CN104807933B - 乳品中短链脂肪酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液及标样储备液的制备；(2)乳品溶液的制备；(3)GC-MS检测；(4)根据对照品和乳品溶液的GC-MS检测结果，确定乳品中所含有的短链脂肪酸的种类；(5)计算短链脂肪酸的相对峰面积。本发明所构建的乳品中短链脂肪酸的检测方法，简单灵敏、快速准确、专属性强、重复性好，可用于乳品中短链脂肪酸的质量控制研究。

Description

乳品中短链脂肪酸的检测方法

技术领域

本发明涉及乳品的质量控制，特别涉及一种乳品中短链脂肪酸的检测方法。

背景技术

乳品中含有蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、维生素，营养丰富、易被人体消化吸收，在人类的膳食结构中占有十分重要的地位。为了向大众提供安全、优质的乳品，需要对其进行严格的质量控制。目前，乳品的质量控制主要包括卫生检测和营养检测。其中，卫生检测包括致病性微生物、农药残留、兽药残留、重金属以及其他危害人体健康物质的限量；营养检测包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质含量。

乳品中还含有短链脂肪酸。短链脂肪酸不仅能够降低结肠内pH值，抑制致病菌的繁殖，营养结肠上皮细胞，促进细胞生长、代谢，维持益生菌代谢，保持肠道菌群稳态；还能抑制促炎因子产生，减少炎症反应，降低肠道病变，抑制结肠癌细胞的增值、分化和转移，促进癌细胞凋亡及控制原癌基因表达。并且，短链脂肪酸还为婴幼儿提供营养，促进婴幼儿生长发育；刺激婴幼儿肠道益生菌的生长、减少有害菌的定植；刺激婴幼儿免疫系统发育，增强免疫系统识别和抗感染能力。

可见，短链脂肪酸不但对维系人体健康十分重要，而且对于促进婴幼儿生长发育尤为重要。因此，需要建立一种测定乳品中短链脂肪酸的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例公开了一种乳品中短链脂肪酸的检测方法。技术方案如下：

乳品中短链脂肪酸的检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液及标样储备液的制备

分别称取8种短链脂肪酸对照品，所述8种短链脂肪酸分别为：甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸，将所述8种短链脂肪酸分别加入无水乙醇溶解定容，即得具有已知浓度的各种短链脂肪酸对照品溶液；

称取2-乙基丁酸，加入无水乙醇溶解定容，即得具有已知浓度的标样2-乙基丁酸储备液；

(2)乳品溶液的制备

当乳品为液体样品时，吸取体积V₁的乳品，加入体积V₂的沉淀剂，提取，离心，取上清液，过滤，即得液体样品的乳品溶液；

当乳品为固体样品时，称取质量M的乳品，加入体积V₃的沉淀剂，提取，离心，取上清液，过滤，即得固体样品的乳品溶液；

所述沉淀剂为含HCl的乙醇溶液，并含有体积V₄的标样2-乙基丁酸储备液；

(3)GC-MS检测

气相条件包括：色谱柱：以硝基对苯二酸改性的聚乙二醇为固定液的毛细管柱；升温程序：初始温度50℃保持1min，之后以10℃/min升至180℃，再以70℃/min升至250℃保持3min；进样口温度：200～250℃；载气：高纯氦；流速：0.5～1.5mL/min；分流比：1:1～50:1；进样体积：0.5～8μL；

质谱条件包括：EI电子轰击离子源；离子源温度：200～250℃；接口温度：200～250℃，溶剂延迟4min；采用SIM扫描方式；

在所述检测条件下，将体积V₅的各对照品溶液和乳品溶液分别注入GC-MS中，记录各对照品溶液和乳品溶液的色谱图；获得各对照品的保留时间及质谱数据；

(4)根据对照品和乳品溶液的GC-MS检测结果，确定乳品中所含有的短链脂肪酸的种类；

(5)计算短链脂肪酸的相对峰面积

按照下列公式计算乳品溶液中短链脂肪酸的相对峰面积：

短链脂肪酸的相对峰面积＝相应的短链脂肪酸峰面积/2-乙基丁酸峰面积。

在本发明的一种优选实施方式中，所述气相条件具体包括：色谱柱DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至180℃，再以70℃/min升至250℃保持3min；进样口温度：250℃；载气为高纯氦；流速：1.0mL/min；分流比为10:1；进样体积：5μL；

