CN104782484B - 一种利用蜈蚣草茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用蜈蚣草茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法，属植物组织培养技术领域。本发明方法是指将蜈蚣草的不同外植体，经过无菌处理，预培养之后，将外植体进行愈伤组织诱导培养，愈伤组织转入增殖培养基，形成绿色球状体(GGB)，GGB经过两次分化培养后，获得小苗和新的愈伤组织，将小苗进行生根培养，新的愈伤组织进行增殖培养形成GGB，周而复始，从而获得大量组培苗。本发明的有益效果是：外植体污染率低；外植体无褐化现象，形成了蜈蚣草快繁的技术效果；能够直接分化成新的组培苗，大大缩短了蜈蚣草的繁殖周期，有利用于工厂化大批量生产，形成繁殖系数高的技术效果；采用不同的光照强度避免了愈伤和分化苗的玻璃化，形成了良好的培养效果。
Description
技术领域：
本发明涉及一种利用蜈蚣草茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法，属植物组织培养技术领域。
背景技术：
蜈蚣草(Pteris vittata Linn.)属于凤尾蕨科Pteridaceae、凤尾蕨属Pteris，多年生草本植物，可作为钙质土和石灰岩的指示植物，具有较高的观赏、药用和环保价值。在观赏价值方面，由于其羽叶优美，栽培较为广泛，并且常用于配置山石盆景；在药用价值方面，据植物志记载，蜈蚣草亦可全草入药，有解毒、祛风除湿、杀虫、治疳疮、止血、止泻等功效；在环保价值方面，蜈蚣草对砷等重金属的耐性和富集能力极强，在重金属污染的土壤和水源的修复中具有重要价值。
蜈蚣草的繁殖一般有成熟孢子繁殖、分株法繁殖和组织培养繁殖等3种方法。成熟孢子繁殖和分株法繁殖效率不高，耗时长，目前蜈蚣草的繁殖多集中在利用组织培养方法上。现有的蜈蚣草组织培养技术，多采用蜈蚣草的孢子萌发成配子体，再用配子体诱导愈伤组织，最终获得组培苗，但蜈蚣草野外收集孢子和室内孢子无菌处理较艰难，孢子轻，易漂浮，处理过程繁琐，不易操作。罗利琼等，2011年在安微农业科学发表的《凤尾蕨科植物蜈蚣草的组织培养》中，为克服传统的孢子繁殖带来的一系列问题，以野生蜈蚣草幼嫩叶芽为外植体，通过激素配比试验，成功地筛选出蜈蚣草愈伤组织诱导和继代培养的培养基配方，简化了组织培养的步骤，能够在2个月内培育出蜈蚣草幼苗，但未介绍蜈蚣草的成苗率。
就以上介绍蜈蚣草组织培养的方法共性还在于，相关培养基的配置只是调整植物激素和大量元素，微量元素，有机碳源的比例来完成。我们通过相关文献介绍的培养基组合，经过多次试验，成苗率很低甚至无法成苗。早在20世纪就有人针对难培养的材料，在其培养基中附加天然提取物(如椰乳、玉米胚乳、香蕉汁等)，从而得到了很好的培养效果，尤其在提高分化率和防止褐化效果方面较为显著。而蜈蚣草在培养过程中，褐化较为严重，现有的培养方法是添加防止褐 化的氧化剂，如活性炭和PVP，但在整个培养过程中，都需要加入这些氧化剂，增加了过程的繁琐，也造成相关试剂的浪费。到目前为止，应用天然提取物进行蜈蚣草快繁的方法还未见报道。
发明内容：
鉴于上述技术的现状，本发明提供了一种利用蜈蚣草茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法，旨在提供一种适用于蜈蚣草不同外植体通用的培养基，为蜈蚣草的培育提供一种新的技术平台。
本发明提供一种利用蜈蚣草的茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法，是指将蜈蚣草的不同外植体，经过无菌处理，预培养之后，将外植体进行愈伤组织诱导培养，愈伤组织转入增殖培养基，形成绿色球状体(GGB)，GGB经过两次分化培养后，获得小苗和新的愈伤组织，将小苗进行生根培养，新的愈伤组织进行增殖培养形成GGB，周而复始，从而获得大量组培苗。
本发明中，所述的蜈蚣草不同外植体，是选用蜈蚣草幼嫩叶片和刚从地下冒出4-6厘米的幼芽。
本发明中，所述的无菌处理，是将蜈蚣草叶片和幼芽用自来水冲洗10分钟，用3％的质量体积比洗衣粉充分溶解，浸泡幼芽，并不断搅动，10分钟后，再用流动的自来水冲洗30分钟，用吸水纸吸干多余水份置超净台上备用。将备用的蜈蚣草叶片用70％或75％体积比的酒精表面灭活30秒，再用0.1％质量体积比的氯化汞消毒6分钟或8分钟，无菌水冲洗5遍或6遍，用无菌滤纸吸干多余水份，待用。
