CN103484409B - 一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 - Google Patents
一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103484409B CN103484409B CN201310451825.0A CN201310451825A CN103484409B CN 103484409 B CN103484409 B CN 103484409B CN 201310451825 A CN201310451825 A CN 201310451825A CN 103484409 B CN103484409 B CN 103484409B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- algistatic activity
- 30min
- marine bacteria
- activity material
- algistatic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000002581 algistatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 28
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims abstract description 13
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 23
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 9
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RJRZRMYKFWYPNX-UHFFFAOYSA-N [NH4+].[NH4+].CCO.[O-]S([O-])(=O)=O Chemical compound [NH4+].[NH4+].CCO.[O-]S([O-])(=O)=O RJRZRMYKFWYPNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 abstract description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 241000200029 Alexandrium tamarense Species 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 6
- 230000002353 algacidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 4
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000002044 Rhizophora apiculata Species 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001300495 Cochlodinium polykrikoides Species 0.000 description 1
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 108010008292 L-Amino Acid Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007070 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241000192710 Microcystis aeruginosa Species 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000519582 Pseudoalteromonas sp. Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000005422 algal bloom Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 nitrogenous compound Chemical class 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000238 shellfish toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000556533 uncultured marine bacterium Species 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法，涉及一种具有高效抑藻活性的脂类化合物。所述高效抑藻活性化合物的菌株为弧菌（Vibrio sp.）BS02，保藏编号为CCTCC NO：M2010217。所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的分子式为C16H30O2，分子量大小为254。将菌株BS02发酵培养，得含有强抑藻活性化合物的发酵液，离心后，收集上清液，再分离纯化，即得具有强抑藻活性的化合物源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸。所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸能够高效、专一地杀灭藻细胞，具有开发成抑藻剂的潜能，在生物降解藻类、治理赤潮方面具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有高效抑藻活性的脂类化合物，尤其是涉及一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法。