所述质谱条件具体包括：EI电子轰击离子源；离子源温度：250℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：4min；采用SIM扫描方式。

在本发明的一种优选实施方式中，所述加入体积V₂的沉淀剂为体积V₁液体样品的1～5倍。

在本发明的一种更优选实施方式中，所述加入沉淀剂的体积V₂为体积V₁液体样品的2～4倍。

在本发明的一种更优选实施方式中，所述加入沉淀剂的体积V₂为体积V₁液体样品的3倍。

在本发明的一种优选实施方式中，所述沉淀剂为含0.5％HCl的乙醇溶液。

在本发明的一种优选实施方式中，所述提取方法为超声提取。

在本发明的一种优选实施方式中，所述离心条件为14000rpm，8～12min。

在本发明的一种优选实施方式中，所述过滤方法为采用0.22μm滤膜过滤。

本发明所构建的乳品中短链脂肪酸的检测方法，简单灵敏、快速准确、专属性强、重复性好，可用于乳品中短链脂肪酸的质量控制研究。

当然，实施本发明的任一产品或方法必不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为己酸的质谱图；

图2为MR-1样品的GC-MS色谱图；

图3为MR-2样品的GC-MS色谱图；

图4为MR-3样品的GC-MS色谱图；

图5为MR-4样品的GC-MS色谱图；

图6为MR-5样品的GC-MS色谱图；

图7为CNN-1样品的GC-MS色谱图；

图8为CNN-2样品的GC-MS色谱图；

图9为CNN-3样品的GC-MS色谱图；

图10为CNN-4样品的GC-MS色谱图；

图11为CNN-5样品的GC-MS色谱图；

图12为SNN-1样品的GC-MS色谱图；

图13为SNN-2样品的GC-MS色谱图；

图14为SNN-3样品的GC-MS色谱图；

图15为SNN-4样品的GC-MS色谱图；

图16为SNN-5样品的GC-MS色谱图；

图17为NF-1样品的GC-MS色谱图；

图18为NF-2样品的GC-MS色谱图；

图19为NF-3样品的GC-MS色谱图；

图20为NF-4样品的GC-MS色谱图；

图21为NF-5样品的GC-MS色谱图。

具体实施方式

本发明采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术建立乳品中的短链脂肪酸的检测方法。

本发明中所称乳品，是指母乳和乳制品。短链脂肪酸，也称挥发性脂肪酸，指碳原子数为1-6的有机脂肪酸。由于短链脂肪酸挥发性强、易于气化，因此采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定乳品中短链脂肪酸。

本发明技术方案使用的对照品甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸和2-乙基丁酸纯度均在99％以上。由于取量非常少，不能准确量取体积，所以称取质量，再分别用无水乙醇溶解定容，得到对照品甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸和标样2-乙基丁酸的浓度。配制和检测甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸对照品溶液的目的在于，确认其各自色谱峰的保留时间和质谱的碎片离子信息，以便判断乳品溶液中所含有的短链脂肪酸的种类。如甲酸对照品溶液于9.2min存在m/z45、m/z46、m/z44的离子，而母乳样品溶液于9.2min处也有m/z45、m/z46、m/z44的离子，即可确认母乳中含有甲酸。配制和检测2-乙基丁酸储备液的目的在于确定2-乙基丁酸的保留时间和作为内标计算乳品溶液中短链脂肪酸的相对峰面积。

本发明的技术方案选用2-乙基丁酸作为内标的好处在于：1、与短链脂肪酸结构类似，且是己酸的同分异构体，具有与测定成分相似理化性质、色谱和质谱行为，使检测更加准确；2、非肠道菌群代谢产物，即待测样品中不含有2-乙基丁酸，不干扰检测结果；3、色谱保留行为较好，保留时间在检测的短链脂肪酸之间，使分析更准确；4、稳定性较好，与其他短链脂肪酸一样，在检测的6小时内稳定。

本发明技术方案的方法为内标法，即将标样2-乙基丁酸提前加入到沉淀剂中，用含有内标的沉淀剂提取乳品中的短链脂肪酸。相对于外标法，内标法的好处在于：1、可以监测乳品的提取过程，不同乳品所含短链脂肪酸的种类和含量不同，通过向其中加入相同量的2-乙基丁酸，检测2-乙基丁酸的峰面积，评价乳品提取过程的一致性；2、标样2-乙基丁酸与待测的乳品溶液同时进样检测，可以减少因进样误差导致的测定误差。

