该糖在化学上定义为包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支。
在一些实施方案中,所述化合物可以具有范围从40%至70%(最高为87%)的甲氧基化程度。在一些实施方案中,所述化合物具有范围从2:1至1:2的半乳糖醛酸甲酯与半乳糖醛酸比率。在一些实施方案中,所述化合物具有范围从4:1至7:1的半乳糖醛酸甲酯加上半乳糖醛酸与半乳糖的比率。
在一些实施方案中,所述1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物占总糖类摩尔含量的至少8摩尔百分数。在一些实施方案中,1,4-β-D-半乳糖残基和1,5-α-L-阿拉伯糖残基以2:1或3:1的比率存在。
在一些实施方案中,所述化合物是在化学上定义为半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯或半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的多糖,一种具有2,000至80,000、或20,000至70,000、或5,000至55,000道尔顿的平均分子量分布的支化杂聚物,如通过SEC-RI和/或SEC-MALLS法所测定。
在一些实施方案中,所述化合物可以是分子量范围大幅度降低(例如从约2,000至约80,000D)的高度可溶的改性多糖,从而与治疗性制剂相容以通过多种途径用于多种施用,所述途径包括但不限于静脉内、皮下、关节内、吸入和口服。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯化合物可以通过美国系列号8,236,780中和PCT/US12/55311中描述的方法制备,这些文献通过引用的方式完整地并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧基化的USP果胶合成,所述果胶可以来自任何植物来源,包括但不限于柑橘果、苹果或甜菜。
在一些实施方案中,所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧基化的USP果胶合成,如同从含有8-12%果胶的苹果渣制备出的那一种。
在一些实施方案中,可以在糖苷连接的甲氧基化α-1,4-连接的GalA的充分受控和特异性水解情况下合成所述化合物,同时保留具有富集量的1,4-β-D-Gal和1,5-α-L-Ara的侧链。可以通过GC-MS(气相色谱-质谱法)和AELC-PAD(阴离子交换液相色谱-脉冲安培检测器)法定量地测定1,4-β-D-Gal和1,5-α-L-Ara的量。
在一些实施方案中,所述化合物可以在充分受控且特异性碱(pH 8至12)和酸(pH 1-5)水解或借助过氧化物或其它化学的β-消除情况下或者通过合适的酶促水解和分离来合成。
在一些实施方案中,可以通过如下的方法产生所述化合物,即:该方法包括在1至100mM还原形式的额外过渡金属离子如Cu++存在或不存在的情况下,通过从抗坏血酸产生的离子化OH-和/或过氧化物定向过氧化裂解糖苷键所分解代谢的解聚。其它过渡金属离子如Ca++或Fe++可以用于此目的。
如本文所用,术语“解聚”指多糖主链的局部、选择性或完全水解,所述水解例如在化学处理多糖时出现,产生与原始多糖相比尺寸减小的片段。
在一些实施方案中,所述解聚化合物可以在2℃至60℃的温度暴露于8至10之间的pH 10至30分钟以启动受控有限的去甲氧基化,以产生与最高87%的初始水平相比甲氧基化程度为40%至70%的解聚化合物,并且可以称作中等甲氧基化的化合物。认为半乳糖醛酸的完全甲氧基化是大约DE 87%。
在一些实施方案中,所述解聚组合物可以暴露于多次热酸性醇洗涤(例如在30℃-80℃的温度范围内)以除去任何残留的内毒素、铜和重金属、农业污染物和其它杂质。
在一些实施方案中,通过修饰天然存在的聚合物以针对所需范围降低分子量、减少烷基化基团(去甲氧基化或脱乙酰化),制备可溶性化学改性的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯。在化学改性之前,天然多糖可以具有在大约40,000-1,000,000D之间的分子量范围,伴随多个糖分支,例如,由1至20个葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖组成的分支,并且这些分支可以通过中性单糖如鼠李糖连接到主链。这些分子可以进一步包括单个或一连串可以从少到大约2%到至多大约70%酯化的醛酸糖主链。多个分支本身可以具有多个糖分支,所述多个分支任选地包括主要产生疏水体的中性糖和中性糖衍生物。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯组合物可以使用来自任何植物来源的果胶原料通过各种处理产生,所述处理包括加热、高或低pH、多种形式的分子量排阻过滤(或这些方法的组合)。例如,原始果胶物质可以来自苹果、柑橘或甜菜果胶,其中一些是作为USP果胶材料可商业获得的。
