CN104805043A - 一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法；公开了干酪乳杆菌群菌毛亚基FimI在活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数中的应用。具体是通过大肠杆菌表达系统获得干酪乳杆菌群的菌毛亚基FimI，重组FimI用镍柱纯化后免疫小鼠获得多克隆抗体；将含有鼠李糖乳杆菌样品按常规处理后进行MRS平板涂布，厌氧培养；以硝化纤维膜为固相载体进行菌落转印，转印膜通过干燥固定、脱脂乳封闭、洗涤、加抗体孵育后用DAB显色；根据膜上出现的斑点对样品中的活性鼠李糖乳杆菌进行计数，并通过斑点位置实现鼠李糖乳杆菌快速分离。本发明方法操作简便有效，便于推广使用，适合益生菌产品中鼠李糖乳杆菌的分离鉴定及其质量评价使用。

Description

一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种能够特异性识别鼠李糖乳杆菌表面蛋白的抗体以及益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离和计数方法。

背景技术

益生菌(probiotics)是指通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物制剂，具有改善肠道菌群结构，抑制病原菌，生成营养物质，提高机体免疫力，消除致癌因子，降低胆固醇和血压，改善乳糖消化性等功能。益生菌产品种类繁多，包括含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、乳酸菌饮料、酸豆奶及含多种益生菌的口服液、片剂、胶囊、粉末剂等，但由于市场不健全以及发酵乳生产厂家设备条件和技术水平千差万别，益生菌产品质量参差不齐，许多产品仍然存在着质量问题，如活菌数不达标，产品种属标签与产品中实际的菌种不符等。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是目前公认的益生性乳杆菌，具有保持肠道微生态平衡，抑制有害细菌生长，消除过敏等生理功能。传统发酵食品和益生菌制剂是补充益生菌良好的来源和载体。随着益生菌的深入研究，从传统发酵食品中分离鼠李糖乳杆菌用以研制新型益生菌制品已成为功能食品科研开发的热点，另一方面准确测定产品中鼠李糖乳杆菌及其活菌数量是评估益生菌制剂质量与功效的主要依据。但目前在复杂菌群体系中定量检测和鉴定鼠李糖乳杆菌的有效活菌数仍缺乏科学、合理、快速的方法。传统方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，并且检测效率有限，而现有的选择性培养基技术需要添加选择性抑制因子，灵敏度不高，基于PCR技术的分子学方法虽然具有较高的灵敏度，但是不能区分样品中的活菌和死菌。因此迫切需要建立适合复杂体系中鼠李糖乳杆菌优良菌株分离筛选以及活菌计数的新方法。免疫分析法快速、特异、并且操作简单，为评价益生菌产品、筛选理想菌株、跟踪复杂生态系统中的益生菌提供了高效、廉价的工具。但由于鼠李糖乳杆菌特异性靶抗原研究不多，目前尚没有鼠李糖乳杆菌特异性抗体及相关免疫检测法，应用菌落免疫印迹快速鉴定和计数活性鼠李糖乳杆菌的方法国内外未见相关报道。

发明内容

本发明内容主要包括干酪乳杆菌群表面蛋白FimI抗体的制备和活性鼠李糖乳杆菌的快速鉴定和计数方法。干酪乳杆菌群(Lactobacillus casei group)乳酸杆菌包括高度相似的三个种：干酪乳杆菌；副干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌。菌毛亚基FimI是三种菌共有，但是只有鼠李糖乳杆菌的FimI是在细胞壁上，可以用FimI抗体建立方法来快速分离与鉴定鼠李糖乳杆菌,并且与其它两种乳杆菌区分开来。

本发明公开了干酪乳杆菌群菌毛亚基FimI在活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数中的应用。

本发明通过大肠杆菌表达系统获得干酪乳杆菌群的菌毛亚基FimI，重组FimI用镍柱纯化后免疫小鼠获得多克隆抗体；将含有鼠李糖乳杆菌样品按常规处理后进行MRS平板涂布，37℃厌氧培养36h；以硝化纤维膜为固相载体进行菌落转印，转印膜通过干燥固定、脱脂乳封闭、洗涤、加抗体孵育后用DAB显色；根据膜上出现明显斑点对样品中的活性鼠李糖乳杆菌进行计数，同时通过斑点位置实现鼠李糖乳杆菌快速分离。该方法还能够快速区分鼠李糖乳杆菌与遗传生理生化特征极为相近的干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌。本发明方法操作简便有效，便于推广使用，适合于含有鼠李糖乳杆菌的益生菌产品的质量和功能评价使用，具有极好的应用前景。

本发明提供一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法，其步骤包括：1)干酪乳杆菌群特异性菌毛亚基FimI为靶抗原制备多克隆抗体；作为鼠李糖乳杆菌检测抗体；