背景技术
近年来，伴随着水产养殖业的大力发展，以及逐年增多的填海造地，不规范的近海海域开发利用，使得水产养殖区水体生态系统遭到破坏，水体生态系统紊乱，氮磷污染消纳能力下降，自净功能逐步丧失，导致我国近海营养盐负荷较重的海区富营养化程度居高不下，赤潮时有发生。素有“水体癌症”之称的有害藻华不仅导致沿海地区出现了严重的生态、资源、环境问题，同时也使沿海城镇的经济蒙受巨额损失。仅2012年以来，福建沿海就发生了八起赤潮，其中5月份平潭流水、苏澳码头附近海域和龙风头海滨浴场海域所引发的赤潮导致逾5000万只鲍鱼死亡，直接经济损失达2亿元人民币。故此，有害赤潮作为水产养殖业的致命杀手，已经引起政府和地区的密切关注，如何研制新型、高效的赤潮调控方法并制定有关赤潮防治对策已成为各级政府和科研工作者的当务之急！
塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）是一种能产生麻痹性贝毒素（PSP）的海洋甲藻，是当前有害赤潮主要原因藻种之一，其所产生的PSP毒素不仅对生态环境产生不利的影响，同时也对人类的健康及海洋经济的发展造成了巨大的威胁。鉴于塔玛亚历山大藻的各种危害，对其防治显得越来越重要。当前藻类控制技术可归结为：物理方法、化学方法及生物防治，其中溶藻微生物防治技术因具有成本低、安全性好的潜能，引起了越来越多研究人员的关注。溶藻细菌（Algicidal bacteria）是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称，具有较好的生态安全性，尤其适合在赤潮发生初期使用，在短期内即可达到控制藻类生物量，阻止藻类大量增殖的效果，势必成为赤潮生物防治的一个重要手段。目前，国内外已有不少对溶藻细菌的报道。
至今为止，大多数筛选到的杀藻细菌是通过分泌特异的具有杀藻活性的物质来起杀藻作用的。已经报道的杀藻活性物质包括：蛋白质（含胞外酶）、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的杀藻化合物（Paul C.,Pohnert G.Interactions of the Algicidal BacteriumKordia algicida with Diatoms:Regulated Protease Excretion for Specific Algal Lysis[J].PLoS One,2011,6(6):e21032；Chen W.M.,Sheu F.S.,Sheu S.Y.Novel L-amino acid oxidase with algicidalactivity against toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa synthesized by a bacteriumAquimarina sp[J].Enzyme Microb Technol,2011,49(4):372-379；Oh J.I.,Kim M.J.,Lee J.Y.,KoI.J.,Kim W.,Kim S.W.Isolation and characterization of algicidal bacteria from Cochlodiniumpolykrikoides culture[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2011,16(6):1124-1133；Lee S.O.,Kato J.,Takiguchi N.,Kuroda A.,Ikeda T.,Mitsutani A.,Ohtake H.Involvement of anextracellular protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strainA28[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(10):4334-4339）。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种生产所述高效抑藻活性化合物的菌株及其筛选方法。
本发明的第二目的是提供一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法。
本发明的第三目的是提供一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸在制备抑藻剂中的应用。
所述高效抑藻活性化合物的菌株为弧菌（Vibrio sp.）BS02，该菌已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010217，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。
所述弧菌（Vibrio sp.）BS02的筛选方法包括以下步骤：
1）取福建漳江口红树林国家自然保护区土壤样品，无菌水经过一系列10倍稀释后，每个稀释液取0.1mL涂布在高氏一号培养基平板上，在25℃下培养5d；
2）挑取不同菌落大小、形态单菌落划线于2216E固体平板，置于28～37℃温度下培养3～5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养；
3）将纯化后的菌株接种于4mL海水配制的高氏一号液体培养基中，置于28℃摇床，150rpm震荡培养3d，取培养液于10,000～12,000g的条件下离心10min，除去菌体沉淀，保存上清；
