CN110917186A - 淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用 - Google Patents

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周桂明
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Abstract

本发明公开了一种淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，属于中药新用途技术领域。本申请的发明人经过药物试验研究发现，淫羊藿素在体外细胞实验及体内哮喘小鼠模型实验中均证实具有较好的抑制支气管哮喘气道炎症和气道重塑的能力，因此，淫羊藿素可以用于制备治疗支气管哮喘的药物，既开辟了新的支气管哮喘治疗药物，又开辟了淫羊藿素的新用途，具有良好的应用前景。

Description

淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，属于中药新用途技术领域。
背景技术
支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎性细胞(嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等)和结构细胞(平滑肌细胞、气道上皮细胞等)以及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。气道慢性炎症、气道重塑是支气管哮喘的两大疾病病理表征。
支气管哮喘发病率高，常反复发作，极难治愈。目前，支气管哮喘仍是一种不能“治愈”的疾病，还没有彻底治愈支气管哮喘的药物。临床实践中，治疗目标仅是“控制”，多使用激素类药物(如地塞米松、布地奈德等)作为缓解支气管哮喘的常用药，但效果一般，并且具有极强副作用。鉴于此，仍然迫切需要去寻找新的方法来防治支气管哮喘。
淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿和柔毛淫羊藿等的干燥地上部分，属于补肾壮阳类药物。淫羊藿不仅具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等传统药效，现代研究表明还有抗衰老、提高免疫功能、抑制肿瘤等功效，是内外多年来重点研究的药用植物之一。
淫羊藿素(Icaritin)是淫羊藿属植物提取物淫羊藿苷的水解衍生产物，属于黄酮醇类化合物，其化学结构式如下：
Figure BDA0002299416990000021
目前，尚未有关于淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物方面的报道。如果淫羊藿素能用于制备治疗支气管哮喘药物，既开辟了新的支气管哮喘治疗药物，又开辟了淫羊藿素的新用途，将具有重大的社会意义和经济效益。
发明内容
本发明的目的，是提供一种淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用。本申请的发明人经过药物试验研究发现，淫羊藿素在体外细胞实验及体内哮喘小鼠模型实验中均具有较好的抑制支气管哮喘气道炎症和气道重塑的能力，首次发现淫羊藿素能够在细胞水平上抑制在支气管哮喘气道重塑中过分增值的气道平滑肌细胞(Airway Smooth MuscleCells,ASMCs)增殖并促进其凋亡，在动物模型上明显地改善支气管哮喘慢性气道炎症和气道重塑，从而发挥治疗支气管哮喘的作用。因此，淫羊藿素作为一种来源于天然产物的小分子化合物，能用于制备治疗支气管哮喘药物，既开辟了新的支气管哮喘治疗药物，又开辟了淫羊藿素的新用途，具有良好的市场应用前景。
本发明解决上述问题的技术方案如下：淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，所述淫羊藿素的化学结构式如下：
Figure BDA0002299416990000031
本申请的发明人通过蛋白Western bloting、qRT-PCR、CCK-8试剂盒、及流式细胞术等测试淫羊藿素对ASMCs增殖抑制的影响。结果发现，淫羊藿素能够抑制ASMCs增殖并促进其凋亡，且增值的抑制作用与其细胞周期S期的阻滞密切相关，凋亡的促进作用是通过激活细胞凋亡信号通路Fas/FADD/Caspase-8/Caspase-3实现的。
淫羊藿素的作用机理是：淫羊藿素是一种小分子化合物，能够通过肠道直接吸收，通过血液循环直接到达支气管哮喘病灶部位(肺部支气管)起作用。
淫羊藿素可以市售购买，如可以购自上海源叶生物科技有限公司，CAS号：118525-40-9，货号：B21277-20mg，分析标准品，HPLC≥99％。
本发明的有益效果：
1、淫羊藿素作为一种来源于天然产物的小分子化合物，能用于制备治疗支气管哮喘药物，既开辟了新的支气管哮喘治疗药物，又开辟了淫羊藿素的新用途，具有良好的市场应用前景。
2、淫羊藿素能够抑制ASMCs增殖并促进其凋亡，且增值的抑制作用与其细胞周期S期的阻滞密切相关，凋亡的促进作用是通过激活细胞凋亡信号通路Fas/FADD/Caspase-8/Caspase-3实现的。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述淫羊藿素抑制支气管哮喘发生、发展过程中的气道重塑和气道炎症。
采用上述进一步的有益效果是：本申请的发明人通过构建小鼠哮喘模型测试淫羊藿素在体内对支气管哮喘慢性气道炎症及气道重塑的影响。结果发现，淫羊藿素能够明显地改善支气管慢性气道炎症并抑制气道重塑，且改善支气管慢性气道炎症与再平衡失衡的Th1/Th2免疫细胞关系密切，抑制气道重塑与抑制气道平滑肌层细胞增生、肥大和气道粘液过分分泌有关。
