CN104704349A - Cars显微镜 - Google Patents

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Abstract

以往的测定物质种类的分布的显微镜难以进行试样的折射率分布的测定，能够取得的信息有限。构成为，具备：第一光分割机构(102)，将来自光源(110)的光分割为第一激励光通量和第二激励光通量；斯托克斯光源(104)，被输入上述第二激励光通量，输出斯托克斯光通量；合波机构(108)，将上述第一激励光通量与上述斯托克斯光通量进行合波，生成合波光通量；第一聚光机构(109)，将上述合波光通量聚光到试样(110)中；第一检测器(113)，检测从上述试样中产生的与合波光通量不同波长的CARS光；第二光分割机构(107)，将上述第二激励光通量和上述斯托克斯光中的至少一方的光通量的一部分作为参照光通量进行分支；第二合波机构(017)，将来自试样中的光通量与上述参照光通量进行合波，生成干涉光；以及第二检测器，检测上述干涉光。

Description

CARS显微镜
技术领域
本发明涉及光学显微镜的高性能化。
背景技术
光学显微镜不言而喻，是在自然科学、工学、工业领域中不能没有的观察工具。特别是，近年来，作为照明光源而使用激光的更高性能的显微镜在尖端技术开发中变得必不可少。其代表例是荧光共焦点显微镜，作为通过与荧光试剂的组合来观察生物体试样中的特定物质的分布的手段而在医学、生物学领域中正在广泛地普及。进而，随着近年来的高性能的短脉冲激光光源的出现，使用非线性光学效果的非线性光学显微镜的技术发展和医学、生物学领域中的需求的提高很显著。作为非线性光学显微镜(或非线性显微镜)的例子，已知有双光子荧光显微镜(非专利文献1)、SHG显微镜(非专利文献2)、相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜(非专利文献3)、受激拉曼散射(SRS)显微镜(非专利文献4)等。例如双光子荧光显微镜能够选择试样的吸收较小的波长域作为向试样照射的激光，与以往的荧光共焦点显微镜相比能够进行深部的成像。SHG显微镜是观察来自试样的第二高次谐波的显微镜，能够有选择地检测骨胶原等光纤构造、细胞膜等特定的构造体。CARS显微镜是向试样照射激励光和斯托克斯光这两种激光并对这些光的差频与试样分子的固有振动共振的结果产生的反斯托克斯光进行观测的显微镜。通过反斯托克斯光的波长、强度分布，能够观测试样中的特定物质的分布，作为代替荧光显微镜的无标签、非侵袭性的显微镜受到关注。SRS显微镜与CARS显微镜同样是向试样照射激励光、斯托克斯光并将物质的固有振动作为上述两种光的强度变化来观测的显微镜，与CARS显微镜同样是非侵袭性的显微镜。像这样，非线性光学显微镜提供以往的显微镜不能实现的各种高性能的观察手段。
这里，对CARS显微镜的动作原理进行说明。CARS是基于3阶极化的发光，为了产生CARS，需要激励光、斯托克斯光、探测光。一般而言，为了减少光源的数量，用激励光代替探测光。在此情况下，将被激励的3阶极化用
[数式1]
PAS (3)(ωAS)＝|χr (3)(ωAS)+χnr (3)|EP 2(ωP)E＊S(ωS)
表示。这里，Χr(3)(ωAS)是3阶电敏感度的分子振动的共振项，Χnr (3)是非共振项。此外，将激励光及探测光的电场用EP表示，将斯托克斯光的电场用ES表示。非共振项没有频率依赖性。数式1的ES的上角带有的星号表示复共轭。CARS光的强度如以下这样表示。
[数式2]
ICARS(ωAS)∝|PAS (3)(ωAS)|2
关于CARS光所产生的机构，使用分子的能级图(图14)进行说明。图14表示共振项的过程。1401表示分子的振动基底状态，1402表示振动激励状态。将频率ωp的激励光和频率ωS的斯托克斯光同时照射。此时，分子经由中间状态1403被激励为1402的某个振动激励能级。如果对处于该激励状态的分子照射频率ωP的探测光，则一边经由中间状态1404而产生频率ωAS的CARS光，一边分子回到振动基底状态。将此时的CARS光的频率表示为ωAS＝2ωP－ωS。
从图14可知，该共振CARS光仅在激励光与斯托克斯光的频率之差ωp－ωs和观测试样的某个振动激励状态一致的情况下产生(其中，这里采用普朗克单位制，普朗克常数为1)。因而，在作为斯托克斯光而使用了宽频带的光源的情况下，所产生的CARS光也为宽频带的光，但具有在与振动激励状态对应的波长下有尖锐的尖峰的光谱。该光谱被称作拉曼光谱，反映试样中的分子的振动激励状态的分布，可以用于分子种类的确定。
