CN104630118B - 一株杀藻乳化剂产生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株杀藻乳化剂产生菌及其应用，涉及杀藻乳化剂。盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19，保藏编号：CGMCC No.9797。盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19可在制备杀藻乳化剂中应用。盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19发酵液具有优良的乳化活性，其24h乳化指数EI24(emulsification index)高达69％。盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19所产乳化剂粗提物通过50％乙醇沉淀、采用100KD超滤离心管超滤和离子交换层析获得，该粗提物具有较好的杀藻活性，最小抑藻浓度为50mg/L。

Description

一株杀藻乳化剂产生菌及其应用
技术领域
本发明涉及杀藻乳化剂，尤其是涉及一株杀藻乳化剂产生菌及其应用。
背景技术
赤潮作为一种严重的全球性海洋灾害，已经引起世界各国家和地区的高度关注。20世纪以来，随着工农业迅速发展，大量污水排入水域，使得湖泊、内湾、河口和沿海水域受到了严重的有机污染，水体富营养化现象加剧，导致赤潮发生规模和频度呈急剧上升趋势，造成了严重的生态、资源、环境问题和重大的经济损失。近年来，我国有害赤潮的发生有以下趋势：频率增加，规模扩大，新的赤潮藻种不断出现，有毒赤潮藻种比例上升，发生海域向全部近岸海域扩展，时间跨度逐渐加大，有害赤潮危害程度日益增加。赤潮灾害给沿海地区带来了严重的生态、资源和环境问题，并时常造成惨重的经济损失，是海滨生态安全和沿海经济可持续发展的重大威胁，这些严重威胁着我国经济的持续发展和社会的安定。因此，寻求有效的赤潮防治途径，研究新型高效环保的赤潮调控方法，制定有关防治对策，是当前赤潮防控领域中亟须解决的重大问题之一。有害赤潮频发严重危害海洋生态系统，重创海洋经济，因此赤潮的有效预防和治理是赤潮科学研究的永恒主题。
鉴于近年来赤潮造成的巨大经济损失，各国政府均在赤潮科学领域投入大量人力、物力和财力，其最终目的就是有效地控制赤潮，降低赤潮灾害所带来的负面影响。但很不幸的是，到目前为止，完全符合“高效、无毒、价廉、易得”的要求并真正能付诸应用的赤潮治理方法却寥寥无几。目前，国内外已提出的赤潮治理方法，可归纳为化学法、物理法和生物法。物理方法治理赤潮就是利用物理方法和手段分离、去除或杀死赤潮生物，如围隔法、人工过滤打捞法、超声波法、电磁波法、紫外法、引水稀释法等等。物理法虽然对环境干扰较小，但是通常难以应用于大面积有害赤潮。而化学法则是向水体中投入特定的化学药物、凝聚剂或絮凝剂(如羟基药剂、硫酸铜、表面活性剂、黏土等)来杀灭或抑制赤潮生物。化学法虽然易于操作、见效快，而且某些药剂成本较低，但是极易造成二次污染、给业已脆弱的海洋生态环境造成难以挽回的不利影响。因此，人们开始越来越多地将目光投向生物法。
生物法主要是利用赤潮生物与其它生物在长期进化过程中形成的竞争、抑制或捕食等关系，通过向赤潮高发区引入某种生物以达到抑制或杀死赤潮生物的目的，从而减少赤潮的发生及其造成的危害。其中，利用无害藻类的化感作用或其对营养的竞争来抑制有害藻类称为“以藻治藻”；利用微生物(细菌、放线菌、真菌等)分泌抑藻活性物质或通过藻菌胞间接触抑藻称为“以菌治藻”。另外，还可利用藻病毒或噬藻体专一性裂解赤潮生物、利用滤食性贝类和浮游动物等捕食赤潮生物。与传统的物理法和化学法相比，生物法具有显著的优势，如安全可靠、环境污染少、没有二次污染、高效快速、经济实用、可操作性强等。因此，这些基于生物活性的抑藻方法具有非常广阔的应用前景。海水富营养化的有效控制是解决赤潮问题的治本之计，而生物活性抑/杀藻则是在赤潮爆发或临界爆发情况下采用的一种环境友好型的高效灾害应急处理策略，二者相辅相成，不可偏废，只有这样才能标本兼治，最大限度地消除赤潮灾害对海洋生态系统和人类健康的威胁。
目前，藻菌关系研究已较为系统，很多学者认为，有害赤潮的突然消亡与杀藻细菌有着密切的关系(1.Lee S.O.,Kato J.,Takiguchi N.,Kuroda A.,Ikeda T.,MitsutaniA.,Ohtake H.Involvement of an extracellular protease in algicidal activity ofthe marine bacterium Pseudoalteromonas sp strain A28[J].Applied andEnvironmental Microbiology,2000,66(10):4334-4339.)。大多数杀藻细菌通过分泌胞外活性物质间接执行对藻细胞的杀灭作用。