CN104800255A - 紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体涉及紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用，该紫椴花提取物由紫椴花经70%的乙醇提取后采用乙酸乙酯萃取可得到粗品提取物，采用硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇混合溶液梯度洗脱，收集体积比15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液所得洗脱液回收溶剂可得纯化提取物。紫椴花纯化提取物经ODS柱色谱分离，采用50%甲醇水溶液洗脱得两个单体化合物，经NMR鉴定分别为银锻苷和紫云英苷；其中银锻苷为活性成分，所述纯化提取物经HPLC分析，银锻苷的质量含量为31.7%。动物实验表明，本发明的紫椴花提取物具有显著的抗失眠作用，且量效关系研究显示无显著剂量依赖性，不易成瘾，安全性高于目前常用的化学药物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用。
背景技术
失眠是指无法入睡或无法保持睡眠状态，导致的睡眠不足，也称为入睡和维持睡眠障碍，为各种原因引起的入睡困难、睡眠深度或频度过短、早醒及睡眠时间不足或质量差等现象，是一种常见病。
根据2002年全球睡眠调查的结果，我国失眠的发生率高达45.4%。失眠症是当今社会人们普遍存在的痛苦之一，是除疼痛以外最常见的临床症状。据预测，到21世纪中叶，美国失眠人数将达到1亿人。世界卫生组织对14个国家15个基地的25916例在基层医疗机构就诊患者的调查结果显示，27%的人有睡眠问题，而且被诊断为失眠症的患者接近实际患病人数的一半。近年来，随着社会生活节奏的加快和工作生活压力的加大等诸多因素变化，全球失眠发病率呈持续升高趋势，与此同时，失眠常常伴随抑郁等其他临床精神疾病的发生，给社会和个人带来极大的经济和精神负担。
目前临床用于治疗失眠症的化学药物包括苯二氮卓类药物、米氮平、佐匹克隆等。上述药物均通过对中枢神经系统的抑制和调节发挥抗失眠作用。此类中枢神经系统调节药物属于精神管制药物，易于成瘾，长期服用患者易于产生耐受性，疗效逐渐降低，使患者不得不逐渐提高剂量以维持药效。此类药物往往通过精神抑制作用发挥抗失眠效果，因此往往容易导致抑郁等其他疾病，均不宜长期使用。
紫椴是椴树科椴树属植物在我国特有的亚种，主要分布在我国长白山地区，在我国远古时期就把紫椴的树皮和根皮用于治疗筋无力、慢性咳嗽、关节炎、风湿等疾病，为民间常用药材。据《中华本草》记载，紫椴花有清热解表之功效，主治感冒、发热、肾盂肾炎、口腔炎和喉炎等。
目前国内外对紫椴药理活性进行研究的主要为黑龙江中医药大学和东北林业大学相关研究人员。2014年王婧杰等公开了紫椴花多糖的抗氧化活性（王婧杰,陈玉霞,穆立蔷. 紫椴花多糖的微波提取及体外抗氧化活性.食品与生物技术学报. 2014; 33(3): 321-329.）；2013年马微微等公开了紫椴花提取物的体外抗菌活性（马微微,王军,穆立蔷. 紫椴花提取物体外抗菌活性.东北林业大学学报. 2013;49(9): 127-128.）；2012-2013年马微微等公开了紫椴花的抗炎镇痛作用（马微微,王振月,刘奂,穆立蔷. 紫椴花抗炎镇痛作用有效部位的研究.中医药信息; 2013(3) 22-24. 马微微,王振月,李足意,穆立蔷. 紫椴花乙醇提取物抗炎镇痛的实验研究.时珍国医国药. 2012;23(1): 135-136.）
截止目前，国内外尚未见关于紫椴花提取物催眠活性的相关报道，亦无文献公开紫椴花催眠活性相关的有效部位及其提取工艺。
发明内容
在针对上述现有技术，本发明的目的是提供紫椴花提取物的一种新的用途。具体地说是紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用。
为实现上述的目的，本发明采用的技术方案为：
紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用，所述紫椴花提取物的制备方法至少包括以下步骤：
1）取干燥的紫椴花，加入浓度为70%的乙醇浸泡，回流提取，得紫椴花乙醇提取液；
2）将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末；