在一些实施方案中,所述化合物包括改性果胶。已经描述了糖类化合物的几种组成和制造它们的方法。参见美国专利No.6,573,245、6,645,946、6,914,055、6,982,255、7,012,068、7.491,708和7,893,252,这些专利中的每一份的公开内容通过引用方式完整并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯组合物根据美国专利No.8,128,966和美国申请No.US 20120149658中的描述制备,各文献的公开内容通过引用的方式明确地完整并入用于全部目的。
在一些实施方案中,所述半乳糖分支的糖类组合物根据美国临时申请系列号61/704,174和61/693,978中的描述制备,这些专利中的每一份的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述化合物落在包括基本上脱甲氧基化的聚半乳糖醛酸主链的大类内,所述聚半乳糖醛酸主链具有从其上悬垂的鼠李糖残基。认为在这种类型的物质中,从主链悬垂的末端半乳糖单元结合半乳糖凝集素蛋白。剩余的分子主体可以增强化合物在调节免疫系统反应方面的作用。尽管不希望受推测限制,但是剩余的分子主体可以与剩余的半乳糖凝集素蛋白部分相互作用和/或可以延长糖部分与它的结合。
在一些实施方案中,所述化合物可以包含半乳甘露聚糖多糖。在一些实施方案中,所述化合物是半乳甘露聚糖低聚糖,该低聚糖基本上由半乳糖残基和甘露糖残基组成并且由充分受控的半乳甘露聚糖的解聚作用产生,从而产生具有明确平均分子量的半乳甘露聚糖多糖组合物。
半乳甘露聚糖可以从多种天然来源如植物和微生物资源获得。也可以按合成方式制备该多糖。半乳甘露聚糖可以源自角豆胶(角豆树(Ceratonia siliqua))、瓜耳胶(瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba))和美国皂荚(三刺皂荚(Gleditsia triacanthos)),是可商业获得的半乳甘露聚糖的例子。该多糖包括但不限于从许多种植物和微生物资源获得的半乳甘露聚糖。例如,半乳甘露聚糖可以是来自瓜尔豆(Cyamopsistetragonoloba)的种子的瓜尔胶衍生物。然而在其它实施方案中,半乳甘露聚糖可以是美国皂荚、黄花苜蓿(Medicago falcate)、胡卢巴属(Trigonella)胡卢巴(Foenum-graecum)和微生物如角豆树野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、酵母和霉菌半乳甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖(来自西部落叶松(Larix occidentalis))、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(来自马铃薯)、角叉菜胶(来自麒麟菜属(Eucheuma)海藻)和刺槐豆胶(来自角豆树)的衍生物。
如本文所用,术语“主链”意指多糖的主要链或源自起始多糖主要链的链,其具有通过α或β糖苷键依次连接的糖部分。主链可以包含在沿连续链的各个位置与之相连的额外单糖部分。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物基本上由半乳糖残基和甘露糖残基组成并且由半乳甘露聚糖的充分受控的解聚作用产生,从而产生均一的半乳甘露聚糖多糖。在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖具有4,000至60,000D的平均重量,如由GPC-MALLS所测定(半乳甘露聚糖)。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物具有在1:1至1:4范围内的甘露糖分子与半乳糖分子比率。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物具有1.7:1的甘露糖分子与半乳糖分子比率。
在一些实施方案中,所述半乳甘露聚糖多糖组合物根据美国专利7,893,252中的描述制备,该文献通过引用的方式明确地完整并入用于全部目的。该方法被设计成产生高纯的可溶性且均一的低聚物,所述低聚物具有大约48,000道尔顿的平均分子量和大约1.7:1的甘露糖与半乳糖比率。该方法包括4个主要阶段:产生所需半乳甘露聚糖低聚物的受控解聚和三个纯化步骤:移除不溶性杂质、移除水溶性杂质、移除有机可溶解性杂质,和最终冷冻干燥以产生纯且稳形式的半乳甘露聚糖粉末。在一些实施方案中,所述产品呈半乳甘露聚糖(GM)的高度可溶性低聚物形式。
半乳甘露聚糖可以作为无菌浓缩溶液在一次性使用小瓶中包装并递送,而散装半乳甘露聚糖可以作为粉末生产并储存。本文描述的方法用于散装药物和药物成品。半乳甘露聚糖药品可以与形成药物配制品有效成分的治疗有效量的治疗剂联合并且一起施用。在一些实施方案中,所述药品可以含有用于输注的生理盐水(大约0.9M在水中的氯化钠)并且具有大约6.5的pH。
