CN104807772A - 蛭形轮虫分泌物单糖组成的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛭形轮虫分泌物单糖组成的分析方法，其是结合傅里叶变换红外光谱、气相色谱及高效液相色谱法对未知物质进行分析的方法，其包括预先对蛭形轮虫分泌物进行提取、纯化，真空冷冻干燥，再通过傅里叶变换红外光谱对其结构做初步鉴定，然后通过气相和高效液相色谱分别进行分析，通过两者谱图比较分析得出其单糖组分。

Description

蛭形轮虫分泌物单糖组成的分析方法
技术领域
本发明涉及一种蛭形轮虫分泌物单糖组成的分析方法。
背景技术
    微型动物（原生动物和小型的后生动物）在污水生物处理中的有益作用一直备受关注，其作用包括摄食水中悬浮固体、促进细菌絮凝及减少剩余污泥量等，对污水生物处理有重要的指示作用。
    蛭形轮虫（Bdelloid Rotifer）是一种常见的对污水生物处理有益的微型动物，其是一类在基质上（活性污泥、生物膜等表面）附着生活的小型无脊椎动物。蛭形轮虫头部有由纤毛组成的可转动的形如车轮的轮盘，轮盘是轮虫运动和摄食的器官。蛭形轮虫体形微小，长度约100～1000 μm，需在显微镜下才能较好地观察到。
    蛭形轮虫有助于改善污水生物处理性能，如去除水中悬浮颗粒物、提高出水透明度、减少剩余污泥发生量等。根据目前研究，蛭形轮虫在污水生物处理中具有较广阔的应用前景。
不过，迄今为止，对蛭形轮虫在污水生物处理中的作用，基本上是从其摄食或捕食角度来进行研究，而蛭形轮虫的生活习性是靠足底趾内腺体分泌的粘液粘附在活性污泥絮体或生物膜等载体上，头部伸入到水中进行摄食或捕食，并不直接影响其粘附的载体上的微生物。因此，仅用蛭形轮虫的摄食或捕食特性，是难以充分解释其对活性污泥中微生物的活性和群落结构的作用机制；另一种可能的作用机制也许与其分泌物有关，这一点目前尚无文献专利报道。
目前，对于未知物的成分分析研究常用的仪器分析手段有：气相、高效液相、气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振、X射线晶体扫描、原子力显微技术等。仪器分析手段使未知物结构与功能研究取得飞速发展，但由于蛭形轮虫分泌物结构复杂的特点，单一仪器分析手段又具有一定局限性。因此对于蛭形轮虫分泌物的成分分析目前尚无文献专利报道。本方法结合傅里叶变换红外光谱、气相色谱及高效液相色谱分别对蛭形轮虫的分泌物进行分析鉴定，以得到更为精准的结构组成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛭形轮虫分泌物单糖组成的分析方法，其包括傅里叶变换红外光谱、气相色谱及高效液相色谱法对未知物质进行分析的方法。其包括预先对蛭形轮虫分泌物进行提取、纯化，真空冷冻干燥，再通过傅里叶变换红外光谱对其结构做初步鉴定，然后通过气相和高效液相色谱分别分析其单糖组分。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种蛭形轮虫分泌物单糖组分的分析方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.    将经清洁处理过的蛭形轮虫移至无菌去离子水中，使蛭形轮虫密度达到 500～2500 ind/mL，恒温静置30分钟后过滤，并用滤膜过滤去除细菌，收集含有轮虫分泌物的滤液，将该滤液置于真空度等于1.0，温度低于-51℃的条件下进行冷冻干燥处理，得到分泌物的固体样品；
b.    取步骤a所得的固体样品以1∶100（质量比）的比例与KBr混合，充分研磨均匀进行傅里叶变换红外光谱扫描，扫描范围：4000～400 cm-1；扫描次数：32次；分辨率为4 cm-1；说明旋轮虫分泌物的红外光谱表现出一般多糖类物质的特征吸收峰；
c.    将蛭形轮虫分泌物进行水解和衍生化；