在图15中表示与数式1的非共振项有关的一个过程。斯托克斯光的频率不是振动激励状态，而是经由了中间状态1405的过程。通过频率ωP的激励光和频率ω’p的探测光的同时照射，激励出电子等参与的1405的中间状态，进而，通过频率ω’s的斯托克斯光，经由中间状态1406而产生频率ωAS的非共振的CARS光。由于该非共振的CARS光与振动激励状态无关地产生，所以在使用了宽频带的斯托克斯光的情况下，产生不具有强度的波长依赖性的宽频带的非共振CARS光。这些共振CARS光和非共振CARS光相互相干且干涉。实际在试样的分子种类的确定中需要的是共振CARS光的光谱即拉曼光谱，所以需要从所取得的CARS光的光谱取得拉曼光谱的信号处理。关于该信号处理已知有一些方法(参照非专利文献5)，例如通过从强度光谱恢复相位光谱的方法即最大熵法进行数学计算，求出共振项的复数部分。
另外，激励光、斯托克斯光、CARS光的频率的关系如图16所示。具有规定的频率的激励光和处于比其小的频域中的斯托克斯光向试样入射，在比激励光大的频域中产生CARS光。
CARS显微镜对于如上述那样求出的拉曼光谱，改变将激励光、斯托克斯光聚光的位置而进行多次测定，结果取得每个分子种类的空间分布的图像。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：W.Denk et al.，“Two－Photon Laser Scanning FluorescenceMicroscopy，”Science，Volume 248，Issue 4951，pp.73－76(1990)
非专利文献2：P.J.Campagnola et al.，“Second－harmonic imagingmicroscopy for visualizing biomolecular arrays in cells，tissues and organisms，”Nature Biotechnology 21，1356－1360(2003)
非专利文献3：M.Okuno et al.，“Quantitative CARS Molecular fingerprinting of living Cells，”Angewandte Chemie International Edition 49，6773－6777(2010)
非专利文献4：B.G.Saar et al.，“Video－Rate Molecular Imaging in Vivowith Stimulated Raman Scattering，”Science Vol.3301368(2010)
非专利文献5：J.P.R.Day，K.F.Domke，G.Rago，H.Kano，H.Hamaguchi，E.M.Vartiainen，and M.Bonn“Quantitative Coherent Anti－Stokes Scattering(CARS)Microscopy，”J.Phys.Chem.B，Vol.115，7713－7725(2011)
发明概要
发明要解决的问题
以上所述的荧光共焦点显微镜、非线性光学显微镜的共同点是将试样的物质种类及特定构造的分布可视化。相反，不能得到试样的光学特性，即折射率、透射率等基本信息。当观察细胞等生物体试样时，不仅需要通过非线性光学显微镜或荧光共焦点显微镜得到的物质分布的信息，而且在更详细的试样的解析中有时需要折射率及透射率的信息。因此，以往在这些显微镜观察时，辅助性地并用以往以来使用的明视野显微镜及相位差显微镜等。但是，这些显微镜观察不会给出定量的折射率、透射率分布，最多是掌握试样的形状的程度的辅助性的观察。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的是提供一种给出试样的物质种类或特定构造的分布、和折射率或透射率等光学特性的定量分布的显微镜。
用于解决问题的手段
为了达到本发明的目的，采用了以下技术方案。
(1)具备：短脉冲激光器等光源；分束器等第一光分割机构，将来自光源的输出光光通量分割为第一激励光通量和第二激励光通量；光子晶体光纤等斯托克斯光源，被输入上述第二激励光通量，输出斯托克斯光通量；分色镜等合波机构，将上述第一激励光通量与上述斯托克斯光通量进行合波，生成合波光通量；物镜透镜等第一聚光机构，将上述合波光通量聚光到试样中；分光器等第一检测器，检测从上述试样中产生的与合波光通量不同波长的CARS光；分光器等第二聚光机构，向上述第一检测器引导CARS光；无偏振分束器等第二光分割机构，将上述第一激励光通量和上述斯托克斯光通量中的至少一方的光通量的一部分作为参照光通量进行分支；无偏振分束器等第二合波机构，将来自试样的光通量与上述参照光通量进行合波，生成干涉光；以及分光器等第二检测器，检测上述干涉光。
由此，通过CARS光的检测，能够取得试样中的物质种类的定量分布，并取得试样的折射率分布，能够从试样取得比以往多的信息。