进一步，所述药物为包括淫羊藿素和药物可接受的载体或赋形剂。
采用上述进一步的有益效果是：淫羊藿素可以和药物可接受的载体或赋形剂一起，制成药物，用于治疗支气管哮喘。
更进一步，所述药物为外用制剂、口服制剂和或注射制剂中的任意一种。
采用上述更进一步的有益效果是：淫羊藿素可以制成多种剂型的药物，适用于多种给药途径，如外用制剂、口服制剂或注射制剂，注射给药可以为皮内、皮下、肌内、局部或静脉内给药。
更进一步，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
更进一步，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
更进一步，所述注射制剂由淫羊藿素、助溶剂、0.9％氯化钠溶液或注射用水组成，所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的任意一种或多种。
附图说明
图1为本发明的实施例1中，浓度分别为0μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs分别处理24h、48h、72h，CCK-8法测定OD450吸收光值。
图2为本发明的实施例2中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，流式细胞术分析细胞周期。图中，**代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中G0/G1期所占百分数与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞G0/G1期所占百分数对比呈现显著变化；##代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中S期所占百分数与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞S期所占百分数对比呈现显著变化。
图3为本发明的实施例2中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CyclinA1和CyclinE1的mRNA相对表达值。图中，**代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中CyclinA1的mRNA相对表达值与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞中CyclinA1的mRNA相对表达值对比呈现显著变化；##代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中CyclinE1的mRNA相对表达值与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞中CyclinE1的mRNA相对表达值对比呈现显著变化。
图4为本发明的实施例2中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，Western bloting检测检测CyclinA1的蛋白表达变化。
图5为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，Western bloting检测检测CyclinE1的蛋白表达变化。
图6为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，流式细胞术分析凋亡细胞所占百分数。图中，**代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中凋亡细胞所占百分数与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞中凋亡细胞所占百分数对比呈现显著变化。
图7为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞凋亡相关因子FADD、Caspase-8和Caspase-3的mRNA相对表达值。图中，**代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中FADD的mRNA相对表达值与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞中mRNA相对表达值对比呈现显著变化；##代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中Caspase-8的mRNA相对表达值与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞中mRNA相对表达值对比呈现显著变化；&&代表30μM、50μM、70μM淫羊藿素浓度分别处理细胞中Caspase-3的mRNA相对表达值与淫羊藿素浓度为0μM处理细胞中mRNA相对表达值对比呈现显著变化。
图8为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，Western bloting检测细胞凋亡相关因子FAS的蛋白表达变化。
图9为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，Western bloting检测细胞凋亡相关因子FADD的蛋白表达变化。