3）将步骤2）所得粉末用水混悬，加入乙酸乙酯进行液液萃取，得乙酸乙酯萃取液；
4）将步骤3）所得乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯，即得具有抗失眠作用的紫椴花粗品提取物。
作为本发明技术方案的进一步优化，所述紫椴花提取物的制备方法中，步骤1）中乙醇的用量按照料液比计算为1:（5～20），乙醇浸泡的时间为10～18小时，回流提取的温度为79℃～85℃，回流提取的次数为1～4次，每次回流提取的时间为1～3小时。
作为本发明技术方案的进一步优化，所述紫椴花提取物的制备方法中，步骤1）中乙醇的用量按照料液比计算为1:10，乙醇浸泡的时间为12小时，回流提取的温度为80℃，回流提取的次数为3次，每次回流提取的时间为2小时。
作为本发明技术方案的进一步优化，所述紫椴花提取物的制备方法还包括如下附加步骤：
5）将步骤4）所得产物60℃水浴蒸干，得干膏，粉碎后过200目筛得粉末；
6）将步骤5）所得粉末用甲醇溶解后上硅胶柱，以体积比分别为8:1、15:1、30:1、50:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液进行梯度洗脱，收集体积比15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液所得洗脱液，上硅胶柱色谱，以体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱，收集洗脱液回收溶剂，即得紫椴花纯化提取物。
上述紫椴花纯化提取物经ODS柱色谱分离，采用50%甲醇水溶液洗脱得到两个单体化合物，经1H-NMR和13C-NMR鉴定分别为银锻苷和紫云英苷。
上述紫椴花纯化提取物经HPLC分析，银锻苷的质量含量为31.7%。
上述紫椴花纯化提取物的主要活性成分为银椴苷。
上述制备方法中步骤1）至4）可以获得紫椴花中对失眠症具有治疗作用的粗品提取物，步骤5）至6）通过粗品提取物的进一步分离纯化获得紫椴花中对失眠症具有治疗作用的进一步纯化的提取物。利用失眠动物模型进行的动物实验研究表明：
上述制备方法获得紫椴花粗品提取物经口灌胃给药对失眠动物模型具有显著的改善睡眠作用；上述制备方法获得的紫椴花进一步纯化的提取物对失眠动物模型也具有显著的改善睡眠作用，且能够通过更小的给药体积和给药剂量实现发挥更高的药效。
对于本领域技术人员而言，天然药物活性成分提取工艺的参数主要涉及提取工艺的选择（如水提醇沉、醇提水沉、回流提取等）、提取溶剂的选择、提取溶剂的用量、浸泡时间的长短、回流提取的温度和次数等，其中回流提取的温度与所选溶剂的沸点直接相关，在提取溶剂及浓度一定且主要活性成分已知的前提下，浸泡时间的长短、回流提取的次数等参数可以通过正交实验设计、星点法等方法经过有限次实验获得最佳工艺参数，这对本领域技术人员而言是众所周知的。因此，本领域技术人员在本发明的活性成分及提取液和浓度已知的情况下，可以根据本领域公知的常识，对提取溶剂的用量、浸泡时间的长短、回流提取的温度和次数等非关键参数做出调整和优化。
关于天然药物不同类型有效成分的提取工艺及原理国内外均已有大量文献报道，对本领域技术人员而言，可以参考的书籍等技术资料已较为普遍，如金利泰等主编的《高等院校药学与制药工程专业规划教材:天然药物提取分离工艺学》（浙江大学出版社2011出版）。
本发明的技术方案所述的紫椴拉丁学名为Tilia amurensis Rupr.；本发明的技术方案所述的紫椴花为紫椴的花及花蕾，这是本领域技术人员所公知的。
本发明的发明人经过实验研究发现紫椴花提取物具有改善睡眠的新活性，利用失眠动物模型进行的动物实验研究表明，紫椴花改善睡眠的有效部位为紫椴花依次经乙醇回流提取和乙酸乙酯萃取后得到的提取物。该提取物对失眠动物模型具有显著的治疗作用，且其治疗作用仅在一定剂量范围内有效，低于或超过该剂量范围即失去药效，换言之，紫椴花依次经乙醇回流提取和乙酸乙酯萃取后得到的提取物不仅能够治疗失眠，且无剂量依赖性，不会导致目前临床常用化药所具备的成瘾性，具有更高的安全性。
附图说明
图1为对照品混合溶液的HPLC色谱图；
图2为紫椴花纯化提取物溶液的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。
