CN104666778A - 一种虎眼万年青皂苷的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用超声法结合反胶束技术提取虎眼万年青皂苷的方法，是以虎眼万年青为原料，用60-90％的乙醇溶液超声提取皂苷粗提物，蒸干后用水溶解并调pH至4.5～6.0，再用异辛烷和正辛醇混合溶剂和磷酸盐缓冲液形成的反胶束体系进行萃取，所得反胶束相与磷酸盐缓冲液混合，并分别加乙酸乙酯、氯仿萃取，蒸干即得。本发明的方法具有选择性高、条件温和、收率和纯度高的优点。

Description

一种虎眼万年青皂苷的提取方法

技术领域

本发明属于中药领域，特别是涉及一种利用超声法结合反胶束技术提取虎眼万年青皂苷的方法。

背景技术

虎眼万年青（Ornithogalum caudatum）又名珍珠草、葫芦兰、胡连万年青，是百合科虎眼万年青属多年生草本植物。虎眼万年青味甘、性微寒，归肝、脾经，具有清热解毒消坚散结的功能，民间用其鲜汁液涂抹患处以治疗疗疮，内服可治疗无名肿毒、肝炎、肝硬化、肝癌等，均具有很好的治疗效果。虎眼万年青具有极高的药用价值，已测出的化学成分包括皂苷类、多糖、黄酮类、萜类、生物碱类、挥发油及微量元素等。目前对虎眼万年青的研究主要集中在抗肿瘤药效物质基础及抗肿瘤作用机制这两方面。药理学研究表明虎眼万年青中的虎眼万年青皂苷OSW-1对肺癌、乳腺癌有明显的抗癌活性，体外抗p338 淋巴细胞白血病活性结果表明OSW-1是常见抗癌药物喜树碱、阿霉索、紫杉醇抗癌活性的10~100 倍，而且对正常细胞没有毒性[SHI Lei, et al. Chemical characteristic of bioactive polysaccharides isolated from ornithogalum caudatum ait, J. Chem Res Chinese, 2003, 19(3):286-289]。因此，虎眼万年青是一种极具开发潜力的中草药。到目前为止，国内对虎眼万年青的研究局限在其多糖方向，对于虎眼万年青皂苷的分离提取少见报道。

目前虎眼万年青皂苷的提取方法一般采用传统的植物提取方法，包括煎煮法、回流提取法，浸渍法等，这些方法存在提取效率低、资源浪费严重等缺点。近年来，随着对植物提取技术的研究，相继涌现出了如超临界流体萃取、微波提取、酶法提取等新兴的植物提取方法，这些方法虽然产物含量提高了，但其对设备要求较高，工业化生产比较困难。

反胶束萃取（Reversed micelles extraction，RME）是上世纪七十年代发展起来的纯化分离技术。表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，形成聚集体，称为胶束；表面活性剂溶于有机相中，自发形成的与正常胶束结构相反的一种含水聚集体，称为反胶束。在有机溶剂-表面活性剂-水形成的反胶束溶液中，表面活性剂使原本不能溶于油的水在油中有了一定的“增溶”。目前，反胶束萃取技术主要用于蛋白质的分离和纯化，并逐渐延伸至其他生物分子（氨基酸、抗生素、核酸）的分离研究。在我国，反胶束萃取技术的研究发展迅速，但是在植物小分子有效成分的萃取分离方面仍然研究较少。

鉴于常规的提取方法对虎眼万年青皂苷的提取效率低、资源浪费严重，因此需要研究寻找新的虎眼万年青皂苷提取方法，以改善其得率和纯度。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中常规提取方法的缺限，提供一种收率和纯度高的虎眼万年青皂苷的提取方法。

本发明是采用下列的技术方案来实现的：

提供了一种虎眼万年青皂苷的提取方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)、将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于超声提取罐中，加6-8倍体积的60-90％乙醇溶液进行加热超声提取，时间为20-40分钟，振荡频率为20-100KHz，温度为60-80℃，提取2-4次，合并提取液，减压浓缩蒸发至干，残渣加水溶解至皂苷的浓度为0.15～0.4mg/ml，并调节pH至4.5～6.0，得到皂苷粗提液；

(2)、将1.5～8.6g阴离子表面活性剂加入到50～100ml异辛烷和正辛醇的混合溶剂（体积比为2:1～4:1）中，搅拌至均匀，然后加入0.03～0.06mol/L的磷酸盐缓冲液1～5ml，23～40℃下搅拌1.5～3小时，静置5～12小时，得到反胶束体系；

(3)、将步骤(1)中的皂苷粗提液按体积比1:1～3:1加入到步骤(2)的反胶束体系中，20～40℃下搅拌5～10分钟，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相层，将反胶束层取出并与0.03～0.06mol/L的磷酸盐缓冲液以1:1～2:1的体积比混合，搅拌20～40分钟，静置2～4小时，将水相取出备用；

