CN104693834B - 一种柿子果实色素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柿子果实色素的制备方法，包括下述步骤:原料处理、高压微射流超微粉碎处理、发酵处理、萃取、大孔树脂柱层析、聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶柱层析对色素液进行吸附纯化、采用制备型液相色谱进行柿子果实色素的分离纯化，能有效除去色素液中水溶性杂质，实现色素单体的初步分离，能够有效实现柿子果实色素单体的分离，保证了产品的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物天然色素的制备方法，具体涉及一种柿子果实色素的制备方法。
背景技术
天然色素是由天然资源获得的食用色素。主要从动物和植物组织及微生物(培养)中提取的色素，其中植物性着色剂占多数。天然色素不仅具有给食品着色的作用，而且，相当部分天然色素具有生理活性。
柿(Diospyros.kaki.L)，又名猴枣，朱果，柿树为多年生落叶果树。柿属柿树科(Ebenaceae)柿属(Diospyros.kaki.L)植物，本属植物全世界约有500余种，大多数为热带或亚热带植物，少数产于暖温带。柿子是柿树科浆果类温带落叶果树，原产我国，在我国已有一千多年的种植历史。我国是柿子的原产地，原产于我国的柿属植物现有66种，多数分布于海南岛、广东、广西、福建、云南等省(自治区)的热带和亚热带地区，长江以南的暖热带也有少量分布。不仅分布广，产量也高，2005年我国柿子产量为183.7万吨，占世界柿子产量的71.5％。目前我国种植面积最大，而且柿果产量最多。柿子是我国重要的水果，产量较大，目前柿子主要作为鲜果食用或用于制造柿饼，在加工中有大量的残次果或副产物，这些残次果或加工副产物大部分被作为废料丢弃，这不仅造成了资源的极大浪费，也给环境造成负担。柿子果实、果皮含有丰富的天然色素，有望获得高提取率、高纯度、高色价的产品，以满足国内外市场对天然色素的需求。
天然色素(Natural Pigments)的开发与应用己成为各行业科技工作者普遍关注的课题。人们试图从各种动植物资源中获取天然色素，同时探索其生理活性，来缓解并解决由合成色素所带来的各种问题。如中国专利CN103013164A，公开了一种柿子皮提取天然色素的方法，以生产柿饼时拨出的皮为原料，利用逆流提取结合大孔吸附树脂分离提取分离柿子皮色素，逆流提取运用加热的溶剂逆向对柿子皮原料进行提取，利用大孔吸附树脂可以选择性吸附天然色素成分，但该方法得到的色素含量较低。对科技的研究是无止境的，天然色素的巨大市场前景推动着研究的进一步发展。
发明内容
本发明提供了一种柿子果实色素的制备方法，可以得到含量98％以上的柿子果实色素。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种柿子果实色素的制备方法，包括下述步骤：
1)原料处理：将柿子清洗、破碎；
2)高压微射流超微粉碎处理：将破碎后的柿子，按照1:5-6的重量比加入纯净水，用高速剪切乳化机处理10-20min，转速为8000-12000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为80-120MPa，处理次数为2-3次，得到膏状浆液；
3)发酵：将步骤2)得到的膏状浆液经过超高温瞬时灭菌，然后调整pH6.5-7.0，按体积百分比为10-15％接入培养成熟的乳酸菌液体菌种，放入发酵罐中发酵，发酵温度在35-37℃，发酵时间3-4h；
4)萃取：步骤3)得到的发酵液经过超高温瞬时灭菌，用与发酵液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，取水层，真空浓缩除去乙酸乙酯，反复数次直至乙酸乙酯层无色；
5)大孔树脂吸附纯化：选用HP-20大孔树脂，经预处理后湿法上柱，用稀盐酸调色素液pH至3.5，用恒流泵控制色素液通过吸附柱，待流出液吸光值为上样液吸光值的10％后停止加入色素液，用纯水分数次清洗树脂表面，以pH为3.5的质量分数为90％的乙醇溶液为洗脱剂洗脱色素液，得到的色素液真空浓缩除去乙醇，得到初步纯化色素液；
6)聚酰胺层析柱吸附纯化：聚酰胺经预处理后湿法装柱，步骤5)得到的初步纯化色素液过聚酰胺层析柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
7)葡聚糖凝胶柱吸附纯化：葡聚糖凝胶经预处理后湿法装柱，步骤6)得到的纯化样品过葡聚糖凝胶柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
8)制备型液相色谱分离纯化：采用制备型液相色谱对浓缩后的色素液分离纯化，得到柿子果实色素液；
9)干燥：采用冷冻干燥，去除色素液的水分，得到柿子果实色素。
本发明步骤3)中乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳脂链球菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌。
