CN104756865A

CN104756865A - 一种贵州半蒴苣苔的离体保存方法

Info

Publication number: CN104756865A
Application number: CN201410740021.7A
Authority: CN
Inventors: 李翠; 张占江; 李林轩; 韦莹; 缪剑华; 韦坤华; 郭晓云; 吕惠珍; 王一诺; 王晓峰
Original assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Current assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: CN104756865B

Abstract

本发明公开了一种贵州半蒴苣苔的离体保存方法，包括贵州半蒴苣苔的组培快繁，再利用组培快繁得到的丛生芽分化壮苗产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，本发明保存培养基为1/2MS+CCC1.0mg/l+AC0.3％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％。培养基的pH值为5.8，温度为18±1℃，光照强度1400～1600lx，光照时间为8～10小时/天。利用本发明的方法可以使贵州半蒴苣苔种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量贵州半蒴苣苔的优质种苗，有效解决了贵州半蒴苣苔种质资源保存及规模化育苗问题。

Description

一种贵州半蒴苣苔的离体保存方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体地，涉及贵州半蒴苣苔的离体保存方法。

背景技术

贵州半蒴苣苔是苦苣苔科半蒴苣苔属植物，分布于我国广西、广东、福建、湖南等省。全草入药，微酸、涩，具有清热解毒的功效。用于治疗痈、烫伤、跌打损伤、刀伤出血，腹水。但是其存量少，繁殖率低，加上其种子细小，繁殖比较困难，在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大的困难。

贵州半蒴苣苔一般生于山谷林下石上或阴处，林缘沟旁或岩石上、沟边石缝中，石灰岩山地阴湿处，对环境要求比较苛刻，加之近年来环境资源遭到严重破坏，使贵州半蒴苣苔植株数量大大减少。因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对贵州半蒴苣苔资源的修复和再生，防止流失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。

目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题，而组织培养为离体种质保存提供了最便捷、稳定的手段。

组织培养的关键技术是培养基及其培养条件，同一属不同种的植物其培养条件也不尽相同，因此，对同一个属的不同种的植物组织培养条件的研究也十分必要。

目前对于贵州半蒴苣苔离体保存的研究还比较少，授权公告号为CN103141390B的中国发明专利“红苞半蒴苣苔的繁殖方法”一文中公开了一种人工快速繁殖红苞半蒴苣苔的方法，为进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础，本文只是为保存该物种打下基础，并没有公开如何保存。申请人在公开号为CN 104041412 A的中国发明专利“一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法”中也公开了利用组织培养技术快速繁殖贵州半蒴苣苔的方法，但是同样也并没有公开贵州半蒴苣苔是如何进行保存的，同时，本发明中申请人将贵州半蒴苣苔组培快繁过程中的壮苗和生根同时进行，减少了一个步骤，可以达到同样的扩繁效果，因此采用本发明将节省人力物力。另外申请人还在公开号为CN103651127A的中国发明专利“一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法”一文中公开了对弄岗唇柱苣苔的离体保存时将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d，但是并没有公开此最佳保存培养基的具体配比，而对于离体保存来说，其保存培养基的配比是其保存能否成功的一个重要条件，因此，对其保存培养基的研究和公开具有十分重要的意义。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提供一种贵州半蒴苣苔的离体保存方法，利用组织培养技术对其进行离体繁殖，通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存，不仅可以有效挽救濒危的贵州半蒴苣苔物种，使之成为可再生资源，还可以为贵州半蒴苣苔种植提供优良一致种苗的技术和室内离体保存提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种贵州半蒴苣苔的离体保存方法，包括如下步骤：

(1)外植体诱导培养：取野外采集的贵州半蒴苣苔的顶芽作为外植体，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗2～3次，投入添加2％吐温-20的0.1％升汞4min，再用无菌水冲洗2～3次，再次投入添加2％吐温-20的0.1％升汞4min，最后用无菌水冲洗2～3次后切割为0.5～1.0cm长接种在接种培养基上，培养10～14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；