研究表明，表面活性剂是一类作用于藻细胞膜系统、专一性强、生态安全性好的环境友好型杀藻物质，如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分泌的鼠李糖脂(2.Wang X.,Gong L.,Liang S.,Han X.,Zhu C.,LiY.Algicidal activity of rhamnolipid biosurfactants produced by Pseudomonasaeruginosa[J].Harmful algae,2005,4(2):433-443；3.Gustafsson S.,Hultberg M.,Figueroa R.I.,Rengefors K..On the control of HAB species using lowbiosurfactant concentrations[J].Harmful Algae,2009,8(6):857-863.)、假丝酵母(Candida bombicola)分泌的槐糖脂(4.Baek S.H.,Sun X.X.,Lee Y.J.,etal.Mitigation of harmful algal blooms by sophorolipid[J].Journal ofmicrobiology and biotechnology,2003,13(5):651-659；5.Sun X.X.,Lee Y.J.,ChoiJ.K.,Kim E.K.Synergistic effect of sophorolipid and loess combination inharmful algal blooms mitigation[J].Marine pollution bulletin,2004,48(9):863-872；6.Sun X.X.,Choi J.K.,Kim E.K.A preliminary study on the mechanism ofharmful algal bloom mitigation by use of sophorolipid treatment[J].Journal ofExperimental Marine Biology and Ecology,2004,304(1):35-49；7.Kim E.Laboratorystudy on the ecological impact of sophorolipid used for harmful algaeelimination[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2010,28(6):1240-1247.)。然而海洋中生活着丰富的表面活性剂产生菌，还有大量未被人类认识和研究的微生物表面活性剂资源，其中可能不乏具有良好抑/杀藻活性的表面活性剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一株杀藻乳化剂产生菌盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19及其应用。
所述盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19已于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9797。
所述盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19的菌落特征如下：菌落呈淡黄色，边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，运动；革兰氏染色阴性。
所述盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19可在制备杀藻乳化剂中应用。
所述杀藻乳化剂的提取方法，包括以下步骤：
1)从盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19斜面挑取一接种环单菌落于zobell 2216E液体培养基中培养，按质量百分比1％接种量接到发酵培养基GMM-N中培养，取细菌发酵液离心，即得发酵液上清；
2)在发酵液上清中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀；
3)对步骤2)得到的沉淀进行洗涤、离心，用水重新溶解乙醇沉析组分，再离心去除沉淀，收集上清液；
4)向步骤3)得到的上清液中加入乙醇，使乳化剂重新沉淀，离心后，重新获得乙醇沉析组分并用水重新溶解，即得乳化剂粗提液；
5)将步骤4)得到的乳化剂粗提液过滤，洗涤，截留组分8～10次，去除小分子物质，冷冻干燥即获得乳化剂粗提物；
6)取步骤5)得到的乳化剂粗提物，用水溶解，将活化后的DEAE-Sepharose FF填料装柱，用水平衡，上样后用水洗脱没有被吸附的乳化剂，再用NaCl溶液洗脱，洗脱液用核酸蛋白质检测仪监测OD280，收集出峰，将出峰超滤除盐浓缩后冷冻干燥备用。
在步骤1)中，所述zobell 2216E液体培养基的用量可为50ml；所述于zobell2216E液体培养基中培养的条件可为：28℃，150rpm培养12～18h；所述发酵培养基GMM-N的配方可为：葡萄糖10g，谷氨酸0.6g，氯化铵2g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾5g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钠24g，pH7.6，蒸馏水定容至1L；所述发酵培养基GMM-N中培养的条件可为：28℃，150rpm培养96h；所述离心的条件可为36000g离心60min。