(2)在(1)中，上述斯托克斯光源是使上述斯托克斯光通量的波长连续地可变的光参量振荡器等。
由此，不需要在检测CARS光的检测器或检测干涉光的检测器中将波长分光，能够构成结构简洁的检测器。
(3)在(1)中，上述斯托克斯光源是生成与上述第二激励光通量相比波长为宽频带的上述斯托克斯光通量的光子晶体光纤等。
由此，在检测CARS光的检测器中能够使用分光器同时取得多个波长的信息，有助于数据取得的高速化。
(4)在(2)或(3)中，上述参照光通量和来自上述试样的光通量分别包含斯托克斯光。
由此，能够将试样的光轴方向的折射率分布一起测定，有助于数据取得的高速化。
(5)在(4)中，上述斯托克斯光通量的光通量直径比由上述合波机构合波的激励光的光通量直径小。
由此，能够同时实现以高效率生成CARS信号、和在更大范围中一起取得试样的光轴方向的折射率分布。
(6)在(4)中，具有使上述斯托克斯光的光通量直径可变的相位调制元件等光通量可变机构。
由此，能够同时实现以高效率生成CARS信号、以高效率生成干涉光、和在更大范围中一起取得试样的光轴方向的折射率分布。
(7)在(1)中，具有：λ/4板等第一偏振变换机构，使上述参照光的偏振任意地可变；以及λ/4板等第二偏振变换机构，使上述斯托克斯光的偏振任意地可变。
由此，通过干涉光的检测，不仅能够测定试样的折射率分布，还能够测定多折射的分布，能够从试样取得更多的信息。
(8)在(4)中，上述第一检测器和上述第二检测器是同一分光器。
由此，能够减少通常为大型的分光器的件数，有助于显微镜的简洁化。
(9)在(1)中，具备检测通过激励光通量的照射而从试样中产生的SHG的第三检测器、和检测双光子荧光的第四检测器的至少一方。
由此，能够从试样取得更多的信息。
发明效果
能够提供针对观察对象能够取得比以往更详细的信息的光学显微镜。
附图说明
图1是表示本发明的基本的实施方式的图。
图2是表示激励光和斯托克斯光的束形状的图。
图3是表示将斯托克斯光的束径切换的实施方式的图。
图4是液晶相位调制器的详细图。
图5是将斯托克斯光的束径切换的实施方式的数据取得的框图。
图6是表示将斯托克斯光的束径切换的其他实施方式的图。
图7是表示使用波长扫掠光源的实施方式的图。
图8是表示从试样取得多折射的信息的实施方式的图。
图9是表示将来自试样的斯托克斯光的反射光不分光而检测的实施方式的图。
图10是表示将来自试样的激励光的反射光不分光而检测的实施方式的图。
图11是表示将来自试样的激励光、斯托克斯光的合波光通量的反射光不分光而检测的实施方式的图。
图12是表示将CARS信号和OCT信号用同一分光器取得的实施方式的图。
图13是表示将图1的结构的一部分用光纤置换的情况下的结构图。
图14是表示共振CARS光的产生的能量图。
图15是表示非共振CARS光的产生的能量图。
图16是表示激励光、斯托克斯光、CARS光的频率的关系的图。
图17是检测与向试样入射的光相反方向上产生的CARS光的情况下的结构图。
图18是作为斯托克斯光而使用宽频带激光光源的情况下的结构图。
图19是作为斯托克斯光而使用将与激励光源不同的激光光源的光向光子晶体光纤入射得到的超连续谱光的情况下的结构图。
图20是除了激励光、斯托克斯光以外还使用探测光的情况下的结构图。
图21是将激励光、斯托克斯光的聚光位置使用电流镜(galvano-mirror)扫描的情况下的结构图。
图22是表示除了CARS信号、OCT信号以外还检测SHG、双光子荧光的实施方式的图。
图23是SHG、双光子荧光的能量图。
图24是检测SGH、双光子荧光的透射成分的结构图。
具体实施方式
实施例1
图1是表示本发明的光学显微镜的基本实施方式的图。以下，按照图1说明动作。
从根据来自计算机11的指示而被驱动器10发光控制的短脉冲激光光源101射出的激光被分束器102二分割为作为激励光的透射光和反射光。反射光被聚光透镜103结合到光子晶体光纤104上，在光纤内部生成宽频带的超连续谱光。所生成的超连续谱光通过准直透镜105成为平行光后，穿过长通滤波器106而短脉冲激光光源的波长和比其短的波长的成分被阻断，通过无偏振分束器107被分支为作为斯托克斯光的透射光和作为参照光的反射光。其中斯托克斯光与上述激励光被分色镜108合波。这里，分色镜108具有将激励光的波长和比其短的波长域的光反射、将比激励光长的波长域的光透射的性质。因而，激励光反射，斯托克斯光透射，结果被合波。该合波光通量通过物镜透镜109被聚光到试样110的一点，生成反映了在试样的聚光部位存在的分子的共振振动的CARS光。CARS光通过聚光透镜111成为平行光，穿过短通滤波器112而作为同轴成分的激励光和斯托克斯光被阻断后，向分光器113入射，作为检测信号而输出光谱。对该检测信号实施用来除去非共振背景的规定的信号处理，得到与试样中的分子的共振光谱(拉曼光谱)对应的信号。以下将该输出信号称作CARS信号。取得CARS信号的详细情况记载在非专利文献3中。