本发明中，所述的预培养，是将幼芽接种到预培养基(1/2MS+琼脂粉7.8g/L+蔗糖10g/L，PH5.8-6.0)上，形成幼孢子体。
本发明中，所述的愈伤组织诱导培养，是将幼孢子体和无菌处理好的幼嫩叶片，切成小段，接入诱导培养基(1/2MS+2,4-D 2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)80g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0或1/2MS+2,4-D 2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)60g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L,PH5.8-6.0)上，每皿接种20-25个，置于温度25.8-26℃，湿度60％-70％的培养箱中暗培养，一周后转到温度和湿度与暗培养相同，光照2000Lux，光照时间12小时的培养箱中继续培养。
本发明中，所述的增殖培养，是将愈伤组织转入增殖培养基(1/2MS+2,4-D0.5mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)100g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0)上，每皿转接10-15个愈伤组织，此时温度、湿度、光照条件与愈伤组织诱导培养一致，12天后，愈伤组织长到1-1.5厘米的绿色球状体(GGB)。
本发明中，所述的两次分化培养，是将增殖后的愈伤组织切成0.3-0.5厘米，接入分化培养基[1/2MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)120g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0]中进行分化培养，温度25.8-26℃，湿度50％-60％，光照强度3000Lux，光照时间12小时，一周后将光照调至4000Lux，出现黄绿色小颗粒，继续分化培养7天后，绿色颗粒随着长大，并长出芽点和纤细小苗，为第一次分化。接着又将光照调回3000Lux，将长出的芽点和纤细小苗，重新接入新的分化培养基[1/2MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)200g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0]中，继续进行分化培养，7天后，分化的芽点已经长成独立小苗同时又长出新的丛生芽点和新的愈伤，这个周期为第二次分化培养。
本发明中，所述的生根培养，是指将绿而壮的小苗接入生根培养基(1/4MS+NAA0.2mg/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖15g/L，PH5.8-6.0。)中生根培养。将3-4厘米绿而壮的小苗接入装有30毫升培养基的玻璃试管中，温度25.8-26℃，湿度50％-60％，光照强度3000Lux，光照时间12小时，进行生根培养，15-20天后，根芽长出，27天后，主根长2厘米，此时的生根苗即能假植。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、预培养时不添加任何激素，让外植体在野外环境过度到室内环境。有利于胚性愈伤形成，并且达到了外植体较低污染率的技术效果。
2、在诱导愈伤和分化时添加不同浓度的蜈蚣草茎干和叶匀浆，不仅能同时培养蜈蚣草的不同外植体，而且有利于提高愈伤诱导率和分化率，在不添加任何氧化剂的前提下，外植体无褐化现象，形成了蜈蚣草快繁的技术效果。
3、利用本发明中优化方案再次得到的愈伤组织，能够直接分化成新的组培苗，28天内就能获得新的组培苗，大大缩短了蜈蚣草的繁殖周期，有利用于工厂化大批量生产，形成繁殖系数高的技术效果。
4、本发明在愈伤诱导和分化培养过程中，采用不同的光照强度避免了愈伤和分化苗的玻璃化，形成了良好的培养效果。
具体实施方式：
实施例一：利用蜈蚣草幼芽诱导愈伤获得组培苗
