CN109061006A

CN109061006A - 一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法

Info

Publication number: CN109061006A
Application number: CN201811147449.5A
Authority: CN
Inventors: 刘佳佳; 戴跃锋; 高畅; 何广文; 汤芬; 康文术
Original assignee: HUNAN YUJIA COSMETICS MANUFACTURING Co Ltd
Current assignee: HUNAN YUJIA COSMETICS MANUFACTURING Co Ltd
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明提供了一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，包括：A)金银花预处理后，与溶剂混合，超声，过滤，得到待测液；B)采用高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱条件为：色谱柱：C18柱；流动相：乙腈∶水＝(28～32):(68～72)；等度洗脱；检测波长：208nm～212nm。本发明通过HPLC‑UV联用的方法，通过选择特定的流动相和控制特定比例和检测波长等参数测定金银花中灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量，该方法简单、快捷、环保，所需仪器普及化高，故可用于金银花皂苷类物质含量测定与质量控制。实验结果表明，本发明方法精密度高、重复性好、稳定性好，加标回收率高，线性关系良好。

Description

一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法。

背景技术

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。金银花自古被誉为清热解毒的良药。我国主要分布于湖南、山东、河南，四川、广西省。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，其中含有的灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙由于结构特殊，具有保肝利胆、抗病原微生物、抗氧化、杀虫、灭螺等功效，特别是灰毡毛忍冬皂苷乙对多种肿瘤细胞均具有较强的杀伤作用，是目前研究的热点之一。

目前文献、专利中对金银花中的灰毡毛忍冬皂苷乙以及川续断皂苷乙含量的检测，由于其独特的化学性质使用的大都是ELSD法即蒸发光散射检测器法检测其含量。现有技术使用的蒸发光散射检测器(ELSD)价格昂贵，一般基层检测单位的高效液相色谱仪常配备的是紫外检测器，因此如果在常规的检测和对药材的质量监测上会造成一定的困难，且蒸发光散射检测过程中产生的废气是有害的，不环保。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，本发明方法简单、快速，检测结果准确。

本发明提供了一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，包括：

A)金银花预处理后，与溶剂混合，超声，过滤，得到待测液；

B)采用高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱条件为：

色谱柱：C18柱；流动相：乙腈：水＝(28～32):(68～72)；等度洗脱；检测波长：208nm～212nm。

优选的，步骤A)所述预处理具体为对金银花采用60～80℃烘干40～60min；粉碎至80目。

优选的，步骤A)所述溶剂为50～55％甲醇水溶液；所述待测液浓度为0.01g/mL。

优选的，步骤A)所述超声功率为250w～350w，超声时间为30～40min；所述过滤为采用0.45μm滤膜过滤。

优选的，步骤B)所述流动相：乙腈：水＝30:70；所述检测波长为210nm。

优选的，所述流动相流速为0.8～1.2mL/min；所述柱温为30℃～35℃；所述进样量为10～20μL。

优选的，所述色谱柱内径4.0mm～4.6mm，柱长150mm～250mm，粒径3.5μm～5μm。

优选的，采用面积百分比法对灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量进行定性分析，采用标准曲线对灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量进行定量检测。

优选的，灰毡毛忍冬皂苷的出峰时间为3.8～4.0min；所述川续断皂苷乙的出峰时间为6.0～6.2min。

优选的，灰毡毛忍冬皂苷乙进样克数在0.0096mg～0.0288mg线性关系良好；川续断皂苷乙进样克数在0.0032mg～0.0096mg线性关系良好。

与现有技术相比，本发明提供了一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，包括：A)金银花预处理后，与溶剂混合，超声，过滤，得到待测液；B)采用高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱条件为：色谱柱：C18柱；流动相：乙腈：水＝(28～32):(68～72)；等度洗脱；检测波长：208nm～212nm。本发明通过HPLC-UV联用的方法，通过选择特定的流动相和控制特定比例和检测波长等参数测定金银花中灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量，该方法简单、快捷、环保，所需仪器普及化高，故可用于金银花皂苷类物质含量测定与质量控制。实验结果表明，本发明方法精密度高、重复性好、稳定性好，加标回收率高，同时灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙在进样克数分别在0.0096mg～0.0288mg；0.0032mg～0.0096mg线性关系良好。