本发明的技术方案选取各对照品中丰度最高的前3个离子用于确定短链脂肪酸的种类和半定量分析，其中通道1用于半定量分析、通道2和3用于定性分析，具体结果如下表1所示：

表1各对照品溶液和标样2-乙基丁酸的GC-MS检测条件

如图1所示，以己酸的质谱峰为例说明特征离子的确认和通道的设定，在预设的质谱条件下，己酸质谱图中含有m/z为60、73、87、41、55、99等离子，故可以采用提取离子检测模式(SIM)选取其中丰度最高的m/z60用于半定量分析，丰度较高的m/z73、m/z87用于定性分析，即在编辑SIM方法时，根据己酸对照品溶液的保留时间12.9min，在12.6～14.00min编辑通道1m/z60、通道2m/z73、通道3m/z87。

根据表1对照品与乳品溶液的GC-MS检测结果，比较分析得出乳品溶液中含有短链脂肪酸的种类。

根据乳品溶液的GC-MS检测结果以内标2-乙基丁酸为参照，计算乳品中短链脂肪酸的相对峰面积。计算公式：

短链脂肪酸的相对峰面积＝相应的短链脂肪酸峰面积/2-乙基丁酸的峰面积。

在本发明技术方案中，沉淀剂用量为液体样品的1～5倍体积，优选的2～4倍体积，更优选的3倍体积。当沉淀剂用量为液体样品的3倍体积时，在充分提取液体样品中短链脂肪酸的同时，去除液体样品中绝大部分的蛋白质，从而保证检测的灵敏度和结果的准确性。选用含有0.5％HCl的乙醇溶液提取样品中的短链脂肪酸的好处在于，可以酸化乳品溶液，使乳品溶液中的短链脂肪酸呈游离态，易于提取和气化，并可使乳品溶液的pH值稳定在1～2范围内，足以克服因短链脂肪酸含量不同而造成的pH值波动，使检测更准确。此外，HCl为挥发性酸，可以全部通过色谱柱，不会残留在离子源处。

本发明选用质量分数为36.5％的浓盐酸。0.5％HCl的乙醇溶液是指质量分数为36.5％的浓盐酸占无水乙醇的体积分数为0.5％。

本发明优选的技术方案中的GC-MS检测条件，气相条件：色谱柱：DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至180℃，再以70℃/min升至250℃保持3min；进样口温度：250℃；载气为高纯氦；流速：1.0mL/min；分流比为10:1；进样体积：5μL；质谱条件：EI电子轰击离子源；离子源温度：250℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：4min；采用SIM扫描方式。选用此检测条件的好处在于，可使乳品中的短链脂肪酸在气相色谱-质谱仪中得到较好的色谱分离、峰形、重复性、灵敏度，保证实验结果准确。

本发明的技术方案所采用的色谱柱为安捷伦公司(Agilent)生产的，型号为DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)。

在本发明方案中，在乳品溶液制备过程中，提取、离心、过滤皆是本领域的惯用手段，可解决本发明的问题。当提取方法为超声提取、14000rpm离心8～12min、0.22μm滤膜过滤时，可将短链脂肪酸从样品中迅速提取出来，并且与样品中的其它物质彻底分离，提高检测的准确性(如图2～21所示)。

本发明中所提及的术语“精密称定”：精密称定系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密吸取”：系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

首先，对本发明实施例所用到的仪器和试剂进行说明。

仪器

GC2010Plus-MSQP2010Ultra型气相色谱-质谱联用仪(日本，Shimadzu公司)，配有自动进样器、柱温箱、质谱检测器；SCIENTZ25-12超声清洗仪(中国，宁波新芝生物技术股份有限公司)；METTLERTOLEDOAL204分析天平(瑞士，METTLERTOLEDO公司)；Milli-Q纯水系统(美国，Millipore公司)。

试剂

甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、2-乙基丁酸购自SigmaAldrich(美国，Sigma公司)；无水乙醇(分析纯)购自康科德(中国，天津市康科德科技有限公司)；实验用母乳为5位产妇第五周乳汁(MR-1～5)，纯牛奶为5种不同品牌的市售纯牛奶(CNN-1～5)，酸奶为5种不同品牌的市售酸牛奶(SNN-1～5)，奶粉为5种不同品牌的市售奶粉(NF-1～5)。