实施例1 紫椴花粗品提取物的制备
1)取干燥的紫椴花5kg，按照料液比1:10的比例加入浓度为70%的乙醇浸泡12小时，
80℃下回流提取，回流提取的次数为3次，每次回流提取的时间为2小时，合并提取液；
2)将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末，得粉末1kg；
3)将步骤2）所得粉末用水混悬，加入乙酸乙酯进行液液萃取，得乙酸乙酯萃取液；
4)将步骤3）所得乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯，即得具有抗失眠作用的紫椴花粗品提取物110g。
实施例2 紫椴花粗品提取物的制备
1)取干燥的紫椴花5kg，按照料液比1:15的比例加入浓度为70%的乙醇浸泡16小时，
82℃下回流提取，回流提取的次数为2次，每次回流提取的时间为2.5小时，合并提取液；
2)将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末，得粉末0.97kg；
3)将步骤2）所得粉末用水混悬，加入乙酸乙酯进行液液萃取，得乙酸乙酯萃取液；
4)将步骤3）所得乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯，即得具有抗失眠作用的紫椴花粗品提取物89g。
实施例3 紫椴花粗品提取物的制备
1)取干燥的紫椴花5kg，按照料液比1:8的比例加入浓度为70%的乙醇浸泡6小时，
81℃下回流提取，回流提取的次数为3次，每次回流提取的时间为1.5小时，合并提取液；
2)将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末，得粉末1.07kg；
3)将步骤2）所得粉末用水混悬，加入乙酸乙酯进行液液萃取，得乙酸乙酯萃取液；
4)将步骤3）所得乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯，即得具有抗失眠作用的紫椴花粗品提取物93g。
实施例4 紫椴花粗品提取物的制备
1)取干燥的紫椴花5kg，按照料液比1:12的比例加入浓度为70%的乙醇浸泡12小时，
82℃下回流提取，回流提取的次数为3次，每次回流提取的时间为2小时，合并提取液；
2)将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末，得粉末1.15kg；
3)将步骤2）所得粉末用水混悬，加入乙酸乙酯进行液液萃取，得乙酸乙酯萃取液；
4)将步骤3）所得乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯，即得具有抗失眠作用的紫椴花粗品提取物107g。
实施例5 紫椴花改善睡眠作用有效部位的研究
1 样品的制备
1）取干燥的紫椴花5kg，按照料液比1:10的比例加入浓度为70%的乙醇浸泡12小时，
80℃下回流提取，回流提取的次数为3次，每次回流提取的时间为2小时，合并提取液；
2)将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末，得粉末1kg；
3)将步骤2）所得粉末用水混悬，加入依次加入石油醚、乙酸乙酯进行反复液液萃取，分别分离出石油醚和乙酸乙酯萃取液，剩余部分为水组份，将石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液及水组份分别减压回收溶剂，60℃水浴蒸干为浸膏，粉碎后过200目筛，得石油醚萃取组份粉末194g、乙酸乙酯萃取组份粉末110g、水组份粉末696g。
取石油醚萃取组份粉末、乙酸乙酯萃取组份粉末、水组份粉末分别用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液混悬，配制浓度均为48mg/ml备用。
2动物与环境
雄性ICR小鼠，清洁级，体重18～22 g，由长春市忆斯实验动物技术有限责任公司提供， 许可证号码SCXK（吉）2011-0004.实验动物饲养于温度22±2℃，湿度55±5%，12小时明暗循环的实验室内，自由摄食摄水。
3药品与试剂
戊巴比妥钠由国药集团化学试剂有限公司提供，批号WS20120401，临用时用蒸馏水配制成0.55%的溶液。
4 实验方法