尽管前面的讨论已经主要涉及基于改性果胶和半乳甘露聚糖的治疗性物质,但是应当理解本发明不受此限制。根据本发明的一般原理,可以使用可与半乳糖凝集素相互作用并且阻断半乳糖凝集素的一大类化合物的任何成员。在一个实施方案中,这些物质包括糖类物质,因为这类物质毒性低并且显示出与半乳糖凝集素强烈的相互作用或显示出强烈的抗炎作用。改性果胶物质包括一个特定组的糖类物质。同样,可以类似地使用其合成和半合成类似物如聚半乳糖醛酸物质。
然而,本发明的另一类物质包括具有与第二部分连接的第一部分的分子,所述第一部分一般是糖类并且能够结合半乳糖凝集素,所述第二部分失活或否则调节蛋白质活性。该第二部分不需要是糖类并且可以包括交联包含半乳糖凝集素蛋白活性部分的蛋白质区段或与半乳糖凝集素相互作用的另一种蛋白质的活性部分或否则使之变性的物质。这类物质包括活性物质如单独或组合的硫或其它硫族元素如巯基、硫氢基等。其它活性物质可以包括氰基、硫氰酸酯、烷基化剂、醛等。一些活性物质可以是蛋白质,包括但不限于单克隆抗体。
在一些实施方案中,该方法包括如下步骤:获得处于可接受药物载体中肠胃外或者肠内施用的半乳糖分支的糖类化合物。
在一些实施方案中,该方法包括获得用于肠胃外或者肠内施用的半乳糖分支的糖类化合物的步骤,所述糖类化合物包括化学改性的二糖或低聚糖和/或其衍生物,所述二糖或低聚糖具有作为起始化学结构的至少一个半乳糖,包括但不限于吡喃半乳糖苷或3-三唑基-半乳糖苷。
在一些实施方案中,所述化学改性的二糖或低聚糖组合物根据US6,444,655描述的那样制备,该文献通过引用的方式完整地并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述化学改性的二糖或低聚糖组合物根据US8,092,825描述的那样制备,该文献通过引用的方式完整地并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述化学改性的二糖或低聚糖组合物根据US7,700,763描述的那样制备,该文献通过引用的方式完整地并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述化学改性的二糖或低聚糖组合物根据US7,638,623描述的那样制备,该文献通过引用的方式完整地并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述化学改性的二糖或低聚糖组合物根据US7,230,096描述的那样制备,该文献通过引用的方式完整地并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述半乳糖分支的化合物可以根据美国临时申请No.61/704,174和61/693,978中的描述合成,这些文献通过引用方式完整并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中,所述半乳糖分支的糖类化合物可以与治疗有效量的治疗剂联合使用。例如,所述半乳糖分支的糖类化合物可以与治疗有效量的常规糖尿病性肾病治疗剂联合使用。
在一些实施方案中,所述半乳糖分支的糖类化合物可以用于混合物中。“混合物”意指混合在一起以形成组合的多于一种组分。出于本发明的目的,“混合物”意指在施用之前或之后或与之同时的任何时间,两种或更多种化合物的混合物。
本发明的一些方面涉及在治疗糖尿病性肾病方面具有合适或增加的功效的糖尿病性肾病治疗性制剂。在一些实施方案中,所述糖尿病性肾病治疗性制剂包含有效量的半乳糖分支的多糖。在一些实施方案中,所述糖尿病性肾病治疗性制剂可以单独施用或在混合物或配方中与有效量的治疗剂共同施用。该制剂可以进一步包含额外的糖尿病性肾病或者糖尿病治疗剂或赋形剂,其中制剂处于粉末形式或处于液体形式。
在另一个实施方案中,有效量的含有半乳糖的多糖可以在用于口服施用的制剂中施用。制剂可以包括物理改变化合物或添加各种增强含有半乳糖的多糖口服吸收的物质的方法。化合物的修饰可以包括但不限于连接至疏水性部分,例如但不限于脂族基团。可以增强吸收的制剂添加物可以包括但不限于增加肠道屏障通透性的物质。