(4)、将步骤(3)得到的水相按体积比1:1加入乙酸乙酯，振摇提取3次，静置2～4小时，取水相，按体积比1:1加入氯仿，振摇提取3次，静置2～4小时，将水相减压浓缩蒸发至干，即得虎眼万年青皂苷。

优选地，所述的阴离子表面活性剂为丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠或十二烷基苯磺酸钠。

优选地，所述的乙醇浓度为65～75％。

本发明首先通过超声提取法提取获得了虎眼万年青粗提物，其中选用60-90％的乙醇溶液作为提取溶剂，并优化了溶剂体积、提取时间、振荡频率、提取温度和提取次数等工艺参数，使得粗提物中的皂苷类有效成分得率最高。同时，本发明还结合应用了反胶束技术，其中采用阴离子表面活性剂-异辛烷/正辛醇反胶束系统，其极性内核带负电荷，通过将虎眼万年青粗提物的水溶液调节到4.5～6.0的pH值，使得虎眼万年青皂苷带正电荷，从而通过静电作用力对虎眼万年青皂苷进行选择性的萃取，提高了虎眼万年青皂苷的得率和纯度。此外，还先后采用乙酸乙酯和氯仿对含虎眼万年青皂苷的水相进行了清洗，使得虎眼万年青皂苷的纯度得到进一步地提高。本发明通过将超声提取、反胶束技术和有机溶剂萃取相联合，实现了高收率、高纯度虎眼万年青皂苷的快速提取分离。

因此，与本领域常规的虎眼万年青皂苷提取技术相比，本发明提取方法具有以下的优点：通过联合应用超声提取法、反胶束技术和有机溶剂萃取法，使虎眼万年青皂苷的纯度达到89.3％以上，收率达到68.13mg/g，与常规的提取方法相比，皂苷纯度提高了约41％，收率提高了2.2倍，并且本发明的方法具有简单快速、无污染、易于放大生产、残留有机溶剂少的特点。

根据本发明的提取方法生产得到的虎眼万年青皂苷，可广泛应用于制备治疗肺癌、乳腺癌等各种癌症，肝损伤，白血病等的药物，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

实施例1：

将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于超声提取罐中，加6倍体积的70％乙醇溶液进行加热超声提取，时间为30分钟，振荡频率为50KHz，温度为60℃，提取3次，合并提取液，减压浓缩蒸发至干，残渣加水溶解至皂苷的浓度为0.20 mg/ml，并调节pH至4.5，得到皂苷粗提液；将2.5 g阴离子表面活性剂加入到50 ml体积比为2:1的异辛烷和正辛醇的混合溶剂中，搅拌至均匀，然后加入0.03 mol/L的磷酸盐缓冲液5 ml，30℃下搅拌2小时，静置6小时，得到反胶束体系；将所述的皂苷粗提液按体积比1:1加入到所述的反胶束体系中，30℃下搅拌10分钟，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相层，将反胶束层取出并与0.03 mol/L的磷酸盐缓冲液以1:1的体积比混合，搅拌30分钟，静置3小时，将水相取出备用；将所得水相按体积比1:1加入乙酸乙酯，振摇提取3次，静置3小时，取水相，按体积比1:1加入氯仿，振摇提取3次，静置3小时，将水相减压浓缩蒸发至干，即得虎眼万年青皂苷。该提取的得率为68.13 mg/g，皂苷纯度为91.2%。

实施例2：

将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于超声提取罐中，加8倍体积的90％乙醇溶液进行加热超声提取，时间为20分钟，振荡频率为80KHz，温度为70℃，提取2次，合并提取液，减压浓缩蒸发至干，残渣加水溶解至皂苷的浓度为0.15mg/ml，并调节pH至6.0，得到皂苷粗提液；将1.8g阴离子表面活性剂加入到100ml体积比为4:1的异辛烷和正辛醇的混合溶剂中，搅拌至均匀，然后加入0.06mol/L的磷酸盐缓冲液5ml， 40℃下搅拌1.5小时，静置5小时，得到反胶束体系；将所述的皂苷粗提液按体积比3:1加入到所述的反胶束体系中，40℃下搅拌5分钟，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相层，将反胶束层取出并与0.06mol/L的磷酸盐缓冲液以2:1的体积比混合，搅拌20分钟，静置2小时，将水相取出备用；将所得水相按体积比1:1加入乙酸乙酯，振摇提取3次，静置2小时，取水相，按体积比1:1加入氯仿，振摇提取3次，静置2小时，将水相减压浓缩蒸发至干，即得虎眼万年青皂苷。该提取的得率为67.56 mg/g，皂苷纯度为90.8%。

