CN104688725A - 淫羊藿素在制备Nrf2激动剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物制备领域，涉及淫羊藿素在制备Nrf2激动剂中的应用。本发明对香烟烟雾提取物刺激建立的体外氧化应激模型进行了淫羊藿素干预试验，结果显示，淫羊藿素可诱导Nrf2磷酸化，促进抗氧化基因GCL的表达，增加内源性抗氧化剂GSH的合成，进而拮抗香烟烟雾诱导的肺泡上皮细胞损伤；而采用RNA干扰技术沉默Nrf2基因后，淫羊藿素促进抗氧化基因GCL表达的能力被逆转。实验结果表明，本发明的淫羊藿素可用于制备Nrf2激动剂；进一步的，可用于制备抗吸烟诱导的肺损伤的药物。更进一步本发明提供了一种激活Nrf2的药物组合物，其含有式（1）的淫羊藿素及药物学上可接受的载体。
Description
技术领域
本发明属药物制备领域。涉及淫羊藿素的医药新用途，具体地涉及淫羊藿素在制备Nrf2通路激动剂中的应用。
背景技术
研究报道，核因子E2相关因子-2（Nuclear factor-erythroid-2-relatedfacror-2,Nrf2）是近年发现的一种与抗氧化应激有关的转录因子。通常生理情况下，大部分Nrf2在胞浆中与Keap1结合，处于无活性状态。但是，当内环境中氧化还原平衡被打破时，Nrf2可被磷酸化，磷酸化的Nrf2与Keap1解离并进入胞核中再进一步与抗氧化反应元件ARE结合，从而启动下游一系列抗氧化基因转录以对抗氧化应激损伤，所述基因包括：GCL、GPx、GST等。有研究通过动物实验证实Nrf2基因敲除小鼠在氧化剂诱导下GST、GCL等抗氧化基因的表达与正常小鼠相比显著降低。
本领域知悉，Nrf2与多种疾病如慢性阻塞性肺病、哮喘、糖尿病、肿瘤、多发性硬化等密切相关，已渐成为广受关注的药物靶点。从天然药物中寻找新型Nrf2激动剂是目前有关中医药研究的热点。研究公开了许多天然药物对Nrf2显示了激活作用，如莱菔硫烷（sulforaphane)、大豆黄素（glycitein）和人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3）等。淫羊藿素是一种黄酮类化合物，少量存在与淫羊藿药材中，有研究公开其有抗肿瘤、抗骨质疏松等药理作用，迄今为止，尚未见淫羊藿素作为Nrf2激动剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供淫羊藿素的医药新用途，具体涉及淫羊藿素在制备Nrf2通路激动剂中的应用。
本发明所述的淫羊藿素有式（1）的结构，
基于香烟烟雾中含有大量的氧化物质，可造成肺脏损伤。本发明以香烟烟雾提取物（CSE）刺激人肺泡II型上皮细胞株（A549），建立了公认的体外氧化应激模型。在此基础上，本发明进行了淫羊藿素干预试验，结果显示，淫羊藿素可诱导Nrf2磷酸化，促进抗氧化基因GCL的表达，增加内源性抗氧化剂GSH的合成，进而拮抗香烟烟雾诱导的肺泡上皮细胞损伤；而采用RNA干扰技术沉默Nrf2基因后，淫羊藿素促进抗氧化基因GCL表达的能力被逆转。实验结果表明，本发明所述的淫羊藿素可用于制备Nrf2激动剂；进一步的，所述的淫羊藿素可用于制备抗吸烟诱导的肺损伤的药物。
本发明更进一步提供了一种激活Nrf2的药物组合物，其含有式（1）的淫羊藿素及药物学上可接受的载体，
附图说明
图1CSE对细胞活性影响及ICT提前干预后细胞活性变化，
其中显示了，A549细胞提前以ICT（10μM）干预或不干预1小时后，加入CSE（2.5,5,10%）刺激24小时，之后加入CCK-8培养1小时后检测450nm处OD值，根据OD值计算细胞活性，**表示与对照组相比，p<0.01，#表示与单纯CSE刺激组相比，p<0.05。
图2显示了ICT增加胞核内Nrf2蛋白含量。
图3显示了ICT增加胞核内Nrf2蛋白含量（灰度值扫描），
其中，A549细胞按之前分组加入ICT及CSE，在2小时后收集细胞提取核内蛋白，western blot检测Nrf2蛋白表达变化，以核纤层蛋白B（lamin B）作为内参，条带灰度值扫描采用LAS4000mini（GE）软件，**表示与对照组相比，p<0.01，#表示与单纯CSE刺激组相比，p<0.05。
图4显示了ICT可部分逆转CSE诱导的GCLM mRNA水平下降，
其中显示了细胞按之前分组加入ICT及CSE，24小时后收集细胞，抽提总RNA，采用real-time PCR法检测GCLM mRNA，管家基因（β-actin）mRNA作为内参，结果显示5%CSE可显著降低细胞内GCLM mRNA水平，而ICT提前处理1小时后可部分逆转CSE诱导的GCLM mRNA水平下降，**表示与对照组相比，p<0.01，#表示与单纯CSE刺激组相比，p<0.05。
图5显示了ICT可部分恢复CSE消耗的GSH水平，
其中显示了细胞按之前分组加入ICT及CSE，24小时后收集细胞并采用GSH检测试剂盒检测细胞内GSH，结果显示5%CSE可显著降低细胞内GSH水平，而ICT提前处理1小时后可部分恢复CSE消耗的GSH水平，**表示与对照组相比，p<0.01，#表示与单纯CSE刺激组相比，p<0.01。