图10为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，Western bloting检测细胞凋亡相关因子pro-Caspase-8的蛋白表达变化。
图11为本发明的实施例3中，浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、70μM的淫羊藿素(Icaritin)对大鼠ASMCs处理24h，Western bloting检测细胞凋亡相关因子Actived-Caspase-3的蛋白表达变化。
图12为本发明的实施例4中，正常组(所有处理均使用等量生理盐水替代)小鼠肺石蜡包埋切片并H&E染色结果，放大倍数为200倍。
图13为本发明的实施例4中，哮喘组(正常小鼠哮喘造模，不使用药物干预)小鼠肺石蜡包埋切片并H&E染色结果，放大倍数为200倍。
图14为本发明的实施例4中，哮喘+ICT40组(正常小鼠哮喘造模，使用40mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并H&E染色结果，放大倍数为200倍。
图15为本发明的实施例4中，哮喘+ICT80组(正常小鼠哮喘造模，使用80mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并H&E染色结果，放大倍数为200倍。
图16为本发明的实施例4中，哮喘+地塞米松组(正常小鼠哮喘造模，使用1mg/kg的地塞米松在每次卵清蛋白激发前腹腔注射治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并H&E染色结果，放大倍数为200倍。
图17为本发明的实施例4中，正常组(所有处理均使用等量生理盐水替代)小鼠肺石蜡包埋切片并PAS染色结果，放大倍数为200倍。
图18为本发明的实施例4中，哮喘组(正常小鼠哮喘造模，不使用药物干预)小鼠肺石蜡包埋切片并PAS染色结果，放大倍数为200倍。
图19为本发明的实施例4中，哮喘+ICT40组(正常小鼠哮喘造模，使用40mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并PAS染色结果，放大倍数为200倍。
图20为本发明的实施例4中，哮喘+ICT80组(正常小鼠哮喘造模，使用80mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并PAS染色结果，放大倍数为200倍。
图21为本发明的实施例4中，哮喘+地塞米松组(正常小鼠哮喘造模，使用1mg/kg的地塞米松在每次卵清蛋白激发前腹腔注射治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并PAS染色结果，放大倍数为200倍。
图22为本发明的实施例4中，小鼠肺石蜡包埋切片并PAS染色结果图13、图14、图15、图16、图17的分析结果。**代表图14相对于图13的支气管PAS+细胞数占比显著变化；##代表图15、图16、图17相对于图14的支气管PAS+细胞数占比显著变化。
图23为本发明的实施例4中，正常组(所有处理均使用等量生理盐水替代)小鼠肺石蜡包埋切片并α-肌动蛋白组织免疫荧光染色结果，放大倍数为200倍。
图24为本发明的实施例4中，哮喘组(正常小鼠哮喘造模，不使用药物干预)小鼠肺石蜡包埋切片并α-肌动蛋白组织免疫荧光染色结果，放大倍数为200倍。
图25为本发明的实施例4中，哮喘+ICT40组(正常小鼠哮喘造模，使用40mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并α-肌动蛋白组织免疫荧光染色结果，放大倍数为200倍。
图26为本发明的实施例4中，哮喘+ICT80组(正常小鼠哮喘造模，使用80mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并α-肌动蛋白组织免疫荧光染色结果，放大倍数为200倍。
图27为本发明的实施例4中，哮喘+地塞米松组(正常小鼠哮喘造模，使用1mg/kg的地塞米松在每次卵清蛋白激发前腹腔注射治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并α-肌动蛋白组织免疫荧光染色结果，放大倍数为200倍。
图28为本发明的实施例4中，小鼠肺石蜡包埋切片并α-肌动蛋白组织免疫荧光染色结果图19、图20、图21、图22、图23的分析结果。图中，**代表图20相对于图19的平滑肌层厚度显著变化；##代表图21、图22、图23相对于图20的平滑肌层厚度显著变化。
图29为本发明的实施例4中，正常组(所有处理均使用等量生理盐水替代)小鼠肺石蜡包埋切片并T-bet蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图30为本发明的实施例4中，哮喘组(正常小鼠哮喘造模，不使用药物干预)小鼠肺石蜡包埋切片并T-bet蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图31为本发明的实施例4中，哮喘+ICT40组(正常小鼠哮喘造模，使用40mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并T-bet蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图32为本发明的实施例4中，哮喘+ICT80组(正常小鼠哮喘造模，使用80mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并T-bet蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图33为本发明的实施例4中，哮喘+地塞米松组(正常小鼠哮喘造模，使用1mg/kg的地塞米松在每次卵清蛋白激发前腹腔注射治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并T-bet蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图34为本发明的实施例4中，小鼠肺石蜡包埋切片并T-bet蛋白免疫组化染色结果图25、图26、图27、图28、图29的分析结果。图中，**代表图26相对于图25的T-bet蛋白表达显著变化；##代表图27、图28、图29相对于图26的T-bet蛋白表达显著变化。