2)利用检测抗体采用菌落免疫印迹法检测和定量样品中中的鼠李糖乳杆菌；

3)菌落免疫印迹结合MRS平板计数对样品中鼠李糖乳杆菌进行定量检测。

具体包括以下步骤：

(1)FimI目的基因扩增：根据干酪乳杆菌菌毛蛋白亚基FimI核苷酸序列设计一对特异性引物，上游引物16F1序列：5’-cccaagcttgatgaaaaagacaattgccaag-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物16R1序列：5’-aagctcgagttagaaaccattgcggcgc-3’(SEQ ID NO.2)，并在上下游引物引入Hind III和Xho I限制性内切酶酶切位点。用已知的改良CTAB法提取乳酸菌基因组DNA，以基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，35次循环；72℃延伸10min。反应结束后，取10μL产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后在凝胶系统上观察结果。

(2)重组表达载体的构建：PCR扩增产物纯化回收后与Easy载体连接构建pGEMT-fimI，转化E.coli DH5α，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆，并进行酶切和测序鉴定。用HindIII+XhoI分别双酶切pGEMT-fimI质粒和pET28a-SUMO载体质粒，试剂盒回收目的片段，将载体和目的基因FimI用T4DNA连接酶连接，16℃连接过夜，产物转化至E.coli DH5α，卡那霉素抗性筛选阳性转化子，并进行PCR和酶切鉴定。将构建的重组质粒pET28a-SUMO-fimI转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，卡那霉素LB平板筛选阳性克隆并进行PCR和酶切鉴定，获得的阳性克隆命名为E.coli BL21-fimI。

(3)FimI蛋白的表达与鉴定：将E.coli BL21-fimI接种于10mL含卡那霉素(含100μg/mL卡那霉素)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按照2％的接种量接入50mL TB培养液(含100μg/mL Kana)中，37℃，200rpm培养至OD600值达到0.6～0.8，加入终浓度分别为0.10mmol/L的IPTG诱导培养5h，离心收集菌体加入等体积PBS重悬，超声破碎细菌，收集包涵体应用Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行分离纯化。将溶解的包涵体加到Ni-NTA层析柱，流速控制在0.5mL/min。用10～20倍NTA体积平衡缓冲液洗(直至无蛋白流出)，流速控制在1mL/min左右。分别用10倍NTA体积洗脱缓冲液梯度洗脱，收集穿透液，SDS-PAGE分析重组蛋白，割取SDS-PAGE凝胶上的目的条带，送至生物公司进行质谱鉴定。

(4)重组FimI蛋白多克隆抗体的制备：将健康BALB/c小鼠在新环境下预养一周后进行眼眶采血，分离血清作为抗血清效价检测时的阴性对照。以浓度为0.1mg/mL的重组蛋白作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，初次免疫剂量为0.05mg/只，对实验小鼠进行腹部皮下多点注射；2周后进行第1次加强免疫(抗原量为初次免疫的1/2)，此后每隔1周加强免疫1次，共3次；最后一次加强免疫完成5d后，对实验小鼠进行眼球取血。将收集的血液于4℃放置2h，以3000rpm的转速离心10min，收集抗血清，-20℃保存。

(5)斑点免疫印迹方法的建立不同乳酸菌接种至MRS培养基，37℃厌氧培养36h，4000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，PBS重悬菌体，调整菌体浓度为OD₆₀₀＝1.0。剪取适当大小的硝酸纤维素膜，于去离子水中浸泡10min，37℃干燥10min；分别将10μL菌悬液点于膜上，37℃干燥15min；加入5％的脱脂乳，室温封闭1h；取出后用PBST洗涤3次，加入适当稀释度的FimI抗血清(1:1000)，室温孵育1h；洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000稀释)，孵育1h；洗涤3次，将膜浸入新配制的DAB显色液中，避光反应10min，膜上出现明显斑点后，用去离子水漂洗2次终止反应，将膜置于干净滤纸上自然干燥。

(6)菌落斑点免疫印迹法快速定量检测样品中的鼠李糖乳杆菌：将鼠李糖乳杆菌和其他菌种等比例混合，用生理盐水梯度稀释，涂布MRS平板，37℃厌氧培养36h。剪取与培养皿内径大小相同的硝酸纤维素膜，于去离子中浸泡10min，37℃干燥10min，将干燥后的硝酸纤维素膜放置于培养基表面，使膜与培养基表面菌落充分接触，静置5min后将膜揭下，37℃干燥30min，膜的封闭、一抗反应、二抗反应及显色程序同斑点免疫印迹法。根据转印膜上的斑点数计算鼠李糖乳杆菌数，并根据斑点位置挑取克隆进一步确证。