另一方面，斯托克斯光在聚光位置附近按照试样的折射率分布而产生反射光。该反射光与入射到试样的斯托克斯光的光路同轴地向反方向行进，在穿过分色镜108后在无偏振分束器107上反射(虽然还产生透射成分，但在这里忽视)。此外，参照光在反射镜114上反射，沿着反向的光路，透射分束器107(虽然还产生反射的成分，但在这里忽视)。于是，参照光和来自试样的斯托克斯光的反射光为同轴而成为干涉光，向分光器115入射，作为检测信号而输出波长光谱。该检测信号被进行傅立叶变换，成为表示试样中的被照射斯托克斯光的区域中的焦点深度内的折射率分布的信号而被输出。这与通过周知为光学相干层析成像(Optical Coherence TomographyOCT)的计测方法得到的信号相等，以下称作OCT信号。OCT的测定原理例如叙述在非专利文献6等中。
这里，计算机11发送使搭载有试样110的压电台(piezo stage)12的位置变位的信号，取得从试样的各位置产生的上述CARS信号和OCT信号。这样反复取得的OCT信号和CARS信号发送至计算机11，与试样的位置信息相应地变换为图像数据，在监视器13上显示图像。此时，通过一系列的OCT信号显示试样的折射率分布的图像，通过一系列的CARS信号显示试样的每个分子种类的分布图像。对将试样也就是压电台12进行扫描的方向而言，根据想要取得的信息，可以是1维、2维、3维的任何一种。例如如果3维地扫描，则能够得到各分子种类和折射率的3维分布图像。由于这些图像数据能够作为定量的数据来处理，所以将作为图像的来源的数值数据保存到计算机11中。
这里，使用图2对激励光和斯托克斯光的束径进行说明。在本实施例中，激励光的束径设定得比斯托克斯光的束径大，激励光的束径设定为与物镜透镜109的有效径同等程度以上。因而，如图2(a)所示处于以下状态：激励光的光量分布在物镜透镜109的有效径内的可达的地方，斯托克斯光的光量仅分布在有效径内的中心附近。此时，激励光被聚光为由物镜透镜109的数值孔径决定的衍射极限的光斑尺寸左右，相对于此，斯托克斯光实质上与用更小的数值孔径的透镜聚光的情况相同。因而，焦平面(聚光位置)上的光斑尺寸与数值孔径成反比例，所以如图2(b)所示，激励光的光斑尺寸比斯托克斯光的光斑尺寸小。此外，由于焦点深度与数值孔径的平方成反比例，所以如图2(c)所示，斯托克斯光的焦点深度比激励光的焦点深度长。CARS光的强度与激励光强度的平方成比例，与斯托克斯光强度成比例。因而，CARS光仅从激励光与斯托克斯光重叠的区域被射出。通常，将激励光和斯托克斯光都以较高的数值孔径聚光，所以激励光的焦点深度内的区域和斯托克斯光的焦点深度内的区域大致一致，仅从这些区域发出CARS光，在本实施例的情况下也仅从同程度的较窄的区域发出CARS光，所以通过将焦点位置使用压电台12进行扫描，能够取得1维、2维或3维的分子种类的定量分布。另外，由于斯托克斯光的在焦平面上的扩散比激励光大，所以斯托克斯光的焦点深度内的能量密度比以与激励光同等的数值孔径聚光时小，相应地CARS信号的发生效率被限制，但由于如上述那样CARS光的生成效率与激励光强度的平方成比例，所以通过入射充分的强度的激励光，能够生成充分的强度的CARS光。另一方面，斯托克斯光的反射光如上述那样用于焦点深度内的(以光轴方向的位置为变量的)折射率分布的测定。这里，斯托克斯光的焦点深度相应于将斯托克斯光的数值孔径设定得较小而变大，通过将数值孔径设定得较小，能够测定更大范围的折射率分布。相反，为了高效地生成CARS光，激励光的数值孔径通常设为1左右，如果以相同程度的数值孔径将斯托克斯光聚光，则焦点深度成为与斯托克斯光的波长相同程度，不仅通过一次测定而能够取得的折射率分布的(光轴方向的)范围显著地变小，而且因焦点深度较小而反射光量显著地变小，折射率分布的测定变得困难。这样，通过将斯托克斯光的数值孔径设定得比激励光小，能够有效地进行折射率分布的测定，并且将CARS信号也能够以充分的分辨率和灵敏度取得。
在本实施例中，如已经在上面叙述的那样，能够将细胞等试样的分子种类的分布和折射率分布作为图像取得。进而，通过将这些图像连续取得，能够将细胞等的随时间的变化作为时间推移(time-lapse)图像取得。在此情况下，将多个图像数据保存到计算机11内，将它们作为时间变化而在监视器13上进行运动图像显示或逐帧播放图像显示。此外，将这些随时间变化的图像总括起来作为1个数据保存到计算机11内。