4）取1mL上清接种于20mL指数生长的无菌塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下培养2d，高氏一号培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻细胞是否沉降，沉降代表菌体7d培养物上清中含有抑藻活性物质，从而筛选出弧菌（Vibrio sp.）BS02。
所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的分子式为C16H30O2，分子量大小为254，结构式如下：
所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的制备方法如下：
1）将弧菌（Vibrio sp.）BS02菌株接种于新鲜海水配制的固体2216E平板上画线分离，于28℃恒温培养箱中培养24h；挑取所述平板上的单菌落接种于海水配制的高氏一号液体培养基中，于28～37℃，180～250rpm培养2～3d后即得发酵液；
2）将步骤1）中的发酵液于10,000～12,000g离心10min；采用乙酸乙酯等体积萃取5次，将乙酸乙酯萃取相合并，旋转蒸干，加甲醇溶解离心，去盐、去蛋白；
3）乙酸乙酯萃取物溶于1mL乙酸乙酯中，上样于硅胶柱（170mm×30mm，200～300目），洗脱剂：二氯甲烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序：体积比1∶0，30min；1∶1,30min；1∶0，30min；洗脱流速：1mL/min；用收集管收集洗脱液2mL/管；
4）每隔10～15min收集样品，收集管内洗脱液利用薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）分析，扩增剂为乙酸乙酯,采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分；
5）合并洗脱液于旋转蒸发仪30℃下真空蒸干，溶解于DMSO验证抑藻活性；
6）活性组分再通过硅胶柱（170mm×30mm，200～300目）层析，洗脱剂：正己烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序：体积比100∶1，30min；60∶1，30min；40∶1，30min；20∶1，30min；洗脱流速：1mL/min；用收集管收集洗脱液2mL/管；重复步骤4）和5）检测活性组份；
7）上述所得活性组份利用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱进一步分离，洗脱流动相采用99%甲醇，每6min收集一组分；收集管内洗脱液利用薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）分析，采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分，于旋转蒸发仪30℃下真空蒸干，溶解于DMSO验证抑藻活性，得源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸。
本发明将菌株弧菌（Vibrio sp.）BS02发酵培养，得含有强抑藻活性化合物的发酵液，离心后，收集上清液，再分离纯化，即得具有强抑藻活性的化合物源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸。所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸能够高效、专一地杀灭藻细胞，具有开发成抑藻剂的潜能，在生物降解藻类、治理赤潮方面具有广泛的应用。
附图说明
图1为温度处理对抑藻活性物质抑藻效率的影响效果图。
图2为pH处理对抑藻活性物质抑藻效率的影响效果图。
图3为透析处理对抑藻活性物质抑藻效率的影响效果图。
图4为不同有机溶剂萃取物抑藻效率效果图。
图5为弧菌（Vibrio sp.）BS02的电镜照片图。
图6为抑藻活性物质MALDI-TOF质谱图。
图7为不同剂量的棕榈油酸对AT3生长的影响效果图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1：弧菌（Vibrio sp.）BS02的分离筛选
1、取福建漳江口红树林国家自然保护区沉积物，于室温放置干燥1个月，取10g干燥土样，溶解于高压灭菌的90mL AC1培养基，置于150～200rpm摇床震荡20～30min，使土样均匀分散；
2、10倍稀释法，涂布均匀分散的样品于AC1（20g可溶性淀粉,1g NaNO3,0.5g K2HPO4,0.5g MgSO4·7H2O,0.01g FeSO4·7H2O,75μg K2Cr2O7,10g琼脂，1L海水）固体平板，置于28～37℃温度下培养3～5d；
3、挑取不同类型单菌落划线于AC1固体平板，置于28～30℃温度下培养3～5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养；
4、接种分离出的纯培养物单菌落于4mL AC1液体培养基，置于28～37℃摇床，180～250rpm震荡培养3～5d，取培养液于10,000～12,000g的条件下离心10min，除去菌体沉淀，上清保存至4.5mL离心管；
5、将1mL上清加入到20mL指数期塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下培养2天，AC1培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻藻细胞是否沉降，沉降代表菌体发酵培养物上清中含有抑藻活性物质，从而筛选出弧菌（Vibrio sp.）BS02。
实施例2：抑藻率计算方法
1、塔玛亚历山大藻在20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下，于三角瓶中培养至指数期，然后分装到24孔细胞培养板中，每孔分装2mL藻细胞悬液，适应生长1d；