步骤8)所述制备型液相色谱分离纯化，工作条件为：菲罗门LUNA-C18色谱柱，4.6mmX150mmX5μ，进样量lOμL，流速0.4mL/min，扫描范围：254nm-600nm，检测波长520nm，流动相4.5％甲酸A，甲醇B，梯度洗脱条件：Omin,10％B；20min,25％B；33min,45％B；40min,90％B；45min,10％B。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明通过使用高压微射流超微粉碎技术处理柿子原料，利用高压微射流超微粉碎设备产生挤压力、剪切力、冲击力，经过液-液、液-固之间的高速撞击、高剪切、空穴作用等，使物料的分子结构发生变化。高压微射流超微粉碎设备可以做到纳米分散，细化效果可达0.lum甚至以下，压力高达100-200MPa，得到的溶液颗粒粒径分布均匀，具有操作简单、无污染、可在线清洁消毒、可高效率进行细胞破壁等诸多优点。
2、本发明在酶解前采用乳酸菌来处理，具有促进蛋白质、多糖等大的分子分解，促进柿子果实色素的溶出，一方面缩短了提取时间，另一方面提高了产品得率。
3、本发明采用大孔树脂柱层析，聚酰胺柱层析，葡聚糖凝胶柱层析对色素液进行吸附纯化，能有效除去色素液中水溶性杂质，实现色素单体的初步分离。
4、采用制备型液相色谱进行柿子果实色素的分离纯化，能够有效实现柿子果实色素单体的分离，保证了产品的纯度。
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：
一种柿子果实色素的制备方法，包括下述步骤：
1)原料处理：将10kg柿子清洗、破碎；
2)高压微射流超微粉碎处理：将破碎后的柿子，加入纯净水50kg，用高速剪切乳化机处理10min，转速为12000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为120MPa，处理次数为3次，得到膏状浆液；
3)发酵：将步骤2)得到的膏状浆液经过超高温瞬时灭菌，然后调整pH7.0，按体积百分比为10％接入培养成熟的保加利亚乳杆菌液体菌种，放入发酵罐中发酵，发酵温度在35-37℃，发酵时间4h；
4)萃取：步骤3)得到的发酵液经过超高温瞬时灭菌，用与发酵液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，取水层，真空浓缩除去乙酸乙酯，反复数次直至乙酸乙酯层无色；
5)大孔树脂吸附纯化：选用HP-20大孔树脂，经预处理后湿法上柱，用稀盐酸调色素液pH至3.5，用恒流泵控制色素液通过吸附柱，待流出液吸光值为上样液吸光值的10％后停止加入色素液，用纯水分数次清洗树脂表面，以pH为3.5的质量分数为90％的乙醇溶液为洗脱剂洗脱色素液，得到的色素液真空浓缩除去乙醇，得到初步纯化色素液；
6)聚酰胺层析柱吸附纯化：聚酰胺经预处理后湿法装柱，步骤5)得到的初步纯化色素液过聚酰胺层析柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
7)葡聚糖凝胶柱吸附纯化：葡聚糖凝胶经预处理后湿法装柱，步骤6)得到的纯化样品过葡聚糖凝胶柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
8)制备型液相色谱分离纯化：采用制备型液相色谱对浓缩后的色素液分离纯化，得到柿子果实色素液；工作条件为：菲罗门LUNA-C18色谱柱，4.6mmX150mmX5μ，进样量lOμL，流速0.4mL/min，扫描范围：254nm-600nm，检测波长520nm，流动相4.5％甲酸A，甲醇B，梯度洗脱条件：Omin,10％B；20min,25％B；33min,45％B；40min,90％B；45min,10％B；
9)干燥：采用冷冻干燥，去除色素液的水分，得到柿子果实色素。
实施例2：
一种柿子果实色素的制备方法，包括下述步骤：
1)原料处理：将10kg柿子清洗、破碎；
2)高压微射流超微粉碎处理：将破碎后的柿子，加入纯净水60kg，用高速剪切乳化机处理20min，转速为10000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为100MPa，处理次数为2次，得到膏状浆液；
3)发酵：将步骤2)得到的膏状浆液经过超高温瞬时灭菌，然后调整pH6.5，按体积百分比为12％接入培养成熟的嗜酸乳杆菌液体菌种，放入发酵罐中发酵，发酵温度在35-37℃，发酵时间3h；
4)萃取：步骤3)得到的发酵液经过超高温瞬时灭菌，用与发酵液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，取水层，真空浓缩除去乙酸乙酯，反复数次直至乙酸乙酯层无色；
5)大孔树脂吸附纯化：选用HP-20大孔树脂，经预处理后湿法上柱，用稀盐酸调色素液pH至3.5，用恒流泵控制色素液通过吸附柱，待流出液吸光值为上样液吸光值的10％后停止加入色素液，用纯水分数次清洗树脂表面，以pH为3.5的质量分数为90％的乙醇溶液为洗脱剂洗脱色素液，得到的色素液真空浓缩除去乙醇，得到初步纯化色素液；
6)聚酰胺层析柱吸附纯化：聚酰胺经预处理后湿法装柱，步骤5)得到的初步纯化色素液过聚酰胺层析柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
7)葡聚糖凝胶柱吸附纯化：葡聚糖凝胶经预处理后湿法装柱，步骤6)得到的纯化样品过葡聚糖凝胶柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