d.    将步骤c所得衍生化和水解后的蛭形轮虫分泌物样品进行气相色谱分析，程序升温为：N2流速为 1～2mL/min，H2流速为30～50mL/min，空气的流速为350～450mL/min，进样温度为200～250℃，柱温为80～100℃，持续1～5min,然后以15℃/min升到300℃，持续6min载气流量10～30mL/min检测器温度为340℃，分流比大于等于100：1；
e.    将步骤c所得衍生化和水解后的蛭形轮虫分泌物样品进行高效液相色谱分析，流动相为0.1~1mol/L, pH5~7的乙腈-磷酸盐缓冲液，流速为1.0~3ml/min ，检测波长为200~300nm ，柱温20~50℃，进样量为20ul。
上述的蛭形轮虫的清洁处理方法为：将含有蛭形轮虫的样品经目数大于等于400目的滤网和孔径小于或等于0.45μm的滤膜过滤，再用无菌去离子水洗涤截余物。
上述的步骤c的具体方法为：称取蛭形轮虫分泌物溶于2mol/L三氟乙酸溶液，混合均匀后充入氮气密封，于80～120℃水浴中水解2～12h。
本发明的有益效果为：本发明所述的一种分析蛭形轮虫分泌物单糖组成的方法，通过对蛭形轮虫培养液进行初次过滤，提取蛭形轮虫并过滤杂质，恒温静置一段时间后再次过滤达到去除蛭形轮虫的效果，然后对滤液进行滤膜过滤达到提纯蛭形轮虫分泌物的效果。经过冷冻干燥处理，达到浓缩固化分泌物的效果，便于分析检测。运用傅里叶变换红外光谱扫描，达到检测其多糖成分的效果。通过对蛭形轮虫分泌物进行衍生化和水解处理，再进行气相色谱和高效液相色谱分析，达到测定其单糖成分的效果。根据得到的色谱图中各物质的保留时间和峰面积，可知蛭形轮虫分泌物中的单糖成分及其浓度，从而完成对蛭形轮虫分泌物单糖组成的分析。
附图说明
图1为本发明的分析方法流程图。
图2为本实施示例选用的蛭形轮虫图。
图3为实施示例傅里叶红外光谱仪检测蛭形轮虫分泌物的谱图。
图4为实施示例标准单糖衍生化气相色谱图。
图5为实施示例蛭形轮虫分泌物衍生化气相色谱图。
图6为实施示例标准单糖衍生化高效液色谱图。
图7为实施示例蛭形轮虫分泌物衍生产物化高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明专利的技术方案。
本实施示例中采用的分析方法流程如图1所示，使用的蛭形轮虫为经过续代培养的旋轮虫（见图2）。该种类的旋轮虫分离自上述的污水处理厂的活性污泥，分离后的旋轮虫置于无菌水中并投加作为食物的面粉悬浊液在30℃恒温培养箱中进行续代培养。初次提取旋轮虫之前，用400目尼龙网过滤、截留；用1 L无菌去离子水反复5次冲洗截留在尼龙网上的轮虫，以洗去附在轮虫体表的杂质。将上述经过无菌去离子水冲洗的旋轮虫从尼龙网上转移至无菌去离子水中，使旋轮虫密度达到1000 ind/mL。经过24h恒温静置，用尼龙网过滤掉置于无菌去离子水中的旋轮虫，并用0.45 μm滤膜过滤除掉细菌，收集滤液，该滤液即为含有蛭形轮虫分泌物的溶液。将该溶液置于真空度等于1.0，温度低于-51℃的条件下进行冷冻干燥处理，得到分泌物的固体样品。
将冷冻干燥后得到的固体样品以1∶100（质量比）的比例与KBr混合，充分研磨均匀，将样品在红外灯下进行压片，随后进行傅里叶变换红外光谱（扫描范围：4000～400 cm-1；扫描次数：32次；分辨率为4 cm-1）扫描。得到的详图见图3。说明旋轮虫分泌物的红外光谱表现出一般多糖类物质的特征吸收峰，另外，旋轮虫分泌物中的多糖含β糖苷键，不含α糖苷键，可知旋轮虫分泌物中确实含有多糖。
蛭形轮虫分泌物的水解和衍生化：称取蛭形轮虫分泌物5.0mg，加入1.0mL 2mol/L三氟乙酸溶液，震荡摇匀，置于安剖瓶中，充入氮气后密封，于100℃水浴中水解4h。将水解后的精制蛭形轮虫分泌物，按照标准单糖衍生化方法处理，取0.5μL进样分析。