取小鼠48只，随机分为4组，每组12只，A组灌胃给予步骤1制备的石油醚萃取组份混悬液，B组灌胃给予步骤1制备的乙酸乙酯萃取组份混悬液，C组步骤1制备的水组份混悬液，D组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，A-C组给药剂量为20ml/kg体重（即960mg/kg体重），每日给药一次，连续给药7天。末次给药30分钟后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠55mg/kg。
提起小鼠尾巴，将小鼠腹部朝上放在温暖的（37℃）垫块上。记录翻正反射消失的持续时间（翻正反射消失时间至翻正反射重复出现时间）和翻正反射消失的潜伏期。分别记录各组小鼠入睡的潜伏期及睡眠持续时间。
5统计分析
实验结果采用均数土标准差表示，数据统计分析使用SPSS 17.0统计软件完成。P＜0.05，P＜0.01分别表示具有显著性差异和极显著差异。
实验结果见下表
a P＜0.05与D组相比。
实验结果显示，紫椴花乙酸乙酯组份在960mg/kg体重剂量下，连续灌胃给药7天后对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间有明显的延长作用，但对入睡潜伏时间没有影响。石油醚萃取组份及水组分未见睡眠调节作用，提示紫椴花抗失眠作用的有效部分为其乙酸乙酯组份。
实施例6紫椴花有效部位改善睡眠作用量效与时效关系硏究
1 样品的制备
按照实施例5“1 样品的制备”部分制备紫椴花乙酸乙酯萃取组份的混悬液。
2动物与环境
同实施例5
3药品与试剂
同实施例5
4实验方法
1）紫椴花有效部位改善睡眠作用的量效硏究
取小鼠72只，随机分成6组，每组12只。A组-E组分别灌胃给予紫椴花乙酸乙酯萃取组份的混悬液，给药剂量按照紫椴花乙酸乙酯萃取组份粉末的重量计算分别为304、405、540、720、960mg/kg体重，F组为空白对照组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。每日给药一次连续给药7天。末次给药30分钟后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠55mg/kg。分别记录各组小鼠入睡的潜伏期及睡眠持续时间。
2）紫椴花有效部位改善睡眠作用的时效关系硏究
取小鼠60只，随机分成5组，每组12只。A组-D组均灌胃给予紫椴花乙酸乙酯萃取组份的混悬液，给药剂量按照紫椴花乙酸乙酯萃取组份粉末的重量计算为540mg/kg体重，每日给药一次，给药天数依次为3、5、7、9天。F组为空白对照组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。每日给药一次连续给药7天。末次给药30分钟后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠55mg/kg。分别记录各组小鼠入睡的潜伏期及睡眠持续时间。
5统计分析
实验结果采用均数土标准差表示，数据统计分析使用SPSS 17.0统计软件完成。P＜0.05，P＜0.01分别表示具有显著性差异和极显著差异。
紫椴花有效部位改善睡眠作用的量效硏究结果见下表
a P＜0.05， b P＜0.01 与F组相比； c P＜0.05， d P＜0.01 与C组相比。
实验结果显示，在一定的剂量范围内，紫椴花显示出具有催眠作用(与空白组相比睡眠持续时间显著延长)。其最佳有效剂量为540mg/kg体重，超过该剂量，其催眠效果不随剂量升高而升高，即紫椴花乙酸乙酯组份的催眠作用不具有剂量依赖性，不易成瘾。
紫椴花有效部位改善睡眠作用的时效关系硏究结果见下表
a P＜0.05与E组相比。
实验结果显示，在剂量一定的前提下，随着给药时间延长，紫椴花乙酸乙酯组份对小鼠睡眠持续时间延长作用也随之延长，连续给药7天小鼠睡眠持续时间显著高于空白对照组，连续给药9天小鼠睡眠持续时间高于给药7天组，但差异不显著。
实施例7 紫椴花粗品提取物的纯化制备
将实施例1步骤4）所得紫椴花粗品提取物60℃水浴蒸干，得干膏，粉碎后过200目筛得粉末。
将上述粉末用甲醇溶解后上硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇（8:1、15:1、30:1、50:1）为洗脱剂进行梯度洗脱，得到4部分洗脱组份，收集二氯甲烷-甲醇15:1洗脱组份再次上硅胶柱色谱，以体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱，收集洗脱液回收溶剂，即得紫椴花纯化提取物。