在本实施例中，通过调节准直透镜105的焦点距离，使斯托克斯光的束径比激励光的束径小，实现了相对小的数值孔径，但实质上使数值孔径变小的方法并不限于此，例如也可以通过在准直透镜105的紧后设置开口限制，来使束径变小到开口的尺寸而实现实质上较小的数值孔径。此外，束径的定义例如也可以为半值全幅，在激励光、斯托克斯光接近于高斯束的情况下，也可以为用高斯函数拟合时的峰值的e^－2的宽度。在哪种情况下，激励光和斯托克斯光的定义都应当一致。
另外，本实施例除了光子晶体光纤以外，构成为在自由空间上配置光学系统，但作为安装形态，也可以将一部分用光纤置换。例如，图13是将与图1的结构同样的功能使用光纤构成的实施方式。在此情况下，作为短脉冲激光光源101而使用输出在光纤中导波的光源，代替分束器102、无偏振分束器107而分别使用光纤耦合器1601、1602，向光子晶体光纤104的光的输入输出通过将光纤直接接合来进行。对于以下的实施例也同样，也可以将光学系统的一部分用光纤置换。
在本实施例中，作为生成宽频带的光的手段而使用光子晶体光纤，但也可以使用能够生成同样的超连续谱光的高非线性光纤。
在本实施例中，构成为作为CARS光而检测在与激励光、斯托克斯光相同的行进方向上射出的成分的所谓透射型的结构，但CARS光还存在向与激励光、斯托克斯光反方向射出的成分，也可以是反射型的结构。在此情况下，如图17所示，使由物镜透镜109产生的CARS光成为平行光，通过分色镜1701仅将CARS光反射，通过分光器113检测。分色镜1701具有使激励光、斯托克斯光的波长成分透射、将CARS光的波长成分反射的性质。因而，来自分色镜108的激励光、斯托克斯光透射，从试样反射的斯托克斯光透射，CARS光反射，所以通过这样的结构，能够取得CARS信号和OCT信号。但是，也可以代替分色镜1701而使用无偏振分束器等。在此情况下，在分光器115、113中会入射希望的波长成分以外的光，为了在这些分光器中将波长成分分离而检测，可以将不需要的成分除去。
在本实施例中，作为斯托克斯光而使用将激励光源的一部分向光子晶体光纤104入射而产生的超连续谱光，但实际并不限于此，例如也可以如图18若是使用飞秒激光1801的输出。另外，由驱动器10进行控制，以使短脉冲光源101和飞秒激光1801的脉冲发光的定时成为同时。
进而，向光子晶体光纤104入射的光并不需要与激励光源相同，例如也可以如图19所示，准备其他的短脉冲激光光源1901，使通过驱动器10与短脉冲激光光源101同步(以相同的定时)发光的光向光子晶体光纤104入射。
在本实施例中，向试样入射的光只是激励光、斯托克斯光，但如开头中叙述的那样，CARS光一般通过入射激励光、斯托克斯光、探测光这3种光来得到，所以也可以如图20所示追加准备短脉冲激光光源2001，将与短脉冲激光光源同步发出的光作为探测光追加照射试样。在此情况下，探测光的频率是任意的，由分色镜2002、108与激励光、斯托克斯光合波，被聚光到试样的一点。其中，作为合波的方法，也可以代替分色镜2002而使用无偏振分束器等。
此外，在本实施例中，为了激励光、斯托克斯光的聚光位置的扫描而使用压电台12，但扫描方法并不限于此，例如在面内方向上扫描的情况下也可以使用如图21所示配置在物镜透镜109的前段的电流镜2101进行扫描。电流镜是由两个反射镜构成、分别通过来自外部的驱动控制而旋转、结果能够将在两个反射镜上反射的激光的光轴方向进行2维扫描的元件。此外，作为试样的深度方向的扫描，也可以将物镜透镜109在光轴方向上搭载于压电台等上而在深度方向上扫描。
非专利文献6：M.Wojtkowski et al.，“Full range complex spectral opticalcoherence tomography technique in eye imaging，”Optics Letters，Vol.27，Issue16，pp.1415－1417(2002)
实施例2
本实施例是将实施例1的CARS信号的检测和OCT信号的检测分时地进行的另一实施方式。图3表示本实施例的结构图。本结构与实施例1的差异是，在斯托克斯光的光路中的准直透镜105的紧后插入了液晶开口元件301。液晶开口元件为如图4所示的构造，为液晶调制元件401和起偏镜(polarizer，偏振器)402成为一体的结构。液晶调制元件401对于规定的圆形开口的外侧的区域，能够通过驱动电压的有无来选择使入射光的偏振(这里假设为水平偏振)旋转90度还是不变化。此外，在圆形开口内的区域，与驱动电压无关，入射光不改变偏振而原样穿过。此外，起偏镜402是使水平偏振光穿过而将垂直偏振光遮挡的元件。因此，当没有进行电压驱动时(驱动电压为0V时)，入射光原样穿过，当进行了电压驱动时(这里假设驱动电压为5V时)圆形开口区域内的光穿过。即，通过驱动电压的有无，能够使斯托克斯光的束径以及实质的数值孔径变化。在本实施例中，使用该元件按照图5所示的次序进行数据取得。即，将电压设定为0V，在斯托克斯光的数值孔径较高的状态下进行CARS信号的取得，然后将电压设定为5V，在将斯托克斯光的数值孔径降低的状态下进行OCT信号的取得。并且，通过使聚光位置变化而重复同样的信号取得，取得基于CARS信号的每个化学种类的分布和基于OCT信号的折射率分布。根据本实施例，取得CARS信号时的斯托克斯光的数值孔径较高，与实施例1相比能够高效率地得到CARS信号。