实施例1

(1)GC-MS检测条件

色谱条件

色谱柱：DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至180℃，再以70℃/min升至250℃保持3min；进样口温度：250℃；载气为高纯氦，流速：1.0mL/min；分流比为10:1；进样体积：5μL。

质谱条件

EI电子轰击离子源；离子源温度：250℃；接口温度：250℃，溶剂延迟：4min；采用SIM扫描方式。

(2)对照品溶液及标样储备液的制备

分别精密称定10.02mg甲酸、10.55mg乙酸、10.48mg丙酸、11.94mg异丁酸、10.07mg丁酸、40.14mg异戊酸、11.19mg戊酸、11.52mg己酸和13.20mg2-乙基丁酸，分别置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解并定容至刻度，即得浓度分别为1.002mg/mL甲酸、1.055mg/mL乙酸、1.048mg/mL丙酸、1.194mg/mL异丁酸、1.007mg/mL丁酸、4.014mg/mL异戊酸、1.119mg/mL戊酸和1.152mg/mL己酸、1.320mg/mL2-乙基丁酸(内标)的储备液。

(3)乳品溶液制备

液体样品的制备

分别精密吸取母乳、5种不同品牌的纯牛奶和酸牛奶100μL，分别加入300μL沉淀剂(含2.64μg/mL2-乙基丁酸、0.5％HCl的乙醇溶液)，混匀，14000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，即得液体样品溶液。

固体样品的制备

分别精密称取5种不同品牌奶粉0.5g，加入5mL沉淀剂(含2.64μg/mL2-乙基丁酸、0.5％HCl的乙醇溶液)，混匀，超声5min，14000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，即得固体样品溶液。

(4)确定乳品中所含有的短链脂肪酸的种类

根据表1对照品的检测结果与乳品溶液的GC-MS检测结果比较分析得出乳品溶液中含有短链脂肪酸的种类，结果见表2。被检测的母乳、纯牛奶和酸奶中含有6个短链脂肪酸，分别为甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和己酸；奶粉中含有5个短链脂肪酸，分别为甲酸、乙酸、异丁酸、丁酸和己酸。

(5)计算乳品溶液中各短链脂肪酸的相对峰面积，结果见表2。

表2乳品溶液中短链脂肪酸的相对峰面积结果

以下选取第1位产妇的第五周乳汁(MR-1)为样品做精密度、重复性和稳定性试验。

(6)精密度试验

精密吸取母乳100μL，按实施例1步骤(3)的方法制备乳品溶液，并在实施例1步骤(1)的GC-MS条件下测定，连续测试6次作为日内精密度，连续测试三天作为日间精密度，母乳中短链脂肪酸的日内和日间精密度的RSD值分别≤4.52％和5.04％，表明该方法的精密度良好，结果见表3和表4。

表3母乳中短链脂肪酸的日内精密度试验结果

表4母乳中短链脂肪酸的日间精密度试验结果

(7)重复性试验

精密吸取母乳100μL，按实施例1步骤(3)的方法，平行制备母乳溶液6份，并在实施例1步骤(1)的GC-MS条件下测定，每份样品测定2次，母乳中短链脂肪酸的重复性试验的RSD值≤4.42％，表明该方法的重复性良好，结果见表5。

表5母乳中短链脂肪酸的重复性试验结果

(8)稳定性试验

精密吸取母乳100μL，按实施例1步骤(3)的方法制备母乳溶液，并在实施例1步骤(1)的GC-MS条件下，分别于0h、1h、2h、3h、4h、6h测定，母乳中短链脂肪酸的稳定性试验的RSD值≤6.39％，表明供试品溶液中短链脂肪酸在6h内稳定性良好，结果见表6。

表6母乳中短链脂肪酸的稳定性试验结果

在本实施例中，有些短链脂肪酸的相对峰面积的RSD大于5％，这是由于目前实验条件的限制。气相-质谱联用时，质谱检测器的精密度没有其他检测器(如液相上的紫外检测器、气相上的火焰离子化(FID)检测仪)高。质谱检测化合物时首先需要电离化合物，电离的化合物需要经过电场和质量分析器才能到达检测器，这些过程的均有可能受到干扰。此外，由于生物样品基质较复杂，对质谱造成干扰，故导致质谱检测时产生基质效应，所以在临床前药动学研究手册规定，高浓度化合物的RSD需≤15％、低浓度化合物的RSD需≤20％，本实验以母乳作为方法学考察样品，同时存在上述两种干扰，故出现部分检测结果的RSD值大于5％。