在步骤2)中，所述加入乙醇可加入等体积-20℃预冷乙醇；所述离心的条件可为10000g离心30min。
在步骤3)中，所述洗涤可采用质量百分浓度为50％乙醇水溶液对沉淀进行洗涤；所述离心的条件可为10000×g，30min，3次；所述水可采用去离子水；所述沉淀中大部分是变性蛋白。
在步骤4)中，所述加入乙醇可加入等体积-20℃预冷乙醇；所述离心的条件可为10000g离心30min；所述水可采用去离子水。
在步骤5)中，所述过滤可采用100KD超滤离心管过滤；所述洗涤可采用去离子水洗涤。
在步骤6)中，所述水可采用去离子水；所述装柱可采用1.6/60cm柱；所述NaCl溶液可采用摩尔浓度为0.2～0.4mol/L的NaCl溶液。
所述杀藻乳化剂可在控制赤潮成因微生物中应用。
本发明通过对乳化剂进行初步分离和杀藻实验获得一株产杀藻乳化剂的细菌盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19，目前还未见Halomonas属细菌分泌的乳化剂具有杀藻活性的报道。
盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19发酵液具有优良的乳化活性，其24h乳化指数EI24(emulsification index)高达69％。盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19所产乳化剂粗提物通过50％乙醇沉淀、采用100KD超滤离心管超滤和离子交换层析获得，该粗提物具有较好的杀藻活性，最小抑藻浓度为50mg/L。
附图说明
图1为DEAE-Sepharose FF离子交换层析结果图。曲线a为洗出液在280nm处的光吸收值；曲线b为洗脱液的相对氯化钠浓度，100％指氯化钠浓度为1M，0％，指氯化钠浓度为0。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：盐单胞菌DHQ19的分离、纯化及保存
海水样品用无菌水经过一系列10倍稀释后，每个稀释液取0.1mL涂布在2216E培养基平板上，在25℃下培养7d，按菌落大小、形态不同将平板上长出的单菌落在2216E固体平板上反复分离纯化。
将已纯化的细菌接种到2216E斜面上，25℃下培养24～48h后4℃保存；同时接种纯化细菌于3mL 2216E液体培养基中，25℃摇培到指数中后期，加入无菌甘油至终浓度10％，于液氮中冻结，1份保存于-70℃，1份保存于-20℃。
实施例2 盐单胞菌DHQ19的鉴定。
通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株DHQ19为盐单胞菌属。具体步骤如下：
采用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(宝生物工程有限公司)提取菌株DNA。选用细菌的16S rDNA通用引物由英潍捷基公司合成：
27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
扩增反应体系：
PCR反应程序如下：
采用试剂盒TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0(宝生物工程有限公司)对PCR产物进行纯化，之后采用solution I将PCR产物与载体T-VectorpMDTM 19(宝生物工程有限公司)连接并转化如E.coli DH5a感受态细胞(宝生物工程有限公司)，通过蓝白斑筛选获得白色菌落送英潍捷基公司进行测序，测序结果在网站eztaxon-e.ezbiocloud.net核酸序列数据库中进行同源序列比较，发现其为盐单胞菌。
基于测序结果和生理生化实验结果，该菌株属于盐单胞属(Halomonas)，已于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC NO.9797。
实施例3 菌株H4乳化剂的杀藻活性
从菌株DHQ19斜面挑取一接种环单菌落于50ml zobell 2216E液体培养基中，28℃，150rpm培养12～18h；1％接种量接到新鲜发酵培养基GMM-N中，28℃，150rpm培养96h；取细菌发酵液，36000g离心60min，获得发酵液上清。向上清液中加入等体积-20℃预冷无水乙醇沉淀上清，4℃静置过夜；10000g离心30min，倾去上清，收集沉淀；50％乙醇水溶液洗涤沉淀3遍，复溶于去离子水中。离心除去不溶性的杂质成分，反复冲洗沉淀，合并上清；向上清液中加入等体积-20℃预冷乙醇，使乳化剂重新沉淀，10000g离心30min，重新获得乙醇沉析组分并用去离子水重新溶解获得乳化剂粗提液；用100KD超滤离心管过滤上清液，并用去离子水重新溶解100KD超滤组分，重复超滤8次(4000×g，30min)，以除去小分子物质和多余盐分；冷冻干燥即获得乳化剂粗提物。取乳化剂粗品若干，去离子水溶解。将活化后的DEAE-Sepharose FF填料装柱(1.6\60cm)，用去离子水平衡，上样后用去离子水洗脱没有被吸附的乳化剂，再用0～1.0mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液用核酸蛋白质检测仪监测OD280，收集出峰，将出峰超滤除盐浓缩后冷冻干燥备用。
洗脱图谱如图1所示，在0.2～0.4mol/L氯化钠浓度范围内有一对称洗脱峰，收集出峰，命名为组分A；1mol/L氯化钠处有一洗脱峰，收集出峰，命名为组分B。