本实施例的方法并不一定需要使用液晶调制元件401，例如使用如图6所示的结构也能够实现。在此情况下，穿过了准直透镜105的斯托克斯光在穿过液晶λ/2板601后向偏振分束器602入射。这里，液晶λ/2板是在驱动电压0V时不改变入射光的偏振(这里是水平偏振)、在驱动电压5V时使入射光的偏振旋转90度(即成为垂直偏振)元件。偏振分束器602由于使水平偏振光透射而将垂直偏振光反射，所以当驱动电压为0V时，斯托克斯光透射偏振分束器602，当驱动电压为5V时，斯托克斯光在偏振分束器602上反射。来自偏振分束器602的透射光与实施例1同样被无偏振分束器107二分割后，透射偏振分束器603而被向试样110照射，反射光被分光器115作为OCT信号检测出。这里，斯托克斯光的束径被设定为比物镜透镜109的有效径小，与实施例1同样以较低的数值孔径向试样照射。另一方面，来自偏振分束器602的反射光在穿过长通滤波器106后由光束扩展器603扩大束径后，在偏振分束器604上反射而向试样110照射，与激励光一起生成CARS光，该CARS光与实施例1同样被分光器113检测出。这里，通过光束扩展器603使斯托克斯光的束径与物镜透镜的有效径相比成为相同程度以上，以较高的数值孔径聚光到试样110。因而，液晶λ/2板601实质上起到与液晶调制元件401同样的作用，按照图5的框图，能够取得CARS信号和OCT信号。
实施例3
本实施例是作为斯托克斯光而使用波长扫掠光源的情况下的实施方式。图7中表示本实施例的结构图。本实施例的结构基本上与实施例1相同，但作为斯托克斯光而使用光参量振荡器701的输出这一点、和检测CARS光和斯托克斯光的不是分光器而是将接受的全光量变换为电信号的检测器这一点不同。光参量振荡器701具有对激励光的波长进行变换的作用，能够将输出的光的波长连续地调谐。在数据取得时连续地进行波长扫掠，将某个时间点的对于设定波长的检测器702、703的输出与实施例1的分光器113、115的某个波长的输出信号建立对应而取得数据。具有这样的波长扫掠光源的CARS信号、OCT信号的取得分别在非专利文献7、非专利文献8中叙述。
非专利文献7：S，Begin et al.，“Coherent anti－Stokes Raman scatteringhyperspectral tissue imaging with a wavelength－swept system，”BiomedicalOptics Express，Vol.2，Issue 5，pp.1296－1306(2011)
非专利文献8：Y.Yasuno et al.，“Three－dimensional and high－speedswept－source optical coherence tomography for in vivo investigation of humananterior eye segments，”Optics Express，Vol.13，Issue 26，pp.10652－10664(2005)
实施例4
本实施例是通过OCT检测调查试样的多折射的状态的另一实施方式。图8中表示本实施例的结构。在本实施例中，液晶λ/2板801、液晶λ/4板802被插入在准直透镜105与无偏振分束器107之间，液晶λ/4板803、液晶λ/8板804被插入在无偏振分束器107与反射镜114之间。这里，通过液晶λ/2板801、液晶λ/4板802、液晶λ/4板803、液晶λ/8板804的驱动电压的组合，能够将参照光和斯托克斯光的反射光的(即将被合波之前的)偏振状态设定为水平偏振、垂直偏振、45度直线偏振，右圆偏振中的某一种。在本实施例中，进行这些偏振状态的组合共计4×4＝16种测定，根据各自的取得数据通过以下的运算来合成多折射分布。
[数式3]
m = M 00 M 01 M 02 M 03 M 10 M 11 M 12 M 13 M 20 M 21 M 22 M 23 M 30 M 31 M 32 M 33 = 1 2 I HH + I HV + I VH + I VV I HH + I HV - I VH - I VV I HH - I HV + I VH - I VV I HH - I HV - I VH + I VV 2 I HD + 2 I VD - M 00 2 I HD - 2 I VD - M 01 2 I HR + 2 I VR - M 00 2 I HR - 2 I VR - M 01 2 I DH + 2 I DV - M 00 2 I RH + 2 I RV - M 00 2 I DH - 2 I DV - M 10 2 I RH - 2 I RV - M 10 4 I DD - 2 I DH - 2 I DV - M 20 4 I RD - 2 I RH - 2 I RV - M 20 4 I DR - 2 I DH - 2 I DV - M 30 4 I RR - 2 I RH - 2 I RV - M 30