图35为本发明的实施例4中，正常组(所有处理均使用等量生理盐水替代)小鼠肺石蜡包埋切片并GATA-3蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图36为本发明的实施例4中，哮喘组(正常小鼠哮喘造模，不使用药物干预)小鼠肺石蜡包埋切片并GATA-3蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图37为本发明的实施例4中，哮喘+ICT40组(正常小鼠哮喘造模，使用40mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并GATA-3蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图38为本发明的实施例4中，哮喘+ICT80组(正常小鼠哮喘造模，使用80mg/kg的淫羊藿素在每次卵清蛋白激发前灌胃治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并GATA-3蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图39为本发明的实施例4中，哮喘+地塞米松组(正常小鼠哮喘造模，使用1mg/kg的地塞米松在每次卵清蛋白激发前腹腔注射治疗)小鼠肺石蜡包埋切片并GATA-3蛋白免疫组化染色结果，放大倍数为400倍。
图40为本发明的实施例4中，小鼠肺石蜡包埋切片并GATA-3蛋白免疫组化染色结果图31、图32、图33、图34、图35的分析结果。图中，**代表图32相对于图31的GATA-3蛋白表达显著变化；##代表图33、图34、图35相对于图32的GATA-3蛋白表达显著变化。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：测试淫羊藿素对大鼠ASMCs增殖的影响
通过CCK-8试剂盒测试淫羊藿素对大鼠ASMCs增殖的影响，具体方法如下：
CCK-8试剂盒检测：通过常规方法分离、纯化并鉴定大鼠原代ASMCs，采用含有10％胎牛血清的DMEM F12培养基，在37℃和5％CO2条件下进行培养。细胞等量接种于96孔培养板，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h、48h、72h，使用多功能酶标仪SYNERGY|HTX在OD＝450nm的设置条件下测试每个浓度梯度分组的吸收光值(如图1所示)。上述淫羊藿素可以市售购买，如可以购自上海源叶生物科技有限公司，CAS号：118525-40-9，货号：B21277-20mg，纯度HPLC≥99％。
实施例2：测试淫羊藿素对大鼠ASMCs细胞周期的影响
通过流式细胞术、Western bloting和qRT-PCR检测测试淫羊藿素对大鼠ASMCs细胞周期的影响，具体方法如下：
流式细胞术：细胞接种于10cm培养皿，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h，收集细胞并使用碘化丙啶(PI)细胞核染色剂对各浓度梯度分组染色，常规方法细胞流式仪检测各分组细胞细胞周期各时期的细胞占比(如图2所示)。上述碘化丙啶(PI)细胞核染色剂可以市售购买，如可以购自北京索莱宝生物科技有限公司，CAS号：25535-16-4，货号：P8080-10mg，纯度HPLC≥95％。
qRT-PCR检测：细胞接种于10cm培养皿，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h，收集细胞，提取蛋白，具体地，在
Figure BDA0002299416990000111
试剂中裂解、提取总RNA，然后使用cDNA逆转录试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：RR047A)逆转录合成cDNA，最后使用荧光定量试剂盒(购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司，货号：1725122)检测细胞周期相关因子CyclinA1和CyclinE1的mRNA变化(如图3所示)。上述
Figure BDA0002299416990000112
试剂可以市售购买，如可以购自美国赛默飞世尔科技有限公司，货号：15596018，纯度HPLC≥95％。上述荧光定量试剂盒可以市售购买，如可以购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司，货号：1725122。
Western bloting检测：细胞接种于10cm培养皿，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h，收集细胞，提取蛋白，具体地，在冷的裂解液(50mMTris、pH值为7.4、150mMNaCl、1mM EDTA、1％TritonX-100、0.1％SDS，再加入蛋白酶抑制剂的混合液)中裂解1h，之后进行细胞周期相关因子CyclinA1和CyclinE1的蛋白检测(如图4和5所示)。