8)制备型液相色谱分离纯化：采用制备型液相色谱对浓缩后的色素液分离纯化，得到柿子果实色素液；工作条件为：菲罗门LUNA-C18色谱柱，4.6mmX150mmX5μ，进样量lOμL，流速0.4mL/min，扫描范围：254nm-600nm，检测波长520nm，流动相4.5％甲酸A，甲醇B，梯度洗脱条件：Omin,10％B；20min,25％B；33min,45％B；40min,90％B；45min,10％B；
9)干燥：采用冷冻干燥，去除色素液的水分，得到柿子果实色素。
实施例3：
一种柿子果实色素的制备方法，包括下述步骤：
1)原料处理：将10kg柿子清洗、破碎；
2)高压微射流超微粉碎处理：将破碎后的柿子，加入纯净水50kg，用高速剪切乳化机处理15min，转速为8000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为80MPa，处理次数为2次，得到膏状浆液；
3)发酵：将步骤2)得到的膏状浆液经过超高温瞬时灭菌，然后调整pH7.0，按体积百分比为15％接入培养成熟的乳脂链球菌液体菌种，放入发酵罐中发酵，发酵温度在35-37℃，发酵时间4h；
4)萃取：步骤3)得到的发酵液经过超高温瞬时灭菌，用与发酵液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，取水层，真空浓缩除去乙酸乙酯，反复数次直至乙酸乙酯层无色；
5)大孔树脂吸附纯化：选用HP-20大孔树脂，经预处理后湿法上柱，用稀盐酸调色素液pH至3.5，用恒流泵控制色素液通过吸附柱，待流出液吸光值为上样液吸光值的10％后停止加入色素液，用纯水分数次清洗树脂表面，以pH为3.5的质量分数为90％的乙醇溶液为洗脱剂洗脱色素液，得到的色素液真空浓缩除去乙醇，得到初步纯化色素液；
6)聚酰胺层析柱吸附纯化：聚酰胺经预处理后湿法装柱，步骤5)得到的初步纯化色素液过聚酰胺层析柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
7)葡聚糖凝胶柱吸附纯化：葡聚糖凝胶经预处理后湿法装柱，步骤6)得到的纯化样品过葡聚糖凝胶柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
8)制备型液相色谱分离纯化：采用制备型液相色谱对浓缩后的色素液分离纯化，得到柿子果实色素液；工作条件为：菲罗门LUNA-C18色谱柱，4.6mmX150mmX5μ，进样量lOμL，流速0.4mL/min，扫描范围：254nm-600nm，检测波长520nm，流动相4.5％甲酸A，甲醇B，梯度洗脱条件：Omin,10％B；20min,25％B；33min,45％B；40min,90％B；45min,10％B；
9)干燥：采用冷冻干燥，去除色素液的水分，得到柿子果实色素。
结果：
Claims (2)
1.一种柿子果实色素的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)原料处理：将柿子清洗、破碎；
2)高压微射流超微粉碎处理：将破碎后的柿子，按照1:5-6的重量比加入纯净水，用高速剪切乳化机处理10-20min，转速为8000-12000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为80-120MPa，处理次数为2-3次，得到膏状浆液；
3)发酵：将步骤2)得到的膏状浆液经过超高温瞬时灭菌，然后调整pH6.5-7.0，按体积百分比为10-15％接入培养成熟的乳酸菌液体菌种，放入发酵罐中发酵，发酵温度在35-37℃，发酵时间3-4h；
4)萃取：步骤3)得到的发酵液经过超高温瞬时灭菌，用与发酵液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，取水层，真空浓缩除去乙酸乙酯，反复数次直至乙酸乙酯层无色；
5)大孔树脂吸附纯化：选用HP-20大孔树脂，经预处理后湿法上柱，用稀盐酸调色素液pH至3.5，用恒流泵控制色素液通过吸附柱，待流出液吸光值为上样液吸光值的10％后停止加入色素液，用纯水分数次清洗树脂表面，以pH为3.5的质量分数为90％的乙醇溶液为洗脱剂洗脱色素液，得到的色素液真空浓缩除去乙醇，得到初步纯化色素液；
6)聚酰胺层析柱吸附纯化：聚酰胺经预处理后湿法装柱，步骤5)得到的初步纯化色素液过聚酰胺层析柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
7)葡聚糖凝胶柱吸附纯化：葡聚糖凝胶经预处理后湿法装柱，步骤6)得到的纯化样品过葡聚糖凝胶柱，以质量分数为50％的甲醇和质量分数为0.1％的甲酸混合溶液为洗脱剂，收集有色部分，洗脱液真空浓缩；
8)制备型液相色谱分离纯化：采用制备型液相色谱对浓缩后的色素液分离纯化，得到柿子果实色素液；
9)干燥：采用冷冻干燥，去除色素液的水分，得到柿子果实色素。
2.根据权利要求1所述的一种柿子果实色素的制备方法，其特征在于：步骤3)中乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳脂链球菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌。
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