1、外植体选择
采集每年3月份刚从地下冒出4厘米或6厘米的幼芽蜈蚣草，用浸湿的吸水纸包好，放入自封袋中，置4度冰箱冷藏保鲜、保湿。
2、外植体无菌处理
将蜈蚣草幼芽用自来水冲洗10分钟，用3％的质量体积比洗衣粉充分溶解，浸泡幼芽，并不断搅动，10分钟后，再用流动的自来水冲洗30分钟，用吸水纸吸干多余水份置超净台上备用。
将备用的蜈蚣草幼芽用70％或75％体积比的酒精表面灭活30秒，再用0.1％质量体积比的氯化汞消毒6分钟或8分钟，无菌水冲洗5遍或6遍，再用手术刀片刮下茎干上的绒毛，同时切掉多余的茎干距尾1公分，再冲洗2遍，用无菌滤纸吸干多余水份，待用。
3、蜈蚣草诱导预培养
将待用蜈蚣草幼芽接入预培养基上，每瓶接入10个或12个外植体，放在靠近自然光的培养架上培养，7天后，幼芽伸长，此时的幼芽正好用于诱导愈伤，预培养基为：1/2MS+琼脂粉7.8g/L+蔗糖10g/L,PH5.8-6.0。
4、蜈蚣草诱导培养
将预培养后的幼芽切成长0.5厘米或1.0厘米，接入诱导培养基中，每皿接种20个或25个，置于温度25.8℃或26℃，湿度60％或70％培养箱中暗培养，一周后转到温度湿度相同，光照2000Lux，光照时间12小时的培养箱中继续诱导培养。16天后，在幼芽周围出现绿色小点，25天后，绿色小点膨大至0.3厘米或0.5厘米的愈伤组织，诱导培养基为：1/2MS+2,4-D2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)80g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0。
5、蜈蚣草增殖培养基
将愈伤组织转接到增殖培养基上，每皿转接10个或15个愈伤组织，置于 温度25.8℃或26℃，湿度60％或70％，光照2000Lux，光照时间12小时的培养箱培养，12天后，愈伤组织长到1厘米或1.5厘米的绿色球状体(GGB)，增殖培养基为：1/2MS+2,4-D0.5mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)100g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0。
6、蜈蚣草分化培养
将增殖后的愈伤组织切成0.3厘米或0.5厘米，接入分化培养基中进行分化培养，温度25.8℃或26℃，湿度50％或60％，光照强度3000Lux，光照时间12小时，一周后将光照调至4000Lux，出现黄绿色小颗粒，继续分化培养7天后，绿色颗粒随着长大，并长出芽点和纤细小苗，为第一次分化。接着又将光照调回3000Lux，将长出的芽点和纤细小苗，重新接入新的分化培养基中，继续进行分化培养，7天后，分化的芽点已经长成独立小苗同时又长出新的丛生芽点和新愈伤，这个周期为再分化，12天后，壮而绿的小苗已经长至3厘米或3.5厘米，而丛生芽长成了丛生苗，这个周期为第二次分化培养。
第一次分化培养基为：1/2MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)120g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0。
第二次分化培养基为：1/2MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)200g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0。
7、蜈蚣草生根培养
将壮而绿的小苗和长出的愈伤分别切开，小苗接入生根培养基中生根培养。愈伤再转接增殖，分化出的不定芽又脱分化成GGB，周而复始，使GGB不断增殖。生根培养基为：1/4MS+NAA0.2mg/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖15g/L,PH5.8-6.0。
在该实施例中幼芽的愈伤诱导率在100％，愈伤诱导丛生芽的分化率在98％，丛生苗的分化率在98％。
实施例二：利用蜈蚣草幼嫩叶片诱导愈伤获得组培苗
本实施例用幼嫩叶片诱导愈伤，采用本发明方法获得了同样的丛生苗。实施过程同实施例一，有以下几点不同：
1、外植体选择
采集蜈蚣草幼嫩叶片，用浸湿的吸水纸包好，放入自封袋中，置4度冰箱冷 藏保鲜、保湿。