实施例3：测试淫羊藿素对大鼠ASMCs细胞凋亡的影响
通过流式细胞术、Western bloting、qRT-PCR检测测试淫羊藿素对大鼠ASMCs细胞凋亡的影响，具体方法如下：
流式细胞术：细胞接种于10cm培养皿，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h，收集细胞并使用FITC Annexin V/PI细胞双染凋亡检测试剂盒检测各浓度梯度分组细胞凋亡情况(如图6所示)。上述FITC AnnexinV/PI细胞双染凋亡检测试剂盒可以市售购买，如可以购自美国BD公司上海有限公司，货号：556547。
qRT-PCR检测：细胞接种于10cm培养皿，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h，收集细胞，提取蛋白，具体地，中裂解、提取总RNA，然后使用cDNA逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，最后使用荧光定量试剂盒检测细胞凋亡信号通路FADD、Caspase-8和Caspase-3的mRNA变化(如图7所示)。上述
Figure BDA0002299416990000121
试剂可以市售购买，如可以购自美国赛默飞世尔科技有限公司，货号：15596018。上述cDNA逆转录试剂盒可以市售购买，如可以购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：RR047A。上述荧光定量试剂盒可以市售购买，如可以购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司，货号：1725122。
Western bloting检测：细胞接种于10cm培养皿，贴壁后加入特定浓度梯度的淫羊藿素处理24h，收集细胞，提取蛋白，具体地，在冷的裂解液(50mMTris、pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1％TritonX-100、0.1％SDS，再加入蛋白酶抑制剂的混合液)中裂解1h，之后进行细胞凋亡信号通路Fas、FADD、Caspase-8和Active-Caspase-3的蛋白检测(如图8、图9、图10和图11所示)。
实施例4：测试淫羊藿素对小鼠哮喘模型的影响
通过对实验C57BL/6小鼠(购自桂林医学院SPF级实验动物中心)哮喘造模及用药、PAS染色、免疫荧光染色和免疫组化测试淫羊藿素对小鼠哮喘模型气道炎症、气道重塑的影响，具体方法如下：
小鼠哮喘模型构建及用药：6-8周龄，体重20-22g，C57BL/6小鼠共分为五组(每组五只)，分别是正常组、哮喘组、哮喘+淫羊藿素低剂量组(40mg/kg)、哮喘+淫羊藿素高剂量组(80mg/kg)和哮喘+地塞米松组(1mg/kg)。正常组所有处理过程都使用等量的生理盐水代替；其余四组哮喘模型组均在第0天和第7天给予每只小鼠80μg高纯度卵清蛋白致敏，在第15天到第57天每隔一天雾化吸入1％的高纯度卵清蛋白30min，且每次雾化前进行对应剂量淫羊藿素灌胃和地塞米松腹腔注射；在第58天处理小鼠取材。取材后进行H&E染色、PAS染色、免疫荧光染色和免疫组化检测。
H&E染色：小鼠肺部取材，部分用多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片后，H&E染色并观察各分组气道厚度，从而判断淫羊藿素对小鼠哮喘模型气道重塑中气道气道厚度的影响(如图12、图13、图14、图15和图16所示)。
PAS染色：小鼠肺部取材，部分用多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片后，PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色并观察各分组气道附近呈现紫红色的糖类物质，从而判断淫羊藿素对小鼠哮喘模型气道重塑中气道黏液分泌的影响(如图17、图18、图19、图20、图21和图22所示)。
免疫荧光染色：小鼠肺部取材，部分用多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片后，使用平滑肌细胞特异表达的α-肌动蛋白抗体对石蜡切片进行α-肌动蛋白组织免疫荧光染色，观察各分组气道壁呈现红色荧光的α-肌动蛋白表达变化，从而判断淫羊藿素对小鼠哮喘模型气道重塑中平滑肌层厚度的影响。上述α-肌动蛋白抗体可以市售购买，如可以购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：C6198(如图23、图24、图25、图26、图27和图28所示)。
免疫组化：小鼠肺部取材，部分用多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片后，使用T-bet抗体和GATA-3抗体对Th1特异表达的T-bet蛋白和Th2特异表达的GATA-3蛋白进行免疫组化染色，观察各分组气道附近T-bet和GATA-3表达变化，从而判断淫羊藿素对小鼠哮喘模型慢性气道炎症中Th1/Th2免疫细胞失衡的影响。上述T-bet抗体可以市售购买，如可以购自艾博抗(上海)贸易有限公司，货号：ab91109。上述GATA-3抗体可以市售购买，如可以购自艾博抗(上海)贸易有限公司，货号：ab106625(如图29、图30、图31、图32、图33、图34、图35、图36、图37、图38、图39和图40所示)。