附图说明

图1为本发明实施例1金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱图；

图2为本发明比较例1的金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱图；

图3为本发明比较例2的金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

目前文献、专利中对金银花中的灰毡毛忍冬皂苷乙以及川续断皂苷乙含量的检测，由于其独特的化学性质使用的大都是ELSD法即蒸发光散射检测器法检测其含量。

蒸发光散射检测器(EvaporativeLight-scatteringDetector)是通用型检测器，可以检测没有紫外吸收的有机物质，如人参皂苷、黄芪甲苷等。

而现有技术公开的检测皂苷类似物质的高效液相色谱法往往基线不稳定，杂质峰多，分离度不高，分离效果不好。

本发明人突破了技术惯性，发明了一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱检测方法，不仅检测方法简单，分离效果好，同时检测结果准确。

B)采用高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱条件为：

本发明提供的金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法首先将金银花预处理。

本发明对于所述金银花的来源不进行限定，市售即可。

本发明所有试剂均为分析纯或色谱纯，均为市售。

本发明所述预处理具体为将金银花烘干、粉碎处理。

本发明优选对金银花采用60～80℃烘干40～60min；粉碎至80目。本发明对于所述烘干和粉碎的具体方式不进行限定，采用烘箱烘干、粉碎机粉碎即可。

预处理后置于密封容器中，加入溶剂超声，放冷称重，加溶剂补足重量，摇匀过滤，得到待测液。

本发明对于溶剂的具体选择不进行限定，能够溶解灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙即可，本发明经过研究发现，甲醇水溶液；特别是50％～55％甲醇水溶液效果好；本发明所述溶剂更优选为50％～53％甲醇水溶液；最优选为50％甲醇水溶液。采用上述水溶液可以更好的浸提本发明待测样品。

本发明对于所述超声的具体方式不进行限定，本领域技术人员熟知的即可；所述超声功率优选为250w～350w，更优选为300w～350w，最优选为300w～320w，最最优选为300w；所述超声时间优选为30～40min；更优选为35～40min；最优选为40min。

超声后放冷称重，本发明所述放冷为自然冷却。加溶剂补足重量为确保待测液浓度，本发明所述待测液浓度优选为0.01g/mL。上述浓度能保证溶解完全。

本发明所述过滤优选为采用0.45μm滤膜过滤。

过滤后得到待测液。

采用高效液相色谱法对待测液进行检测。色谱条件为：

色谱柱：C18柱；所述色谱柱内径优选4.0mm～4.6mm，更优选为4.3mm～4.6mm，最优选为4.6mm；柱长优选150mm～250mm，更优选为200mm～250mm，最优选为250mm，所述粒径优选为3.5μm～5μm；更优选为4μm～5μm；最优选为5μm。

一些实施例中，所述色谱柱的尺寸为4.0mm×250mm、4.6mm×100mm、4.6mm×150mm、4.6mm×200mm、4.6mm×250mm。

本发明所述流动相：乙腈：水＝(28～32):(68～72)；优选为乙腈：水＝(29～31):(69～71)；更优选为乙腈：水＝30:70。

在本发明的一些实施例中，所述流动相：乙腈：水＝28:72；

在本发明的一些实施例中，所述流动相：乙腈：水＝29:71；

在本发明的一些实施例中，所述流动相：乙腈：水＝31:69；

在本发明的一些实施例中，所述流动相：乙腈：水＝32:68。

本发明无需添加磷酸或醋酸等修饰峰形状，通过上述分析检测条件选择即可使得峰型好，分离效果好，分离度高。

本发明上述流动相采用等度洗脱；相比于梯度洗脱，不仅效果好，同时方法简单。

检测波长：208nm～212nm；优选为：209nm～211nm；更优选为210nm。

本发明所述柱温为30℃～35℃；更优选为30℃～33℃；最优选为30℃～32℃；最最优选为30℃；

本发明所述流动相流速优选为0.8～1.2mL/min；更优选为0.9～1.1mL/min；最优选为1mL/min；

本发明所述进样量优选为10～20μL；更优选为15～20μL；最优选为20μL。

在本发明的一些实施例中，色谱条件为：

色谱柱：C18柱；4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相：乙腈：水＝30:70；等度洗脱；检测波长：210nm；柱温为30℃；进样量优选为20μL；流动相流速优选为1mL/min；