在一些实施方案中,所述化合物是含有半乳糖的多糖并且可以与治疗有效量的可以抑制单一半乳糖凝集素蛋白或一组半乳糖凝集素蛋白的一种或多种其它半乳糖凝集素抑制剂联合使用。半乳糖凝集素抑制剂可以包含但不限于半乳糖凝集素的有机小分子抑制剂、单克隆抗体、RNA抑制剂、小结合肽、蛋白质抑制剂或它们的组合。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与以上列出的其它化合物联合作为人糖尿病性肾病的疗法,作为预防本病、延缓其进展或者缓解或者逆转本病的一种方法。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与其它以上列出的化合物联合作为原发性肾小球病的疗法,所述疾病包括但不限于急性弥散增生性肾小球肾炎(链球菌后和非链球菌性)、快速进行性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、最小变化疾病、局灶节段性肾小球硬化、膜增生性肾小球肾炎和IgA肾病。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与其它以上列出的化合物联合作为继发于全身性疾病的肾小球病的疗法,所述全身性疾病包括但不限于糖尿病性肾病、全身性红斑狼疮、淀粉样变、肺出血肾炎综合征、显微镜下多发性关节炎/多血管炎、Wegeners肉芽肿病、Henoch Schonlein紫癜和与肾中免疫复合物沉积相关的疾病。
在一些实施方案中,提出将所述含有半乳糖的多糖和其它化合物单独或与其它以上列出的化合物联合作为肾小管间质病或者全身性疾病(包括在间质隙中扩张和胞外基质沉积)中的疗法,所述疾病包括但不局限于糖尿病性肾病、间质性肾炎和免疫学肝损伤(包括但不限于同种异体移植排斥)。
在一些实施方案中,有效量的含有半乳糖的多糖可以通过多种途径施用,所述途径包括肠胃外途径,通过作为重复静脉推注或恒量输注给予的静脉内输注、皮内注射、作为重复快速浓注或恒量输注皮下给予或口服施用。
含有半乳糖的多糖对实验动物的有效肠胃外剂量(静脉内、腹内或皮下给予)是在0.1mg/kg直至160mg/kg体重、或1mg/kg、或10mg/kg、或30mg/kg、或60mg/kg、或90mg/kg或120mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中,所述含有半乳糖的多糖对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)是在0.1mg/kg至1mg/kg、0.1至1.5mg/kg、0.1mg/kg至1.9mg/kg的范围内。在一些实施方案中,所述含有半乳糖的多糖对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)是在0.1mg/kg至3mg/kg、0.1mg/kg至4mg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至6mg/kg、0.1mg/kg至7mg/kg、0.1mg/kg至8mg/kg、0.1mg/kg至9mg/kg或0.1mg/kg至9.9mg/kg的范围内。在一些实施方案中,所述含有半乳糖的多糖对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)小于10mg/kg或小于2mg/kg。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以是0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或9.99mg/kg。在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以在0.1至9.99mg/kg、0.2至9.99mg/kg、0.3至9.99mg/kg、0.4至9.99mg/kg、0.5至9.99mg/kg、1至9.99mg/kg、2至9.99mg/kg、3至9.99mg/kg、4至9.99mg/kg、5至9.99mg/kg、6至9.99mg/kg、7至9.99mg/kg、8至9.99mg/kg、9至9.99mg/kg、0.1至0.2mg/kg、1至2mg/kg、2至3mg/kg、3至4mg/kg、4至5mg/kg、5至6mg/kg、6至7mg/kg、7至8mg/kg、8至9mg/kg的范围内。
在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以在0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.40mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或1.99mg/kg的范围内。在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以在0.1mg/kg至0.2mg/kg、0.2至0.3mg/kg、0.3mg/kg至0.4mg/kg、0.4至0.5mg/kg、0.5mg/kg至0.6mg/kg、0.6mg/kg至0.7mg/kg、0.7至0.8mg/kg、0.8至0.9mg/kg、0.9mg/kg至1mg/kg、1至1.1mg/kg、1.1至1.2mg/kg、1.2至1.3mg/kg、1.3mg/kg至1.4mg/kg、1.4mg/kg至1.5mg/kg、1.5至1.6mg/kg、1.6至1.7mg/kg、1.7至1.9mg/kg、或1.9至1.99mg/kg的范围内。
含有半乳糖的多糖对于实验动物的有效肠胃外剂量(静脉内、腹内或皮下给予)可以每周三次、每周二次、每周一次、每两周一次、每月一次或作为恒量输注施用。