实施例4 乳化剂层析组分的抑藻活性实验
将实施例3中层析组分A和B的冻干粉分别用去离子水溶解，分别配制成10mg/ml存储液，向2ml浓度约为2000cell/ml的锥状斯氏藻f/2培养液中分别添加1.25μL、2.5μL、5μL、10μL，20μL、40μL、80μL存储液，使终浓度分别达到6.25mg/L，12.5mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L，400mg/L，培养7天后，观察微藻生长情况及培养物颜色，未见显著生长即培养液颜色未加深的最低浓度即为最低抑制浓度(MIC)，结果如表1所示，其中组分A最低抑藻浓度为50mg/L，组分B的最低抑藻浓度为200mg/L。
表1乳化剂层析组分A和组分B对锥状斯氏藻的抑制作用
注：“+”表示藻培养液呈棕色，大量藻细胞悬浮在培养液中；“-”表示藻培养液澄清。

Claims (9)

1.盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19在制备杀藻乳化剂中的 应用，其特征在于所述盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19，已于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9797。
2.杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1)从盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19斜面挑取一接种环单菌落于zobell 2216E液体培养基中培养，按质量百分比1％接种量接到发酵培养基GMM-N中培养，取细菌发酵液离心，即得发酵液上清；所述盐单胞菌(Halomonas sp.)DHQ19已于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9797；
所述发酵培养基GMM-N的配方为：葡萄糖10g，谷氨酸0.6g，氯化铵2g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾5g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钠24g，pH7.6，蒸馏水定容至1L；所述发酵培养基GMM-N中培养的条件为：28℃，150rpm培养96h；所述离心的条件为36000g离心60min；
2)在发酵液上清中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀；
3)对步骤2)得到的沉淀进行洗涤、离心，用水重新溶解乙醇沉析组分，再离心去除沉淀，收集上清液；
4)向步骤3)得到的上清液中加入乙醇，使乳化剂重新沉淀，离心后，重新获得乙醇沉析组分并用水重新溶解，即得乳化剂粗提液；
5)将步骤4)得到的乳化剂粗提液过滤，洗涤，截留组分8～10次，去除小分子物质，冷冻干燥即获得乳化剂粗提物；
6)取步骤5)得到的乳化剂粗提物，用水溶解，将活化后的DEAE-Sepharose FF填料装柱，用水平衡，上样后用水洗脱没有被吸附的乳化剂，再用NaCl溶液洗脱，洗脱液用核酸蛋白质检测仪监测OD280，收集洗脱峰，将洗脱峰超滤除盐浓缩后冷冻干燥备用。
3.如权利要求2所述杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于在步骤1)中，所述zobell2216E液体培养基的用量为50ml；所述于zobell 2216E液体培养基中培养的条件为：28℃，150rpm培养12～18h。
4.如权利要求2所述杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于在步骤2)中，所述加入乙醇是加入等体积-20℃预冷乙醇；所述离心的条件为10000g离心30min。
5.如权利要求2所述杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于在步骤3)中，所述洗涤采用质量百分浓度为50％乙醇水溶液对沉淀进行洗涤；所述离心的条件为10000g，30min，3次；所述水采用去离子水；所述沉淀中产物大部分是变性蛋白。
6.如权利要求2所述杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于在步骤4)中，所述加入乙醇是加入等体积-20℃预冷乙醇；所述离心的条件为10000g离心30min；所述水采用去离子水。
7.如权利要求2所述杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于在步骤5)中，所述过滤采用100KD超滤离心管过滤；所述洗涤采用去离子水洗涤。
8.如权利要求2所述杀藻乳化剂的提取方法，其特征在于在步骤6)中，所述水采用去离子水；所述装柱采用1.6/60cm柱；所述NaCl溶液采用摩尔浓度为0.2～0.4mol/L的NaCl溶液。
9.如权利要求2～8中任意一种所述方法提取的杀藻乳化剂在控制赤潮成因微生物中的 应用。
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