本发明的有益效果是：

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是目前公认的益生性乳杆菌，但是益生菌产品种类繁多，包括含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、乳酸菌饮料、酸豆奶及含多种益生菌的口服液、片剂、胶囊、粉末剂等，但由于食品市场的不健全，生产厂家设备条件和技术水平千差万别，质量参差不齐，许多产品仍然存在着一些质量问题，如活菌数不达标以及种属标识不符等。本发明通过大肠杆菌重组表达抗原和小鼠免疫获得了鼠李糖乳杆菌表面蛋白FimI的特异性抗体，应用该抗体免疫印迹方法结合常规MRS平板计数方法建立了菌落免疫印迹技术，该技术能够应用于复杂微生态体系中鼠李糖乳杆菌的快速精确的计数与分离。

干酪乳杆菌群的种属包括遗传和生理生化特征极为相近的干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌以及鼠李糖乳杆菌，用常规的鉴定方法费时耗力，而且准确度有限。本发明还能够快速精确的区分鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌，可应用与优良益生菌菌种的筛选和鉴定。

附图说明

图1：应用FimI抗体建立斑点免疫印迹法对鼠李糖乳杆菌鉴定。

图2：应用FimI抗体建立菌落免疫印迹法对菌种混合体系中的鼠李糖乳杆菌的计数。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

实施例1 乳酸菌菌毛蛋白亚基FimI基因的克隆、表达及纯化

载体pET28a-SUMO构建：

应用引物SUMO-f：5’-CGCGGATCCGAATGTCGGACTCAGAAGTCAA-3’(SEQ ID NO.3)和SUMO-r：5’-CCCAAGCTTGCACCACCAATCTGTTCTCTGT-3’(SEQ ID NO.4)通过PCR从酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组中扩增出SUMO基因片段,用BamHI和HindIII双酶切后，连接到商业化质粒载体pET28a(Novagen公司)BamHI/HindIII位点，形成表达质粒命名为pET28a-SUMO。

根据GenBank中登录的干酪乳杆菌BL23菌毛亚基编码序列设计一对含有HindIII和XhoI限制性内切酶酶切位点的引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。用改良CTAB法提取干酪乳杆菌BL23基因组DNA，应用PCR方法扩增fimI基因(SEQ ID NO.1和No.2)，扩增产物大小为1005bp。PCR扩增产物纯化回收后连入载体Easy(promega公司产品)形成pGEMT-fimI质粒。用HindIII+XhoI分别双酶切pGEMT-fimI质粒和pET28a-SUMO载体质粒，试剂盒回收目的片段，并将酶切回收的载体和FimI目的基因用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，卡那霉素抗性筛选，挑取阳性转化子进行PCR和酶切鉴定。将已构建的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，用含有卡那霉素的LB平板筛选，获得阳性克隆命名为E.coli BL21-fim I。将E.coli BL21-fim I接种于10mL含卡那霉素(含100μg/mL卡那霉素)的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；次日按照2％的接种量接入50mL TB培养液(含100μg/mL Kana)中，37℃，200rpm培养至OD600值达到0.6～0.8，加入终浓度分别为0.10mmol/L的IPTG，30℃，200rpm培养5h，离心收集菌体沉淀加入等体积PBS重悬，超声破碎细菌(300w工作2s，间歇4s，400次)，5000rpm离心10min，收集包涵体溶解后，通过Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行分离纯化，收集重组蛋白。

PCR扩增结果显示在1000bp处出现特异性条带，将目的基因与载体pET28a-SUMO连接构建原核表达载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对阳性克隆进行PCR、限制性酶切分析，结果显示FimI目的基因已插入到表达载体中，序列测定所得拼接结果与已发表的干酪乳杆菌群菌毛蛋白亚基FimI核苷酸序列99％相似。将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，加入0.04mmol/L IPTG、37℃诱导2h后蛋白表达量最高，并且以包涵体的形式存在。包涵体蛋白用盐酸胍溶解后过Ni-NTA层析柱纯化，对咪唑洗脱缓冲液的穿透液进行SDS-PAGE分析，但导入空载体的菌株其洗脱液中未出现目的条带；导入重组载体的菌株在200和250mmol/L咪唑洗脱液中出现重组蛋白，于45K～66.2K之间有两个分子量大小不同的条带。经质谱鉴定，两条蛋白均为干酪乳杆菌群菌毛蛋白亚基。

实施例2 重组FimI蛋白多克隆抗体的制备

健康BALB/c小鼠在新环境下预养一周后进行眼眶采血，分离血清作为抗血清效价检测时的阴性对照。以浓度为0.1mg/mL的重组蛋白作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，初次免疫剂量为0.05mg/只，对实验小鼠进行腹部皮下多点注射；2周后进行第1次加强免疫(抗原量为初次免疫的1/2)，此后每隔1周加强免疫1次，共3次；最后一次加强免疫完成5d后，对实验小鼠进行眼球取血。将收集的血液于4℃放置2h，以3000rpm的转速离心10min，收集抗血清，-20℃保存。结果获得了干酪乳杆菌群菌毛蛋白亚基FimI的抗血清，血清效价高于1：25600，血清能够与干酪乳杆菌群菌株的可溶性蛋白反应，但只能与鼠李糖乳杆菌的全细胞反应，与不同种属的其他菌株无交叉反应。