(2)丛生芽壮苗生根培养：经25～35天，丛生芽长至2～3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4～6片叶的试管苗；

(3)试管苗离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存。

前述贵州半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(1)中所述的接种培养基为：MS+6-BA 1.0mg/l+NAA0.4mg/l+KT0.4mg/l+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为12～14小时/天。

前述贵州半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(2)中所述的壮苗生根培养基为：MS+IAA0.6mg/l+ABT 0.5mg/l+AC0.8％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，温度为22～25℃，光照强度2600～2800lx，光照时间为12～14小时/天。

前述贵州半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(3)中所述的保存培养基为1/2MS+CCC1.0mg/l+AC0.3％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，温度为18±1℃，光照强度1200～1600lx，光照时间为6～8小时/天。

本发明的有益效果：

本发明申请人在公开号为CN 104041412 A的中国发明专利“一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法”基础上进行了进一步的改进，将贵州半蒴苣苔组培快繁过程中的壮苗和生根同时进行，减少了一个步骤，可以达到同样的扩繁效果，因此采用本发明将节省人力、物力以及时间。

本发明打破了对贵州半蒴苣苔离体保存研究的空白，利用本发明的方法可以使种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量贵州半蒴苣苔的优质种苗，有效解决了贵州半蒴苣苔属种质资源保存及规模化育苗问题。

本发明通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件，实现了使贵州半蒴苣苔有效繁殖的目的，另外，对其保存培养进行了一系列的研究，通过筛选合适的保存培养基达到本发明的目的，实现了贵州半蒴苣苔的离体保存。使贵州半蒴苣苔的规模化工业生产成为可能，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1表示本发明光强对贵州半蒴苣苔离体保存的影响。

其中，横坐标表示光照强度(lx)，纵坐标表示保存天数(d)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种贵州半蒴苣苔属离体保存方法，通过以下方法实现：

一、贵州半蒴苣苔经快速繁殖得培养物：

1、供试材料

贵州半蒴苣苔Hemiboea cavaleraei Levl顶芽。

2、外植体的消毒处理

将选择的顶芽，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗2～3次，投入添加2％吐温-20的0.1％升汞4min，再用无菌水冲洗2～3次，再次投入添加2％吐温-20的0.1％升汞4min，最后用无菌水冲洗2～3次。

3、外植体诱导

将采集到的贵州半蒴苣苔顶芽灭菌后切割为0.5～1.0cm长的小段，接种在培养基(MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.4mg/l+KT0.4mg/l+蔗糖3.5％+琼脂0.4％)上，培养8～14天，顶芽分化形成丛生芽，丛生芽可切割重复培养。在此培养基上，长成完整试管苗，供移栽。所述培养基的pH值为5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为12～14小时/天。

4、丛生芽壮苗生根

上一步骤中贵州半蒴苣苔顶芽培养天16天左右，可得到大量丛生芽(70％以上)，又经过20～30天的培养可以得到高约2～3cm芽体，转入壮苗生根培养基(壮苗生根培养基为：1/2MS+IAA0.6mg/l+AC0.8％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％)，所述培养基的pH值为5.8，温度为22～25℃，光照强度2600～2800lx，光照时间为12～14小时/天。培养1个月后加强光(3000Lx及以上)，培养一个月左右，试管苗可达到移苗标准。整个周期为2～3个月。

5、试管苗移栽

当试管苗至少具有4～6片伸展叶，根系正常，健康，高度为6cm左右时，即可出瓶移栽，先要经室内炼苗，出瓶时不能折伤叶片和根尖，清除根系上的培养基，分株种植，种植基质为石灰岩∶珍珠岩∶草炭土＝4∶2∶4，基质需经过高温高压灭菌，盖上透光率50％的黑色遮阴网以保持较低光强，2d浇水1次以保持湿润。栽后放在大棚内，隐蔽度为70％，棚内温度控制在20℃～28℃，注意保湿。7～15天用1/8MS液，喷施一次，促进幼苗生长。约20天试管苗长出新根，揭开遮阴网，单株移栽入盆。盆土为河沙∶石灰岩∶草炭土＝1∶3∶6。试管苗移栽不宜太深，移栽的成活率可达95％。