2、外植体无菌处理
将蜈蚣草叶片用自来水冲洗10分钟，用3％的质量体积比洗衣粉充分溶解，浸泡叶片，并不断搅动，10分钟后，再用流动的自来水冲洗30分钟，用吸水纸吸干多余水份置超净台上备用。将备用的蜈蚣草叶片用70％或75％体积比的酒精表面灭活30秒，再用0.1％质量体积比的氯化汞消毒6分钟或8分钟，无菌水冲洗5遍或6遍，用无菌滤纸吸干多余水份，待用。
3、愈伤诱导培养基
诱导培养基为：1/2MS+2,4-D2mg/L+(蜈蚣草茎干和叶匀浆)60g/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0。诱导时间为12天。
在该实施例中幼嫩叶片的愈伤诱导率在100％，丛生芽的分化率在98％，丛生苗的分化率在98％。
Claims (1)
1.一种利用蜈蚣草茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法，其特征在于利用蜈蚣草茎叶匀浆快速获得其组培苗的方法的具体步骤如下：
a.外植体选用蜈蚣草幼嫩叶片和刚从地下冒出4-6厘米的幼芽；
b.蜈蚣草诱导预培养是将幼芽接种到预培养基上形成幼孢子体，预培养基为：1/2MS+琼脂粉7.8g/L+蔗糖10g/L，PH5.8-6.0；
c.蜈蚣草诱导培养是将幼孢子体和无菌处理好的幼嫩叶片，切成小段，接入诱导培养基上，每皿接种20-25个，置于温度25.8-26℃，湿度60％-70％的培养箱中暗培养，一周后转到温度和湿度与暗培养相同，光照2000Lux，光照时间12小时的培养箱中继续培养；诱导培养基为：1/2MS+2,4-D 2mg/L+80g/L的蜈蚣草茎干和叶匀浆+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0；或1/2MS+2,4-D2mg/L+60g/L的蜈蚣草茎干和叶匀浆+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L,PH5.8-6.0；
d.蜈蚣草增殖培养是将愈伤组织转入增殖培养基上，每皿转接10-15个愈伤组织，此时温度、湿度、光照条件与愈伤组织诱导培养一致，12天后，愈伤组织长到1-1.5厘米的绿色球状体；增殖培养基为：1/2MS+2,4-D0.5mg/L+100g/L的蜈蚣草茎干和叶匀浆+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0；
e.蜈蚣草分化培养是两次分化培养，即：将增殖后的愈伤组织切成0.3-0.5厘米，接入分化培养基中进行分化培养，温度25.8-26℃，湿度50％-60％，光照强度3000Lux，光照时间12小时，一周后将光照调至4000Lux，出现黄绿色小颗粒，继续分化培养7天后，绿色颗粒随着长大，并长出芽点和纤细小苗，为第一次分化，分化培养基为：1/2MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+120g/L的蜈蚣草茎干和叶匀浆+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0；接着又将光照调回3000Lux，将长出的芽点和纤细小苗，重新接入新的分化培养基中继续进行分化培养，7天后，分化的芽点已经长成独立小苗同时又长出新的丛生芽点和新的愈伤，这个周期为第二次分化培养，新的分化培养基为：1/2MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L+200g/L的蜈蚣草茎干和叶匀浆+琼脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0；
f.生根培养是指将绿而壮的小苗接入生根培养基中生根培养，将3-4厘米绿而壮的小苗接入装有30毫升生根培养基的玻璃试管中，温度25.8-26℃，湿度50％-60％，光照强度3000Lux，光照时间12小时，进行生根培养，15-20天后，根芽长出，27天后，主根长2厘米，此时的生根苗即能假植；生根培养基为：1/4MS+NAA0.2mg/L+琼脂粉7.8g/L+蔗糖15g/L，PH5.8-6.0。
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