实施例3 全菌斑点免疫印迹法检测鼠李糖乳杆菌

将乳酸菌接种至MRS肉汤，37℃厌氧培养36h，4000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，PBS重悬菌体，调整菌体浓度为OD₆₀₀＝1.0。以适当浓度的菌悬液点样于硝酸纤维素膜上，用PBST将抗血清稀释为1:250、1:500、1:1000、1:2000。37℃干燥15min；加入5％的脱脂乳，室温封闭1h；取出后用PBST洗涤3次，加入适当稀释度的抗血清，室温孵育1h；洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000稀释)，孵育1h；洗涤3次，将膜浸入到新配制的DAB显色液中，避光显色10min，用去离子水漂洗2次终止反应。

结果如图1。图1中A、B、C、D分别使用1:250、1:500、1:1000、1:2000稀释的抗血清；编号1-16依次为纯化重组蛋白、类布氏乳杆菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌、食品乳杆菌、戊糖乳杆菌、肠膜明串珠菌、棒状乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、融合乳杆菌、乳酸乳球菌、PBS。A抗血清稀释度为1:250，棒状乳杆菌、发酵乳杆菌能显现出清晰的灰色斑点，干酪乳杆菌有微弱的斑点印迹，随着抗血清稀释度增加斑点颜色逐渐变浅；C抗血清稀释度为1:1000时，这3种乳酸菌均未显现出清晰斑点；在4种不同稀释度的抗血清作用下，鼠李糖乳杆菌均能显现出清晰的黑色斑点，因此1:1000抗血清稀释度作为最佳工作浓度。

实施例4 菌落斑点免疫印迹法快速定量检测样品中的鼠李糖乳杆菌

将鼠李糖乳杆菌及其它乳酸菌的混合物用生理盐水梯度稀释，分别涂布MRS平板，37℃厌氧培养36h。剪取与培养皿内径大小相同的硝酸纤维素膜，于去离子中浸泡10min，37℃干燥10min，将干燥后的硝酸纤维素膜放置于培养基表面，使膜与培养基表面菌体充分接触，静置5min取膜，37℃干燥30min，以1:1000的FimI抗血清进行原位斑点免疫印迹，

结果如图2。图中A为涂布鼠李糖乳杆菌的MRS平板及其A2为原位斑点免疫印迹试验显色后的硝酸纤维素膜，膜上显现出清晰的小黑点，与MRS平板上的菌落一一对应，表明MRS上的鼠李糖乳杆菌菌落可以100％产生阳性信号，B为干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌混合物及其转印硝酸纤维素膜，未出现阳性信号；C为15种乳酸菌混合物及其转印硝酸纤维素膜，未出现阳性信号；D为鼠李糖乳杆菌的混合物，结果其中的鼠李糖乳杆菌在转印硝酸纤维素膜上产生阳性信号。7个阳性菌落挑取后进行16S rDNA测序鉴定，结果均为鼠李糖乳杆菌。与其他方法相比，具有较高的敏感性和重复性，操作方便廉价。

Claims (5)

1.干酪乳杆菌群菌毛亚基FimI在活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，大肠杆菌表达系统获得干酪乳杆菌群的菌毛亚基FimI，重组FimI用镍柱纯化后免疫小鼠获得多克隆抗体；将含有鼠李糖乳杆菌样品按常规处理后进行MRS平板涂布，37℃厌氧培养36h；以硝化纤维膜为固相载体进行菌落转印，转印膜通过干燥固定、脱脂乳封闭、洗涤、加抗体孵育后用DAB显色；根据膜上出现明显斑点对样品中的活性鼠李糖乳杆菌进行计数，同时通过斑点位置实现鼠李糖乳杆菌快速分离。

3.一种益生菌产品中活性鼠李糖乳杆菌快速分离与计数方法，其步骤包括：

1)干酪乳杆菌群特异性菌毛亚基FimI为靶抗原制备多克隆抗体；作为鼠李糖乳杆菌检测抗体；

2)利用检测抗体采用菌落免疫印迹法检测和定量样品中中的鼠李糖乳杆菌；

3)菌落免疫印迹结合MRS平板计数对样品中鼠李糖乳杆菌进行定量检测。

4.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于步骤2)中，以硝酸纤维素膜为固相载体，菌落细胞作为固相抗原进行斑点免疫印迹分析。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中，MRS平板计数与菌落斑点免疫印迹结合，定量检测样品中的鼠李糖乳杆菌活菌数。