在一些实施方案中,含有半乳糖的多糖对人类的有效肠胃外剂量定义为等同于这样的动物剂量,即,该动物剂量在人类中产生与动物中相同的全身暴露量。将全身暴露量的等同性定义为作为药代动力学参数分析的部分所进行的相同曲线下面积(AUCinfinity)。例如,相对于动物剂量的人类等同剂量将是人类中这样的剂量,即,该剂量产生与动物中该剂量下所测得相同的全身暴露量或AUC。在一些实施方案中,所述实验动物模型是小鼠。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)等同于在00.1至9.99mg/kg、0.2至9.99mg/kg、0.3至9.99mg/kg、0.4至9.99mg/kg、0.5至9.99mg/kg、1至9.99mg/kg、2至9.99mg/kg、3至9.99mg/kg、4至9.99mg/kg、5至9.99mg/kg、6至9.99mg/kg、7至9.99mg/kg、8至9.99mg/kg、9至9.99mg/kg、0.1至0.2mg/kg、1至2mg/kg、2至3mg/kg、3至4mg/kg、4至5mg/kg、5至6mg/kg、6至7mg/kg、7至8mg/kg、8至9mg/kg范围内的动物剂量。在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)等同于在0.1mg/kg至0.2mg/kg、0.2至0.3mg/kg、0.3mg/kg至0.4mg/kg、0.4至0.5mg/kg、0.5mg/kg至0.6mg/kg、0.6mg/kg至0.7mg/kg、0.7至0.8mg/kg、0.8至0.9mg/kg、0.9mg/kg至1mg/kg、1至1.1mg/kg、1.1至1.2mg/kg、1.2至1.3mg/kg、1.3mg/kg至1.4mg/kg、1.4mg/kg至1.5mg/kg、1.5至1.6mg/kg、1.6至1.7mg/kg、1.7至1.9mg/kg、或1.9至1.99mg/kg范围内的动物剂量。
对于人类受试者,含有半乳糖的多糖的有效肠胃外剂量(静脉内或皮下给予)是在0.05mg/kg直至25mg/kg体重、或1mg/kg、或2mg/kg、或5mg/kg、或7.5mg/kg、或10mg/kg体重或15mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中,含有半乳糖的多糖对人类受试者的有效肠胃外剂量是在0.05mg/kg至0.1mg/kg、0.05mg/kg至0.19mg/kg、0.05mg/kg至0.3mg/kg、0.05mg/kg至0.4mg/kg或0.05mg/kg至0.49mg/kg的范围内(以静脉内或者皮下方式给予)。在一些实施方案中,含有半乳糖的多糖对人类受试者的有效肠胃外剂量小于0.5mg/kg或小于0.2mg/kg(以静脉内或者皮下方式给予)。例如,所述含有半乳糖的多糖对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内或者皮下方式给予)可以是0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.19mg/kg。在一些实施方案中,所述含有半乳糖的多糖对实验动物的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以是0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg或0.49mg/kg。
在一些实施方案中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以是在0.05mg/kg至0.1mg/kg、0.05mg/kg至0.2mg/kg、0.05mg/kg至0.3mg/kg、0.05mg/kg至0.4mg/kg或0.05mg/kg至0.49mg/kg、0.1mg/kg至0.2mg/kg、0.2mg/kg至0.3mg/kg、0.3mg/kg至0.4mg/kg、0.4mg/kg至0.49mg/kg、0.2mg/kg至0.49mg/kg、0.3mg/kg至0.49mg/kg的范围内。
在一些实施方案中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的有效肠胃外剂量(以静脉内、腹腔内或者皮下方式给予)可以是0.05mg/kg至0.1mg/kg、0.05mg/kg至0.06mg/kg、0.05mg/kg至0.07mg/kg、0.05mg/kg至0.08mg/kg、0.05mg/kg至0.09mg/kg、0.05mg/kg至0.11mg/kg、0.05mg/kg至0.12mg/kg、0.05mg/kg至0.13mg/kg、0.05mg/kg至0.14mg/kg、0.05mg/kg至0.15mg/kg、0.05mg/kg至0.16mg/kg、0.05mg/kg至0.17mg/kg、0.05mg/kg至0.18mg/kg、0.1至0.19mg/kg。