上述提取物经ODS柱色谱分离，采用50%甲醇水溶液洗脱得到两个单体化合物，经1H-NMR和13C-NMR鉴定分别为银锻苷和紫云英苷，其化学结构和NMR归属如下：
银锻苷的结构及NMR数据
银锻苷的碳、氢信号归属（CD3OD,500Hz）
紫云英苷的结构及NMR数据
紫云英苷的碳、氢信号归属（CD3OD,500Hz）
实施例8紫椴花纯化提取物的HPLC分析
色谱条件：ZORBAX-SB C18柱（4.6mm×150mm,5μm）,柱温25℃，流速1mL/min，进样量10μL，全波长检测，以0.1%磷酸水溶液（pH0.3）为流动相A，以甲醇为流动相B，采用线性梯度洗脱，25%～33%B，0～110min。
对照品溶液的制备：分别精密称取紫云英苷、银椴苷对照品，用甲醇配制成紫云英苷2.4mg/mL、银椴苷3mg/mL对照品储备液。分别取上述对照品储备液1mL置于10mL容量瓶中，甲醇定容，即得紫云英苷 0.24 mg/mL、银椴苷0.3mg/mL混合对照品储备液。
样品溶液的制备：精密称取实施例7制备的紫椴花的纯化提取物0.05g，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声20min,待冷却后甲醇定容度。取10mL溶液4℃，13000rpm离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，即得样品溶液。
将对照品溶液稀释成系列浓度，采用上述色谱条件对对照品溶液进行测定，绘制标准曲线，用加权最小二乘法对曲线进行回归计算，求得回归方程和相关系数如下：
紫云英苷回归方程及相关系数：
y=14228x-50.934，R2=0.9999
银椴苷回归方程及相关系数：
y=38459x-21.111, R2=0.9995
其中Y代表待测物的峰面积值，X代表待测物浓度，相关系数大于0.999。
对照品混合溶液的HPLC色谱图如图1所示，其中1为银椴苷色谱峰，2为紫云英苷色谱峰。
将样品溶液进行检测，平行测定三次。样品溶液的HPLC色谱图如图2所示，其中1为银椴苷色谱峰，2为紫云英苷色谱峰。
计算紫云英苷和银椴苷的峰面积，将峰面积代入对应回归方程计算出相应成分的浓度，根据每种成分的浓度与样品浓度的比值计算相应成分的含量。紫云英苷、银椴苷的峰面积及含量测定结果见下表：
实施例9紫椴花纯化提取物的活性成分研究
鉴于紫椴苷纯化提取物的抗失眠活性，及紫椴花中含量最高的两种成分为紫云英苷和银椴苷，推测紫云英苷和/或银椴苷为紫椴苷纯化提取物抗失眠活性的主要活性成分。因此通过药效学试验进行验证：
1 样品的制备
紫椴花纯化提取物的制备同实施例7，银椴苷及紫云英苷分别溶于0.5%羧甲基纤维素钠水溶液备用。
2动物与环境
同实施例5
3药品与试剂
同实施例5
4实验方法
取小鼠48只，随机分成4组，每组12只。A组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠水溶液；B组给予紫椴花纯化提取物，剂量为40mg/kg；C组灌胃给予紫云英苷0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，给药剂量按照紫云英苷计算为25 mg/kg（＝40mg/kg×62.5%，按照实施例8的含量测定结果设定剂量）；D组灌胃给予银椴苷0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，给药剂量按照银椴苷计算为12 mg/kg（≈40mg/kg×31.7%，按照实施例8的含量测定结果设定剂量）。每日给药一次连续给药7天。末次给药30分钟后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠55mg/kg。分别记录各组小鼠入睡的潜伏期及睡眠持续时间。
5统计分析
实验结果采用均数土标准差表示，数据统计分析使用SPSS 17.0统计软件完成。P＜0.05，P＜0.01分别表示具有显著性差异和极显著差异。各组实验结果见下表：
ap＜0.01与A组相比；bp＜0.05与B组相比。