以第1位产妇的第五周乳汁(MR-1)为样品进行方法学验证，精密度、重复性和稳定性试验结果表明，本发明建立的短链脂肪酸检测方法可靠，可根据乳品中各短链脂肪酸的相对峰面积来评定乳品的质量。

上述实施例1的结果可以看出，本发明所构建的乳品中短链脂肪酸的检测方法，简单灵敏、快速准确、专属性强、精密度高、重复性好。

众所周知，母乳是婴幼儿成长最自然、最安全、最完整的天然食物，它含有婴幼儿成长所需的所有营养和抗体，并含有丰富的短链脂肪酸。据此，本发明还可以以母乳样品中短链脂肪酸种类和平均相对含量为标准，来评定婴幼儿乳品中短链脂肪酸的质量。

具体地，提取和检测短链脂肪酸的方法依据实施例1中步骤(1)和(3)，结果见表7。

表7母乳中短链脂肪酸的平均相对峰面积结果

将检测乳品中的短链脂肪酸的相对峰面积与乳母样品中短链脂肪酸的平均相对峰面积比较，即可评定被检测乳品中短链脂肪酸的质量。

本发明中所述的婴幼儿是指0-3岁的小龄孩子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液及标样储备液的制备

分别称取8种短链脂肪酸对照品，所述8种短链脂肪酸分别为：甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸，将所述8种短链脂肪酸分别加入无水乙醇溶解定容，即得具有已知浓度的各种短链脂肪酸对照品溶液；

称取2-乙基丁酸，加入无水乙醇溶解定容，即得具有已知浓度的标样2-乙基丁酸储备液；

(2)乳品溶液的制备

当乳品为液体样品时，吸取体积V₁的乳品，加入体积V₂的沉淀剂，提取，离心，取上清液，过滤，即得液体样品的乳品溶液；

当乳品为固体样品时，称取质量M的乳品，加入体积V₃的沉淀剂，提取，离心，取上清液，过滤，即得固体样品的乳品溶液；

所述沉淀剂为含HCl的乙醇溶液，并含有体积V₄的标样2-乙基丁酸储备液；

(3)GC-MS检测

气相条件包括：色谱柱：以硝基对苯二酸改性的聚乙二醇为固定液的毛细管柱；升温程序：初始温度50℃保持1min，之后以10℃/min升至180℃，再以70℃/min升至250℃保持3min；进样口温度：200～250℃；载气：高纯氦；流速：0.5～1.5mL/min；分流比：1:1～50:1；进样体积：0.5～8μL；

质谱条件包括：EI电子轰击离子源；离子源温度：200～250℃；接口温度：200～250℃，溶剂延迟4min；采用SIM扫描方式；

在所述检测条件下，将体积V₅的各对照品溶液和乳品溶液分别注入GC-MS中，记录各对照品溶液和乳品溶液的色谱图；获得各对照品的保留时间及质谱数据；

(4)根据对照品和乳品溶液的GC-MS检测结果，确定乳品中所含有的短链脂肪酸的种类；

(5)计算短链脂肪酸的相对峰面积

按照下列公式计算乳品溶液中短链脂肪酸的相对峰面积：

短链脂肪酸的相对峰面积＝相应的短链脂肪酸峰面积/2-乙基丁酸峰面积。

2.如权利要求1所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，

所述气相条件具体包括：色谱柱DB-FFAP；升温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至180℃，再以70℃/min升至250℃保持3min；进样口温度：250℃；载气为高纯氦；流速：1.0mL/min；分流比为10:1；进样体积：5μL；

所述质谱条件具体包括：EI电子轰击离子源；离子源温度：250℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：4min；采用SIM扫描方式。

3.如权利要求2所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述色谱柱DB-FFAP的规格为30m×0.25mm×0.25μm。

4.如权利要求1至3任一项所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述加入体积V₂的沉淀剂为体积V₁液体样品的1～5倍。

5.如权利要求4所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述加入沉淀剂的体积V₂为体积V₁液体样品的2～4倍。

6.如权利要求5所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述加入沉淀剂的体积V₂为体积V₁液体样品的3倍。

7.如权利要求1所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述沉淀剂为0.5％HCl的乙醇溶液。

8.如权利要求1所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述提取为超声提取。

9.如权利要求1所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述离心条件为14000rpm，8～12min。

10.如权利要求1所述的一种乳品中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，所述过滤方法为0.22μm滤膜过滤。