对于人类受试者,含有半乳糖的多糖的有效肠胃外剂量(静脉内或皮下给予)可以每周三次、每周二次、每周一次、每两周一次、每月一次或作为恒量输注施用。
在一些实施方案中,糖尿病性肾病可以在包括但不限于小鼠、大鼠、猪、食蟹猴的动物中建立模型。在这些动物中,糖尿病可以通过多种方法引起,包括但不限于用胰岛细胞毒素(包括但不限于高剂量和低剂量链脲霉素)处理和/或提供高脂膳食。
在一些实施方案中,糖尿病性肾病可以在小鼠遗传模型中建立模型。这类模型包括但不限于NOD小鼠、胰岛素-2Akita小鼠、db/db小鼠、Ob/ob小鼠、具有刺鼠突变的小鼠、NZO小鼠或具有单基因突变的多种小鼠或转基因小鼠,所述转基因小鼠包含但不限于载脂蛋白E基因、内皮一氧化氮合酶基因、导致AGE和GLUT1增加的突变,或具有品系依赖性糖尿病形成的近交小鼠。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致蛋白尿减少至少10%或者蛋白尿(包括但不限于白蛋白)增高率下降至少10%。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球滤过率升高至少10%或者肾小球滤过率下降率降低至少10%,如由任何标准方法所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球系膜胞外基质减少至少10%或者肾小球系膜胞外基质增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少5%,如采用光学或电子显微镜在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致肾小球系膜的体积分数减少至少10%或者肾小球系膜体积分数的增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致间质小管容量减少至少10%或者间质容量增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%或者间质小管腔隙中胶原蛋白的增加率下降至少10%,如在肾组织学切片上所测定。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效量,这种作用导致糖尿病性肾病血清生物标记的水平变化至少10%。这类标记包含但不限于炎性细胞因子和血液动力学细胞因子、TNF-α、TGF-β或IL-8、骨桥蛋白、或表明糖尿病性肾病的存在或者严重性的血清成分的代谢谱(包括血清和尿标记)。如通过免疫测定法或采用LC质谱的蛋白质组评估所测量的一种或多种这些细胞因子谱可以提供对疾病活动性的评估和疾病治疗中追踪的标记。
在一些实施方案中,可以通过对糖尿病性肾病的作用评价治疗有效剂量,这种作用导致慢性肾功能不全或者衰竭的临床并发症减少,例如,减少包括透析和肾移植的肾代替疗法的需要。
实施例1:制备半乳糖分支的糖类化合物的方法
以下是制备治疗性多糖的示意性实施例,该实施例不意在限制本发明。根据这种情况,半乳糖分支的糖类化合物是已经在本申请中标记为GR-MD-02/001B的半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯。
将苹果果胶USP HM(50kg)溶解并且在水中加热至35-85℃。加入1M HCl或NaOH以将溶液的pH调节到pH 5-7并充分混合。将混合在35-85℃设定点继续2小时。根据需要加入1M NaOH或HCl以将pH再调节到5和7之间。将溶液冷却至30℃。在30℃,将pH调节到5和7之间。
将CuSO4加入到调节过pH的果胶溶液中,从而形成1mM的最终CuSO4浓度。将1mM CuSO4溶液在10℃和30℃之间的温度混合30分钟。
在30分钟1mM CuSO4混合步骤结束时,加入50克抗坏血酸钠(预先校准量以获得所需的MW)并混合5到20分钟。加入H2O2,以0.02开始并直至1.0摩尔/kg果胶(对于初始的开始果胶MW预先校准),并且将H2O2浓度维持4小时(使用定量检验,Sigma,St-Louis),同时将溶液pH维持在4和7之间。
向溶液加入5M NaOH从而形成8和10之间的溶液pH。将调节过pH的溶液混合10-30分钟。随后向调节过pH的溶液加入浓HCl以将溶液的pH调节到4和5之间。一旦调节到pH 4和5之间,可以将溶液在2℃和8℃之间保持混合2至24小时。
随后将溶液加热到80℃持续30-180分钟,并且向该溶液加入1-5kg过滤助剂(Celite),并将添加过Celite的溶液搅拌30分钟,随后过滤。弃去过滤产生的固体。
将滤液在真空下浓缩1.5-3倍,随后将pH调节到3和5之间。按50%重量加入热的乙醇或异丙醇。将混合物搅拌1-2小时以沉淀产物,随后过滤混合物。弃去滤液,留下白色至米白色沉淀物。
向该溶液加入冷的96%乙醇,并且随后将所产生的浆液搅拌30分钟。将溶液过滤并弃去滤液。重复96%乙醇浆液步骤,接着是最终过滤并回收白色至米白色沉淀物。