上述实验中紫云英苷及银锻苷的给药剂量均按照上述成分在紫椴花纯化提取物中的含量进行换算，其给药剂量与40mg/kg紫椴花提取物中的含量相近。
由上述结果，紫椴花纯化提取物具有改善模型大鼠睡眠的效果，但其两种含量较高的单体组分中，仅有银椴苷具有改善模型大鼠睡眠的效果，紫云英苷无显著睡眠改善作用，且12mg/kg银锻苷（约为40mg/kg紫椴花纯化提取物的31.7%）与40mg/kg紫椴花纯化提取物对睡眠时间的延长作用无显著差异，提示银椴苷为紫椴花纯化提取物抗失眠作用的主要有效成分。
Claims (6)
1.紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用，其特征在于，所述紫椴花提取物的制备方法至少包括以下步骤：
1）取干燥的紫椴花，加入浓度为70%的乙醇浸泡，回流提取，得紫椴花乙醇提取液；
2）将步骤1）所得提取液过滤，回收乙醇溶剂得浸膏，将浸膏干燥，粉碎成粉末；
3）将步骤2）所得粉末用水混悬，加入乙酸乙酯进行液液萃取，得乙酸乙酯萃取液；
4）将步骤3）所得乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯，即得具有抗失眠作用的紫椴花粗品提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫椴花提取物的制备方法中，步骤1）中乙醇的用量按照料液比计算为1:（5～20），乙醇浸泡的时间为10～18小时，回流提取的温度为79℃～85℃，回流提取的次数为1～4次，每次回流提取的时间为1～3小时。
3.根据权利要求1至2所述的应用，其特征在于，所述紫椴花提取物的制备方法中，步骤1）中乙醇的用量按照料液比计算为1:10，乙醇浸泡的时间为12小时，回流提取的温度为80℃，回流提取的次数为3次，每次回流提取的时间为2小时。
4.根据权利要求1至3所述的应用，其特征在于，所述紫椴花提取物的制备方法还包括如下附加步骤：
5）将步骤4）所得产物60℃水浴蒸干，得干膏，粉碎后过200目筛得粉末；
6）将步骤5）所得粉末用甲醇溶解后上硅胶柱，以体积比分别为8:1、15:1、30:1、50:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液进行梯度洗脱，收集体积比15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液所得洗脱液，上硅胶柱色谱，以体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱，收集洗脱液回收溶剂，即得紫椴花纯化提取物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述紫椴花纯化提取物经ODS柱色谱分离，采用50%甲醇水溶液洗脱得到两个单体化合物，经1H-NMR和13C-NMR鉴定分别为银锻苷和紫云英苷；所述纯化提取物经HPLC分析，银锻苷的质量含量为31.7%。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述紫椴花纯化提取物的主要活性成分为银椴苷。
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Application publication date: 20150729 Assignee: Heilongjiang Yuanmeng Health Industry Development Co.,Ltd. Assignor: HEILONGJIANG University OF CHINESE MEDICINE Contract record no.: X2024980006950 Denomination of invention: The application of extracts from Tilia amurensis flowers in the preparation of drugs for treating insomnia Granted publication date: 20180810 License type: Common License Record date: 20240612 |
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