二、取上述所得贵州半蒴苣苔试管苗进行离体保存

选择上述具有4～6片叶贵州半蒴苣苔试管苗为试验材料进行离体保存。

下面对其进行培养基类型、温度、光照强度、生长抑制剂的筛选，保存天数均以试管苗存活率为60％进行统计。

1、培养基对贵州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有35g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1℃，光强2000lx，光照7h/d；结果表明，贵州半蒴苣苔在1/2MS培养基上保存时间最长，为253天，具体结果见表1。

表1 培养基对贵州半蒴苣苔离体保存时间的影响

2、温度对贵州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接入1/2MS培养基分别放置于温度15℃，18℃，21℃、24℃的光照培养箱培养，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有30g/L蔗糖和4.85g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，光强2000lx，光照7h/d，结果表明，贵州半蒴苣苔在温度为18℃培养箱中保存时间最长，为307天；具体见表3。

表2 温度对贵州半蒴苣苔离体保存时间的影响

3、光照强度对贵州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到1/2MS培养基，设计0、1200lx，1400lx、1600lx，1800lx五种光照强度，每种光强接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有35g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度18±1，光照7h/d；结果表明，贵州半蒴苣苔在光强为1600lx条件下保存时间最长，为325天，具体比较结果见图1。

4、生长抑制剂对贵州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到添加下述不同浓度CCC、PPP₃₃₃的1/2MS培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有30g/L蔗糖和4.Sg/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度18±1℃，光强1600lx，光照7h/d，结果表明，贵州半蒴苣苔在CCC浓度为1.0mg/L是保存时间最长，为338天；具体情况见表3。

表3 激素对贵州半蒴苣苔保存时间的影响

通过上述实验，确定贵州半蒴苣苔最佳离体保存培养基为1/2MS+CCC1.0mg/l+AC0.3％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，温度为18±1℃，光照强度1200～1600lx，光照时间为6～8小时/天。保存天数为338大。

5、生长状况考察

离体保存的贵州半蒴苣苔试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的贵州半蒴苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后，存活的半蒴苣苔试管苗接种到MS+6-BA1.5mg/l+NAA0.3mg/l+KT0.3mg/l，添加AC0.1％，添加3％的蔗糖和0.45％的琼脂培养基上，每30d继代1次，继代3次后，以株高、生长率、繁殖倍数、单株生根率为指标考察贵州半蒴苣苔试管苗的恢复情况，见表4。从对比中可以看出，经过338d离体保存后的试管苗恢复情况良好。

表4 离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较

本发明中所用的物质分别注释为6-BA(6-苄氨基嘌呤)，NAA(萘乙酸)，KT(激动素)，IAA(吲哚乙酸)，AC(活性炭)，CCC(矮壮素)，PPP333(多效唑)。

Claims

1.一种贵州半蒴苣苔的离体保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的贵州半蒴苣苔的离体保存方法，其特征在于，步骤(1)中所述的接种培养基为：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.4mg/l+KT0.4mg/l+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为12～14小时/天。

3.如权利要求1所述的贵州半蒴苣苔的离体保存方法，其特征在于，步骤(2)中所述的壮苗生根培养基为：MS+IAA0.6mg/l+ABT 0.5mg/l+AC0.8％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，温度为22～25℃，光照强度2600～2800lx，光照时间为12～14小时/天。

4.如权利要求1所述的贵州半蒴苣苔的离体保存方法，其特征在于，步骤(3)中所述的保存培养基为1/2MS+CCC1.0mg/l+AC0.3％+蔗糖3.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8，温度为18±1℃，光照强度1200～1600lx，光照时间为6～8小时/天。