实施例2:治疗糖尿病性肾病小鼠模型的方法
该实施例中使用的实验模型是其中诱导糖尿病并施用高脂膳食的小鼠。在出生后立即用单次注射链佐星诱导糖尿病。4周后小鼠开始摄食高脂膳食。
糖尿病小鼠用溶媒(磷酸盐缓冲液盐水)或者GR-MD-02/001B治疗,每周三次按40mg/kg剂量静脉内给予总共4周。每个组中有八(8)只小鼠。还使用两只正常小鼠作为对比组。
在溶媒对照组和GR-MD-02/001B组中血糖水平明显升高,组间无统计差异。小鼠中的正常血糖是大约100mg/dL并且糖尿病动物中的平均数在700和800mg/dL之间,因此表明了所有动物均患有显性糖尿病。
糖尿病小鼠具有糖尿病性肾病的清晰组织学证据,如图1中PAS染色的肾切片的图片中所示。每个组中的箭头显示肾小球,该病中最受影响的结构。在溶媒治疗的对照动物中,系膜基底膜物质(粉红色胞外基质)超过正常动物明显增加。在对比中,与溶媒治疗的对照动物相比,用GR-MD-02/001B治疗的小鼠显示出明显的系膜胞外基质物质减少。
图2显示用特异性着染胶原蛋白I型纤维的天狼猩红试剂染色的肾切片。使用天狼猩红试剂作为染液以评价肾小管细胞之间的间质中胞外基质物质的增加。在正常动物中观察到极少的红色着染。但是,在溶媒治疗的对照动物中观察到着染增加。这由处于“网眼状”构造的红色着染线性区域代表,所述“网眼状”构造表明在肾小管之间的的组织间隙内存在增加的胶原蛋白。用GR-MD-02/001B治疗后,存在天狼猩红染色明显减少,这表明治疗减少了间质胶原蛋白。
图3显示各实验组之间天狼猩红染色百分数的统计比较。通过天狼猩红染色百分数的定量性数字式形态测量,盲态评价来自每个组的三十二(32)张独立切片。图片显示与正常动物相比时,溶媒治疗的对照动物的天狼猩红染色增加,这表明在糖尿病模型中肾小管之间的组织间隙内存在胶原蛋白沉积。与溶媒治疗的对照相比,用GR-MD-02/001B治疗导致天狼猩红染色统计显著的减少,水平几乎与正常小鼠相同。
该实施例说明所用的小鼠糖尿病模型显示出必不可少的糖尿病性肾病病理学变化。另外,与许多其它模型相反,似乎重述了人类糖尿病性肾病中所观察到的,因为它显示出肾小球肾病和肾小管间质扩张。
该实施例进一步表明了本发明中描述的多种半乳糖分支的糖类化合物之一,GR-MD-02/001B,对这个小鼠模型中的糖尿病性肾病的病理学表现具有疗效。GR-MD02/001B减少肾小管组织间隙中胞外基质的系膜扩张并减少如通过胶原蛋白所例示的基质的沉积。
该实施例的结果表明半乳糖分支的糖类化合物可以有效治疗人糖尿病性肾病。
可以理解本文所描述的实施例和实施方案是仅仅用于说明性目的,并且根据它们的各种修改或改变将包括在本申请的精神与范围内以及所附权利要求书的范围内。本文中引用的全部出版物、专利和专利申请在此通过引用的方式完整并入用于全部目的。
Claims (20)
1.一种方法,包括:
a.获得包含处于可接受药用载体中的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的肠胃外或肠内施用的组合物,以及
b.向需要该组合物的受试者施用导致以下至少一种情况的有效量的组合物:
蛋白尿减少至少10%或者蛋白尿增高率下降至少10%;
肾小球滤过率升高至少10%或者肾小球滤过率下降率降低至少10%;
肾小球系膜胞外基质减少至少10%或者肾小球系膜胞外基质增加率下降至少10%;
肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少5%;
肾小球系膜的体积分数减少至少10%或者肾小球系膜体积分数的增加率下降至少10%;
间质小管容量减少至少10%或者间质容量增加率下降至少10%;
间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%或者间质小管腔隙中胶原蛋白的增加率下降至少10%;
糖尿病性肾病血清生物标记的水平变化至少10%;
其中,所述有需要的受试者患有以下疾病中的至少一种:原发性肾小球疾病、继发性肾小球疾病和肾小管间质病,以及
其中,所述有效量等同于0.1mg/kg至9.99mg/kg的动物剂量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基的低聚物的主要分支。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基的低聚物的主要分支。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯还包含木糖残基、葡萄糖残基、岩藻糖残基或其组合。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有通过SEC-RI法和/或SEC-MALLS法所测定的2,000至80,000、20,000至70,000、或5,000至55,000道尔顿的平均分子量分布。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯基本上不含1,5-α-L-Ara残基。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述糖尿病性肾病的血清生物标记包括炎性细胞因子和血液动力学细胞因子、TNF-α、TGF-β或IL-8、骨桥蛋白、或表明糖尿病性肾病的存在或者严重性的血清成分的代谢谱。