图6显示了Nrf2siRNA转染后，Nrf2蛋白表达明显减少（western blot）。
图7显示了Nrf2siRNA转染后，Nrf2蛋白表达明显减少（灰度值扫描），
其中显示了细胞按之前分组转染Nrf2siRNA24小时后分别加入或不加ICT，1小时后加入或不加CSE，24小时后提取总蛋白行western-blotting检测Nrf2蛋白，以β-actin作为内参，结果如图所示，转染Nrf2组与对照组相比，Nrf2蛋白表达明显减少，阴性对照组与对照组相比Nrf2无明显变化，ICT提前干预与CSE刺激均未增加Nrf2蛋白表达，**表示与对照组相比，P<0.01。
图8显示Nrf2siRNA转染后，ICT不能增加GCLM的表达，
其中显示了按之前分组转染Nrf2siRNA24小时后，分别加入或不加ICT，1小时后加入或不加CSE，24收集胞浆内mRNA行real-time PCR检测，以β-actinmRNA作为内参，结果如图所示，转染Nrf2组与对照组相比，GCLM mRNA明显减少，阴性对照组与对照组相比GCLM mRNA无明显变化，ICT提前干预与CSE刺激均未增加GCLM mRNA表达，**表示与对照组相比，P<0.01。
具体实施方式
实施例1淫羊藿素（ICT）对香烟烟雾提取物（CSE）介导的肺泡II型上皮细胞（A549）损伤的影响
采用MMT法检测CSE对A549细胞毒性作用，结果显示，与阴性对照组相比，不同浓度CSE（2.5%,5%,10%）可降低A549细胞的细胞活性，并呈浓度依赖性（p<0.01），而提前以10μM ICT干预则可降低CSE介导的细胞毒性（p<0.01）（如图1所示），试验结果表明淫羊藿素（ICT）能减弱香烟烟雾提取物（CSE）介导的肺泡II型上皮细胞（A549）损伤。
实施例2淫羊藿素（ICT）对Nrf2核转位影响
采用western blot方法进行Nrf2核蛋白定量分析，结果显示Nrf2在CSE刺激2小时后核转位代偿性增加（p<0.01），ICT干预组与单纯CSE刺激组相比较，Nrf2核转位进一步增加（p<0.01）（如图2，图3所示），实验结果表明淫羊藿素（ICT）能增加Nrf2核转位，可作为Nrf2激动剂。
实施例3淫羊藿素（ICT）对Nrf2下游抗氧化基因GCLM的表达影响
5%CSE干预A549细胞24小时后，GCLM mRNA表达下降，同时，GCL的下游产物GSH水平亦降低（p<0.01）；而以10μM ICT干预后，GSH水平较CSE单独刺激组明显增高，GCLMmRNA表达也明显恢复（p<0.01），而ICT单独干预A549细胞后，细胞内GSH、GCLM与对照组无明显变化；结果显示，ICT可增加Nrf2下游抗氧化基因GCLM的表达，进而增加GSH的水平（如图4，图5所示）；
所述的GCL为GSH合成的限速酶，由催化亚基GCLC及调节亚基GCLM组成。
实施例4
为了进一步研究Nrf2在诱导GCLM mRNA表达中所起作用，本实施例中使用Nrf2的siRNA以沉默Nrf2在A549细胞中的表达，siRNA转染的细胞按之前分组所述行干预处理后，结果如图6,图7所示：与未转染组相比，Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.01)；无论是CSE单独干预还是提前以ICT预处理，Nrf2蛋白表达均未明显提高，而在转染无目标性siRNA（阴性对照）后，Nrf2蛋白表达则与未转染组无明显变化，同时，Nrf2siRNA转染的细胞中，与未转染组相比，GCLMmRNA表达也明显下降（p<0.01）（如图8所示），结果表明，Nrf2基因沉默可逆转ICT引起GCLM mRNA转录增加。
Claims (3)
1.式（1）的淫羊藿素在制备Nrf2激动剂中的应用；
2.式（1）的淫羊藿素在制备抗吸烟诱导的肺损伤药物中的应用。
3.一种激活Nrf2的药物组合物，其特征在于，含有式（1）的淫羊藿素及药物学上可接受的载体，
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN110917186A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-03-27 | 桂林医学院 | 淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用 |
| CN114796195A (zh) * | 2022-06-10 | 2022-07-29 | 桂林医学院 | 淫羊藿素在制备脂多糖诱导急性肺损伤保护药物组合物中的应用 |
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2014
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