这里，H、V、D、R分别表示水平偏振、垂直偏振、45度直线偏振、右圆偏振，最前面的脚标表示参照光的偏振状态，第2个脚标表示斯托克斯光的反射光的偏振状态。例如，如果是IHV，则是参照光的偏振状态为H、斯托克斯光的偏振状态为V的情况下的OCT信号的输出。该测定的原理的详细情况记述在专利文献1中。由数式3表示的矩阵周知为穆勒矩阵，该矩阵自身是将多折射定量地表示的。在实际的测定中，在将激励光和斯托克斯光设定在规定的聚光位置的状态下进行上述16种OCT测定，此外作为CARS信号而仅在斯托克斯光为水平偏振(与激励光相同的偏振状态)时进行检测(共计4种组合)，将这些信号之和作为希望的CARS信号。并且，在这16种组合的测定结束后，使聚光位置变化而重复同样的测定。这样，能够取得基于OCT信号的多折射的分布、和基于CARS信号的分子种类的分布。
专利文献1：特许第4045140号
实施例5
本实施例是将照射在试样上的光的反射光不分光而检测的另一实施方式。图9中表示本实施例的结构图。基本上，与实施例1的差异是斯托克斯光的数值孔径被设定为与激励光相同程度这一点、和来自试样的斯托克斯光的反射光不是由分光器检测、而是由检测总光量的检测器901检测这一点。在此情况下，如上述那样相应于斯托克斯光的数值孔径较高而焦点深度内的区域变窄，所以反射光量变小，但由于来自不同物质间的界面(例如细胞膜等)的反射光在这样的结构中也以充分的强度产生反射光，所以也能够取得反射光。因而，通过将聚光位置进行扫描，能够将基于CARS信号的分子种类的分布及所观测的试样的界面分布(例如细胞的轮廓等)可视化。另外，在这样的反射光的检测中，光源不一定需要是宽频带，例如即使如图10所示将激励光用无偏振分束器107二分割、使来自试样的激励光的反射光与来自反射镜114的反射光干涉而检测，也能够取得同样的信号。或者，也可以如图11所示，使用将激励光与斯托克斯光合波而得到的光通量进行同样的检测。此外，斯托克斯光并不一定需要是宽频带，例如也可以代替光子晶体光纤104而使用实施例3的参量振荡器，不是进行波长扫掠而以固定的波长使用。
实施例6
本实施例是使实施例1的分光器113、115共通化的实施方式。图12中表示本实施例的结构图。在本实施例的情况下，将与实施例1同样生成的干涉光和CARS光通过分色镜1201被合波，并入射至分光器113。由于CARS光和干涉光(斯托克斯光)的光谱基本上不发生重叠，所以能够在分光器的输出中的规定的波长域中取得CARS信号，在其他波长域中取得OCT信号。
实施例7
本实施例是除了CARS信号、OCT信号以外还同时取得SHG、双光子荧光的实施方式。图22中表示本实施例的结构。在本实施例中，当将激励光聚光到试样而照射时，除了CARS光以外还产生SHG、双光子荧光。在本实施例中，将SHG、双光子荧光的发光中的反射成分、即向与激励光反方向行进的发光成分利用物镜透镜109变为平行光，这些光通量由分色镜2201反射，向分色镜2202入射。这里，分色镜2202具有将SHG的波长成分反射、使双光子荧光的波长成分透射的性质，分离SHG和双光子荧光分。分离后的SHG和双光子荧光的光通量分别被不同的检测器2203、2204检测出。因此，与实施例1同样，通过将试样中的聚光位置进行扫描，能够分别取得CARS显微镜映像、OCT映像、SHG映像、双光子荧光映像。
图23中表示SHG和双光子荧光的能量图。SHG是入射光不经由实际次序(即不伴随吸收)而发出2倍的频率(即波长为一半)的光的过程。双光子荧光是入射的光通过双光子吸收过程被吸收、在缓和过程后发出荧光的过程，荧光的频率比入射光的频率的2倍稍小。由于它们分别根据试样的构造和分子种类而有选择地发光，所以用于生物体试样等的观察。通过与CARS信号、OCT信号一起取得这些映像，能够从试样取得更多的信息(关于双光子荧光、SHG的详细情况分别参照非专利文献1、非专利文献2)。
另外，在本实施例中将SHG、双光子荧光的映像都取得，但也可以将某一方省略。此外，在本实施例中，SHG、双光子荧光都是反射型的结构，但由于与CARS信号同样，还包含向与激励光相同方向发出的成分(透射成分)，所以也可以通过如图24所示的结构，在物镜透镜111的后级配置分色镜2401，检测SHG和双光子荧光的透射成分。在此情况下，分色镜2401是使CARS信号的波长成分透射而将SHG、双光子荧光的波长成分反射的元件。