8.根据权利要求1所述的方法,所述组合物还包含一种或者多种半乳糖凝集素抑制剂。
9.根据权利要求9所述的方法,所述半乳糖凝集素抑制剂包括半乳糖凝集素的有机小分子抑制剂、单克隆抗体、RNA抑制剂、小结合肽、蛋白质抑制剂或它们的组合。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述有效量范围从0.05至0.49mg/kg。
11.一种方法,包括:
a.获得包含处于可接受药用载体中的半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的肠胃外或肠内施用组合物,以及
b.向需要该组合物的受试者施用导致以下至少一种情况的有效量的组合物:
蛋白尿减少至少10%或者蛋白尿增高率下降至少10%;
肾小球滤过率升高至少10%或者肾小球滤过率下降率降低至少10%;
肾小球系膜胞外基质减少至少10%或者肾小球系膜胞外基质增加率下降至少10%;
肾小球毛细血管基底膜厚度减少至少5%;
肾小球系膜的体积分数减少至少10%或者肾小球系膜体积分数的增加率下降至少10%;
间质小管容量减少至少10%或者间质容量增加率下降至少10%;
间质小管腔隙中胶原蛋白的量减少至少10%或者间质小管腔隙中胶原蛋白的增加率下降至少10%;
糖尿病性肾病血清生物标记的水平变化至少10%;
其中,所述有需要的受试者患有以下疾病中的至少一种:原发性肾小球疾病、继发性肾小球疾病和肾小管间质病,以及
其中,所述有效量相当于0.1mg/kg至1.99mg/kg的动物剂量。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯是包含1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链的半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支。
13.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,1,4-β-D-Gal残基、1,5-α-L-Ara残基和其组合的摩尔百分数至少是总摩尔糖的8%。
14.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,1,4-β-D-Gal残基和1,5-α-L-Ara残基以范围从1:1至3:1的比率存在。
15.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有通过SEC-RI法和/或SEC-MALLS法所测定的2,000至80,000、20,000至70,000、或5,000至55,000道尔顿的平均分子量分布。
16.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有40%至70%的甲氧基化程度。
17.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有范围从4:1至7:1的半乳糖醛酸甲酯加上半乳糖醛酸与半乳糖的比率。
18.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述有效量的范围从0.05至0.19mg/kg。
19.一种组合物,其包含等同于0.1mg/kg至1.99mg/kg动物剂量的有效量的半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯处于可接受药用载体中用于治疗糖尿病性肾病,其中,所述半乳糖阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支。
20.一种组合物,其包含等同于0.1mg/kg至9.99mg/kg动物剂量的有效量的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯处于可接受药用载体中用于治疗糖尿病性肾病,其中,所述半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基主链,所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接,所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基的低聚物的主要分支。
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