    将进行衍生化和水解后的蛭形轮虫分泌物样品进行气相色谱分析，程序升温，N2流速为1mL/min，H2流速为40mL/min，空气的流速为400mL/min，进样温度为230℃，柱温为80℃，持续2min,然后以15℃/min升到300℃，持续6min载气流量20mL/min检测器温度为340℃，分流比100：1。将标准单糖的色谱谱图（图4）和衍生化好的蛭形轮虫分泌物色谱谱图（图5）加以对照，以确定多糖溶液中单糖的组成成分，其中图4中谱峰分别为1-鼠李糖、2-阿拉伯糖、3-木糖、4-甘露糖、5-葡萄糖、6-半乳糖、7-内标、8-乳糖，对应图5中各物质保留时间确定蛭形轮虫分泌物含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖及乳糖。
将进行衍生化和水解后的蛭形轮虫分泌物样品进行高效液相色谱分析，其中，色谱柱选用Dikma-C （5um,200mm*4.6mm)，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液( 0.1mol/L,pH6.7)，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，柱温25℃，进样量为20ul。将标准单糖的高效液相色谱谱图（图6）和衍生化好的蛭形轮虫分泌物高效液相色谱谱图（图7）加以对照，以确定多糖溶液中单糖的组成成分。其中图6中谱峰分别为1-甘露糖、2-鼠李糖、3-乳糖、4-葡萄糖、5-半乳糖、6-木糖、7-阿拉伯糖，对应图7中各物质保留时间确定蛭形轮虫分泌物含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖。
    通过傅里叶变换红外光谱、气相色谱及高效液相色谱法对蛭形轮虫分泌物进行分析，说明该物质水解产物含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖及乳糖七种单糖成分。

Claims (3)

1.一种蛭形轮虫分泌物单糖组分的分析方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.    将经清洁处理过的蛭形轮虫移至无菌去离子水中，使蛭形轮虫密度达到 500～2500 ind/mL，恒温静置30分钟后过滤，并用滤膜过滤去除细菌，收集含有轮虫分泌物的滤液，将该滤液置于真空度等于1.0，温度低于-51℃的条件下进行冷冻干燥处理，得到分泌物的固体样品；
b.    取步骤a所得的固体样品以1∶100的质量比与KBr混合，充分研磨均匀进行傅里叶变换红外光谱扫描，扫描范围：4000～400 cm-1；扫描次数：32次；分辨率为4 cm-1；说明旋轮虫分泌物的红外光谱表现出一般多糖类物质的特征吸收峰；
c.    将蛭形轮虫分泌物进行水解和衍生化；
d.    将步骤c所得衍生化和水解后的蛭形轮虫分泌物样品进行气相色谱分析，程序升温为：N2流速为 1～2mL/min，H2流速为30～50mL/min，空气的流速为350～450mL/min，进样温度为200～250℃，柱温为80～100℃，持续1～5min,然后以15℃/min升到300℃，持续6min载气流量10～30mL/min检测器温度为340℃，分流比大于等于100：1；
e.    将步骤c所得衍生化和水解后的蛭形轮虫分泌物样品进行高效液相色谱分析，流动相为0.1~1mol/L, pH5~7的乙腈-磷酸盐缓冲液，流速为1.0~3ml/min ，检测波长为200~300nm ，柱温20~50℃，进样量为20ul。
2.根据权利要求1所述的蛭形轮虫分泌物单糖组分的分析方法，其特征在于所述的蛭形轮虫的清洁处理方法为：将含有蛭形轮虫的样品经目数大于等于400目的滤网和孔径小于或等于0.45μm的滤膜过滤，再用无菌去离子水洗涤截余物。
3.根据权利要求1所述的蛭形轮虫分泌物单糖组分的分析方法，其特征在于所述的步骤c的具体方法为：称取蛭形轮虫分泌物溶于2mol/L三氟乙酸溶液，混合均匀后充入氮气密封，于80～120℃水浴中水解2～12h。
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