实施例3：

将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于超声提取罐中，加7倍体积的60％乙醇溶液进行加热超声提取，时间为40分钟，振荡频率为100KHz，温度为80℃，提取4次，合并提取液，减压浓缩蒸发至干，残渣加水溶解至皂苷的浓度为0.35mg/ml，并调节pH至5.0，得到皂苷粗提液；将6.6g阴离子表面活性剂加入到100ml体积比为3:1的异辛烷和正辛醇的混合溶剂中，搅拌至均匀，然后加入0.05mol/L的磷酸盐缓冲液5ml，30℃下搅拌3小时，静置12小时，得到反胶束体系；将所述的皂苷粗提液按体积比1:1加入到所述的反胶束体系中，30℃下搅拌10分钟，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相层，将反胶束层取出并与0.05mol/L的磷酸盐缓冲液以1:1的体积比混合，搅拌40分钟，静置4小时，将水相取出备用；将所得水相按体积比1:1加入乙酸乙酯，振摇提取3次，静置4小时，取水相，按体积比1:1加入氯仿，振摇提取3次，静置4小时，将水相减压浓缩蒸发至干，即得虎眼万年青皂苷。该提取的得率为65.27 mg/g，皂苷纯度为89.3％。

实施例4：

为进一步证明本发明的优越性，本试验比较了本发明方法与常规方法提取虎眼万年青皂苷的得率和纯度。

1、试验样品

本试验组：根据实施例1的方法制备虎眼万年青皂苷。

对比组1：采用水煎煮法制备虎眼万年青皂苷，具体步骤为将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于提取罐中，加水煎煮3次，每次加4倍水煎煮2小时，合并煎液，减压浓缩蒸发至干，即得。

对比组2：采用50％乙醇溶液超声法制备虎眼万年青皂苷，具体步骤为将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于超声提取罐中，加6倍体积的50％乙醇溶液进行加热超声提取，时间为30分钟，振荡频率为50KHz，温度为60℃，提取3次，合并提取液，减压浓缩蒸发至干，即得。

2、虎眼万年青提取物中皂苷含量的测定

标准曲线的制备：精密称取薯蓣皂苷标准品1.5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，备用。取薯蓣皂苷标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于试管中，水浴挥干甲醇，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，加高氯酸0.8mL，摇匀，60℃水浴保温15min，取出后立即用冰水冷却，加5mL冰醋酸稀释，在454nm测标准品吸光度。采用直线回归法计算标准曲线的回归方程，并以对照品的量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得一元回归方程。

样品溶液的测定：称取上述三组方法得到的虎眼万年青皂苷提取物2.0mg，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，加高氯酸0.8mL，摇匀，60℃水浴保温15min，取出后立即用冰水冷却，加5mL冰醋酸稀释，在454nm测标准品吸光度，并代入标准曲线的回归方程，计算虎眼万年青中总皂苷的含量。

3、结果

分别测定本试验组、对比组1和对比组2的提取物中虎眼万年青皂苷的含量，并计算皂苷的得率和纯度。结果见表1。

表1本试验组、对比组1和对比组2提取方法的对比结果

	得率（mg/g）	纯度（％）
			本试验组	68.13	91.2
对比组1	30.97	50.2
			对比组2	52.44	78.46

由表1可以看出，根据实施例1的方法制备虎眼万年青皂苷得率高达68.13 mg/g，是对比组1中虎眼万年青皂苷得率的2.2倍。同时，本试验组制备得到的虎眼万年青皂苷的纯度远远高于对比组1和对比组2，说明本发明的制备方法能快速分离获得收率、纯度高的虎眼万年青皂苷。

Claims (3)

1.一种虎眼万年青皂苷的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、将虎眼万年青洗净风干，粉碎成粉末状，然后置于超声提取罐中，加6-8倍体积的60-90％乙醇溶液进行加热超声提取，时间为20-40分钟，振荡频率为20-100KHz，温度为60-80℃，提取2-4次，合并提取液，减压浓缩蒸发至干，残渣加水溶解至皂苷的浓度为0.15～0.4mg/ml，并调节pH至4.5～6.0，得到皂苷粗提液；

(2)、将1.5～8.6g阴离子表面活性剂加入到50～100ml异辛烷和正辛醇的混合溶剂（体积比为2:1～4:1）中，搅拌至均匀，然后加入0.03～0.06mol/L的磷酸盐缓冲液1～5ml，23～40℃下搅拌1.5～3小时，静置5～12小时，得到反胶束体系；

(3)、将步骤(1)中的皂苷粗提液按体积比1:1～3:1加入到步骤(2)的反胶束体系中，20～40℃下搅拌5～10分钟，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相层，将反胶束层取出并与0.03～0.06mol/L的磷酸盐缓冲液以1:1～2:1的体积比混合，搅拌20～40分钟，静置2～4小时，将水相取出备用；

(4)、将步骤(3)得到的水相按体积比1:1加入乙酸乙酯，振摇提取3次，静置2～4小时，取水相，按体积比1:1加入氯仿，振摇提取3次，静置2～4小时，将水相减压浓缩蒸发至干，即得虎眼万年青皂苷。

2.根据权利要求1所述的虎眼万年青皂苷的提取方法，其特征在于所述的阴离子表面活性剂为丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠或十二烷基苯磺酸钠。

3.根据权利要求1或2所述的虎眼万年青皂苷的提取方法，其特征在于所述的乙醇浓度为65～75％。