在本发明的一些实施例中，色谱条件为：

色谱柱：C18柱；4.6mm×200mm，粒径5μm；流动相：乙腈：水＝31:69；等度洗脱；检测波长：212nm；柱温为32℃；进样量优选为20μL；流动相流速优选为0.8mL/min；

在本发明的一些实施例中，色谱条件为：

色谱柱：C18柱；4.6mm×200mm，粒径5μm；流动相：乙腈：水＝29:71；等度洗脱；检测波长：210nm；柱温为35℃；进样量优选为15μL；流动相流速优选为1.1mL/min。

本发明采用面积百分比法对灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量进行定性分析，

采用标准曲线对灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量进行定量检测。

本发明对于灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙标准品的来源不进行限定，市售即可；本发明优选采用50％甲醇溶解标准品溶液。

本发明所述灰毡毛忍冬皂苷乙标准品储备液的浓度优选为60μg/mL；所述川续断皂苷乙储备液的浓度优选为20μg/mL。

本发明灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的回归方程分别为：y＝2234.4x+6.9722，r＝0.9978；y＝3083.9x+7.5978，r＝0.9964。表明灰毡毛忍冬皂苷乙进样克数在0.0096mg～0.0288mg线性关系良好；川续断皂苷乙进样克数在0.0032mg～0.0096mg线性关系良好。

本发明，灰毡毛忍冬皂苷的出峰时间为3.8～4.0min；所述川续断皂苷乙的出峰时间为6.0～6.2min。

本发明对于所述高效液相色谱仪的型号和规格不进行限定，可以为安捷伦高效液相色谱仪。

本发明提供了一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，包括：A)金银花预处理后，与溶剂混合，超声，过滤，得到待测液；B)采用高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱条件为：色谱柱：C18柱；流动相：乙腈：水＝(28～32):(68～72)；等度洗脱；检测波长：208nm～212nm。本发明通过HPLC-UV联用的方法，通过选择特定的流动相和控制特定比例和检测波长等参数测定金银花中灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量，该方法简单、快捷、环保，所需仪器普及化高，故可用于金银花皂苷类物质含量测定与质量控制。实验结果表明，本发明方法精密度高、重复性好、稳定性好，加标回收率高，同时灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙在进样克数分别在0.0096mg～0.0288mg；0.0032mg～0.0096mg线性关系良好。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法进行详细描述。

实施例1

(1)采用高效液相色谱法进行分析测定，色谱条件为：色谱柱：C18柱；4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相：乙腈：水＝30:70；等度洗脱；检测波长：210nm；柱温为30℃；进样量优选为20μL；流动相流速优选为1mL/min；

(2)对照品溶液的制备：

称取适量的灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙标准品加入50％甲醇配成含有60微克/ml灰毡毛忍冬皂苷乙和20微克/ml川续断皂苷乙的混合溶液

(3)供试品溶液的制备：

将70℃烘干60min处理后的金银花粉碎目，处理后，取粉末0.5g置于具塞锥形瓶，精密加入50％甲醇50ml，称重。超声处理(300w/40khz)40min，放冷称重，加50％甲醇补足至原重量，摇匀过滤，取滤液备用。

检测结果如图1所示，图1为本发明实施例1金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱图。其中，3.9min出的峰为灰毡毛忍冬皂苷，6.1min出的峰为川续断皂苷乙。

实施例2线性关系的考察

精密吸取4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml、12.0ml灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙标准混合对照品分别置五个25ml的棕色容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度。按以上的色谱条件测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的峰面积，分别以峰面积为纵坐标，进样克数为横坐标，绘制标准曲线。求得灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的回归方程分别为：y＝2234.4x+6.9722，r＝0.9978；y＝3083.9x+7.5978，r＝0.9964。表明灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙在进样克数分别在0.0096mg～0.0288mg；0.0032mg～0.0096mg线性关系良好。结果如表1和表2所示，其中表1为灰毡毛忍冬皂苷乙的线性关系结果，表2为川续断皂苷乙的线性关系结果。