实验结论：
(1)淫羊藿素在体外能够抑制支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞增殖，并且增殖抑制具有淫羊藿素处理时间和浓度的依赖性。
(2)淫羊藿素在体外能够阻滞支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞周期S期，并且细胞周期S期阻滞具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(3)淫羊藿素在体外能够下调支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞周期S期阻滞关键因子CyclinA1的mRNA和蛋白的表达，并且CyclinA1的mRNA和蛋白表达具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(4)淫羊藿素在体外能够上调支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞周期S期阻滞关键因子CyclinE1的mRNA和蛋白的表达，并且CyclinE1的mRNA和蛋白表达具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(5)淫羊藿素在体外能够促进支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞凋亡，并且凋亡促进具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(6)淫羊藿素在体外能够上调支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞凋亡通路关键因子FAS的蛋白的表达，并且FAS的蛋白表达具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(7)淫羊藿素在体外能够上调支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞凋亡通路关键因子FADD的mRNA和蛋白的表达，并且FADD的mRNA和蛋白表达具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(8)淫羊藿素在体外能够上调支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞凋亡通路关键因子Caspse-8的mRNA表达和下调其pro-Caspse-8的蛋白表达，并且Caspse-8的mRNA和pro-Caspse-8的蛋白表达具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(9)淫羊藿素在体外能够上调支气管哮喘气道重塑重要结构性细胞组分气道平滑肌细胞细胞凋亡通路关键因子Caspse-3的mRNA表达和Actived-Caspse-3的蛋白表达(激活状态的Caspse-3)，并且Caspse-3的mRNA表达和Actived-Caspse-3蛋白表达具有淫羊藿素处理浓度的依赖性。
(10)淫羊藿素在体内能够抑制小鼠哮喘模型气道重塑中的气道壁厚度过分增加。
(11)淫羊藿素在体内能够抑制小鼠哮喘模型气道重塑中的气道粘液过分分泌。
(12)淫羊藿素在体内能够抑制小鼠哮喘模型气道重塑中的气道平滑肌层过分增厚。
(13)淫羊藿素在体内能够上调小鼠哮喘模型气道炎症关键因子T-bet蛋白表达(在哮喘中T-bet蛋白表达极低，诱导哮喘炎症发生)。
(14)淫羊藿素在体内能够下调小鼠哮喘模型气道炎症关键因子GATA-3蛋白表达(在哮喘中GATA-3蛋白表达极高，诱导哮喘炎症发生)。
淫羊藿素的作用机理是：淫羊藿素是一种小分子化合物，能够通过肠道直接吸收，通过血液循环直接到达支气管哮喘病灶部位(肺部支气管)起作用。
在整体动物实验中，治疗哮喘的有效量为40-80mg/kg体重，按本领域的常规计算方法，即实验动物每千克的用药量是70kg成人每千克用药量的5-10倍，以此折算成人用药量，以淫羊藿素计，其用量为4-16mg/kg体重；优选地，其用量为8mg/kg体重，即70kg成人的用药量为560mg。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.淫羊藿素在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，所述淫羊藿素的化学结构式如下：
Figure FDA0002299416980000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素抑制支气管哮喘发生、发展过程中的气道重塑和气道炎症。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为包括淫羊藿素和药物可接受的载体或赋形剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为外用制剂、口服制剂和或注射制剂中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射制剂由淫羊藿素、助溶剂、0.9％氯化钠溶液或注射用水组成，所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的任意一种或多种。
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