附图标记说明
101：短脉冲激光光源；102：分束器；103：聚光透镜；104：光子晶体光纤；105：准直透镜；106：长通滤波器；107：无偏振分束器；108：分色镜；109：物镜透镜；110：试样；111：聚光透镜；112：短通滤波器；113：分光器；114：反射镜；115：分光器；301：液晶调制元件；401：液晶λ/2板；402：起偏镜；601：液晶λ/2板；602：偏振分束器；603：光束扩展器；604：偏振分束器；701：光参量振荡器；702：检测器；703：检测器；801：液晶λ/2板；802：液晶λ/4板；803：液晶λ/4板；804：液晶λ/8板；901：检测器；1201：分色镜；1601：光纤耦合器；1602：光纤耦合器；1701：分色镜；1801：飞秒激光；1901：短脉冲激光光源；2001：短脉冲激光光源；2002：分色镜；2101：电流镜；2201：分色镜；2202：分色镜；2203：检测器；2204：检测器；2401：分色镜

Claims (13)

1.一种CARS显微镜，其特征在于，具有：
光源；
第一光分割机构，将来自光源的输出光光通量分割为第一激励光通量和第二激励光通量；
斯托克斯光源，被输入上述第二激励光通量，而输出斯托克斯光通量；
合波机构，将上述第一激励光通量与上述斯托克斯光通量进行合波，生成合波光通量；
第一聚光机构，将上述合波光通量聚光到试样中；
第一检测器，检测从上述试样中产生的与合波光通量不同波长的相干反斯托克斯拉曼散射光即CARS光；
第二聚光机构，向上述第一检测器引导CARS光；
第二光分割机构，将上述第一激励光通量和上述斯托克斯光通量中的至少一方的光通量的一部分作为参照光通量进行分支；
第二合波机构，将来自试样的光通量与上述参照光通量进行合波，生成干涉光；以及
第二检测器，检测上述干涉光。
2.如权利要求1所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述斯托克斯光源使上述斯托克斯光通量的波长连续地可变。
3.如权利要求1所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述斯托克斯光源生成与上述第二激励光通量相比波长为宽频带的上述斯托克斯光通量。
4.如权利要求2或3所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述参照光通量和来自上述试样的光通量分别包含斯托克斯光。
5.如权利要求4所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述斯托克斯光通量的光通量直径比由上述合波机构合波的激励光的光通量直径小。
6.如权利要求4所述的CARS显微镜，其特征在于，
具有使上述斯托克斯光的光通量直径可变的光通量可变机构。
7.如权利要求1所述的CARS显微镜，其特征在于，具有：
第一偏振变换机构，使上述参照光的偏振任意地可变；以及
第二偏振变换机构，使上述斯托克斯光的偏振任意地可变。
8.如权利要求4所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述第一检测器和上述第二检测器是相同的分光器。
9.如权利要求1所述的CARS显微镜，其特征在于，
具备第三检测器和第四检测器中的至少一方，上述第三检测器检测通过激励光通量的照射而从试样中产生的SHG，上述第四检测器检测双光子荧光。
10.如权利要求1所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述第二光分割机构和上述第二合波机构是同一无偏振分束器。
11.如权利要求1所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述斯托克斯光通量的数值孔径与由上述合波机构合波的激励光的数值孔径大致相同。
12.一种CARS显微镜，其特征在于，具有：
生成激励光的机构；
生成斯托克斯光的机构；
将上述激励光与上述斯托克斯光进行合波并向试样照射的机构；
检测从上述试样产生的相干反斯托克斯拉曼散射光即CARS光的CARS光检测器；
从上述激励光或上述斯托克斯光的一部分生成参照光的机构；
将上述参照光与来自上述试样的光进行合波而生成干涉光的机构；以及
检测上述干涉光的干涉光检测器。
13.如权利要求12所述的CARS显微镜，其特征在于，
上述CARS光和上述干涉光分时地被检测出。
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