表1灰毡毛忍冬皂苷乙

进样克数(mg)	峰面积
		0.0096	27.60675
0.0144	40.29417
		0.0192	50.12958
0.024	59.91185
		0.0288	71.42426

表2川续断皂苷乙

进样克数(mg)	峰面积
		0.0032	16.9064
0.0048	22.8008
		0.0064	27.8642
0.008	32.25078
		0.0096	36.85288

实施例3精密度实验

取灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品溶液按实施例1的色谱条件，连续进样6次，每次进样20μl。灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD(n＝6)值分别为0.66％和0.71％，表明仪器分析的精密度良好。结果如表3和表4所示，其中表3为灰毡毛忍冬皂苷乙的精密度结果，表4为川续断皂苷乙的精密度结果。

表3灰毡毛忍冬皂苷乙

表4川续断皂苷乙

实施例4重复性实验

取同一金银花样品按照所述方法制备供试液，共6份，按照以上色谱条件进行含量测定，每次进样20μl。灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD(n＝6)值分别为1.89％和1.60％，表明仪器分析的重复性良好。结果如表5和表6所示，其中表5为灰毡毛忍冬皂苷乙的重复性结果，表6为川续断皂苷乙的重复性结果。

表5灰毡毛忍冬皂苷乙

表6川续断皂苷乙

实施例5稳定性实验

取金银花样品制备供试液，按照以上色谱条件于0、2、4、8、12、24h分别进样20μl。灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD(n＝6)值分别为1.97％和1.45％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。结果如表7和表8所示，其中表7为灰毡毛忍冬皂苷乙的重复性结果，表8为川续断皂苷乙的重复性结果。

表7灰毡毛忍冬皂苷乙

表8川续断皂苷乙

实施例6加样回收率实验

其中表9为灰毡毛忍冬皂苷乙加样回收率实验，表10为川续断皂苷乙加样回收率实验。

表9

表10

比较例1

采用与本发明实施例1的相同处理，不同在于色谱条件不同，具体为：色谱柱：C18柱；4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相为添加0.5％的冰醋酸乙腈溶液；梯度洗脱程序如下：

	0.5％冰醋酸	乙腈
			0～10min	88.5～85	11.5～15
10～12min	85～71	15～29

检测波长：210nm；柱温为30℃；进样量优选为20μL；流动相流速优选为1mL/min；检测结果如图2所示，图2为本发明比较例1的金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱图。由图2可以看出该流动相条件下全图呈震荡波纹状，影响被检测物质的检测，分离度、基线稳定性差。

比较例2

采用与本发明实施例1的相同处理，不同在于色谱条件不同，具体为：色谱柱：C18柱；4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相为乙腈-水溶液；梯度洗脱程序如下：

	水	乙腈
			0～10min	88.5～85	11.5～15
10～12min	85～71	15～29
			12～18min	71～67	29～33
18～30min	67～55	33～45
			10～12min	85～71	15～29

检测波长：210nm；柱温为30℃；进样量优选为20μL；流动相流速优选为1mL/min；检测结果如图3所示，图3为本发明比较例2的金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的高效液相色谱图。由图3可以看出样品峰已经有响应信号，但周围杂峰较多，且波形不稳易浮动，检测结果差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种金银花中灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量的检测方法，包括：

B)采用高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱条件为：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述预处理具体为对金银花采用60～80℃烘干40～60min；粉碎至80目。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述溶剂为50～55％甲醇水溶液；所述待测液浓度为0.01g/mL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述超声功率为250w～350w，超声时间为30～40min；所述过滤为采用0.45μm滤膜过滤。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)所述流动相：乙腈：水＝30:70；所述检测波长为210nm。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.8～1.2mL/min；所述柱温为30℃～35℃；所述进样量为10～20μL。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱内径4.0mm～4.6mm，柱长150mm～250mm，粒径3.5μm～5μm。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用面积百分比法对灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量进行定性分析，采用标准曲线对灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷乙含量进行定量检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，灰毡毛忍冬皂苷的出峰时间为3.8～4.0min；所述川续断皂苷乙的出峰时间为6.0～6.2min。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，灰毡毛忍冬皂苷乙进样克数在0.0096mg～0.0288mg线性关系良好；川续断皂苷乙进样克数在0.0032mg～0.0096mg线性关系良好。