2、100μL待测培养物加入24孔板，培养2d；
3、取塔玛亚历山大藻培养液100μL样品于2mL离心管中，无菌海水稀释十倍后用鲁戈氏液固定染色，在光学显微镜下计数。根据以下公式计算抑藻率，同时观察藻细胞形态变化：
抑藻率=（NC-NT）/NC×100%
式中，NC表示对照组中的活细胞数，FT表示实验组中的活细胞数。
实施例3：抑藻活性物质性质鉴定
弧菌（Vibrio sp.）BS02接种于AC1培养基28～37℃摇床，180～250rpm震荡培养3～5d。发酵液在10,000～12,000g的离心力下离心10～20min，获得弧菌（Vibrio sp.）BS02培养液上清。
温度处理实验设计：对含抑藻活性物质的培养液上清进行20℃、40℃、60℃、80℃、100℃及120℃高压30min热处理,设置3个平行实验组；取100μL培养液上清加入2mL藻培养液中，培养2天后，取样按实施例2计算抑藻效率。实验结果（图1）表明：该培养液上清进行温度梯度热处理后，其对塔玛亚历山大藻的抑藻效率没有很大的变化，说明抑藻活性物质具有较好的耐热性。
pH处理实验设计：测定培养液上清pH值，将培养液上清pH分别调至3和11，2h后再将其pH调回处理，以未处理培养液上清为对照组，设置3个平行实验组；取100μL无菌滤液加入2mL藻培养液中，培养24h后，取样按实施例2计算抑藻效率。实验结果（图2）表明：该培养液上清进行酸化和碱化处理后，其对塔玛亚历山大藻的抑藻效率没有很大的变化，说明抑藻活性物质在酸性条件和碱性条件下都比较稳定。
透析处理实验设计：利用分子截留量约为1Kd透析袋，对培养液上清进行透析处理，于PBS缓冲液透析3h后，转入新鲜PBS缓冲液继续透析3h，设置3个平行实验组；对照组为未透析的培养液上清；取100μL培养液上清加入2mL藻培养液中，培养24h后，取样按实施例2计算抑藻效率。实验结果（图3）表明：该培养液上清经过分子截留量约为1Kd的透析袋透析处理后，其对塔玛亚历山大藻的抑藻效率明显降低，其抑藻效率平均仅为18.4%，说明抑藻活性物质分子量小于1Kd。
不同有机溶剂萃取实验设计：选择正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚作为萃取剂，分别以1∶1体积比萃取500mL培养液上清，重复三次萃取。各种有机溶剂提取物于旋转蒸发仪30℃下真空蒸干，获得萃取粗提物。5mL DMSO溶解粗提物，取100μL DMSO溶解物加入2mL藻培养液中，培养24h后，取样按实施例2计算抑藻效率，设置3个平行实验组，及添加DMSO到藻培养液对照组。实验结果（图4）表明：该培养液上清经过不同极性有机溶剂萃取后，抑藻效率显示一定差异，乙酸乙酯萃取物抑藻率较高，平均为69.908%，说明抑藻活性物质极性较弱容易被乙酸乙酯萃取出来。
实施例4：抑藻活性组分硅胶柱层析
如实施例3，100mg乙酸乙酯萃取物溶于1mL乙酸乙酯中，上样于硅胶柱（170mm×30mm，200～300目），洗脱剂：二氯甲烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序：体积比1∶0，30min；1∶1，30min；1∶0，30min；洗脱流速：1mL/min；用收集管收集洗脱液2mL/管；活性组分第二次通过硅胶柱（170mm×30mm，200～300目）层析，洗脱剂：正己烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序：体积比100∶1，30min；60∶1，30min；40∶1，30min；20∶1，30min；洗脱流速：1mL/min；用收集管收集洗脱液2mL/管；
实施例5：抑藻活性组分TLC分析
1）如实施例4，洗脱液利用TLC分析，展开剂为乙酸乙酯，显示剂：0.5%碘的氯仿溶液，根据相同图谱，合并收集管内洗脱液。
2）合并洗脱液于旋转蒸发仪30℃下真空蒸干，溶解于DMSO，按实施例2、实施例3验证抑藻活性。
实施例6：强效抑藻活性化合物的结构鉴定：
实施例5抑藻活性检测，获得抑藻活性部位，经TLC检测，以不同的展开剂在硅胶薄层板上展开均为一个斑点，并经质谱、1H-NMR检测，确定为纯化合物，结构式如下所示：
所述纯化合物（式1）的MALDI-TOF质谱图显示两个离子峰，一个为［M+Na］+离子峰277.16，另一个为［M+K］+离子峰293.14，所以可以判断该物质分子量大概为254。结合13C-NMR（DEPT）谱和1H-NMR谱，推出其分子式为C16H30O2。从HMBC、HSQC、、H-HCOSY及NOSEY的二维图谱，可把各C和H的相关归属确定。经Scifinder数据库检索、与相应文献比对以及综合其理化性质，确定与棕榈油酸一致。
综上所述，本发明提取纯化获得的具有抑藻活性的化合物为棕榈油酸，结构如式1表示。
Claims (1)
1.源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的制备方法，其特征在于所述源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸的分子式为C16H30O2，分子量大小为254，结构式如下：
所述制备方法包括以下步骤：
1)将弧菌(Vibrio sp.)BS02菌株接种于新鲜海水配制的固体2216E平板上画线分离，于28℃恒温培养箱中培养24h；挑取所述平板上的单菌落接种于海水配制的高氏一号液体培养基中，于28～37℃，180～250rpm培养2～3d后即得发酵液；所述弧菌(Vibrio sp.)BS02已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010217；
2)将步骤1)中的发酵液于10,000～12,000g离心10min；采用乙酸乙酯等体积萃取5次，将乙酸乙酯萃取相合并，旋转蒸干，加甲醇溶解离心，去盐、去蛋白；
3)乙酸乙酯萃取物溶于1mL乙酸乙酯中，上样于硅胶柱，所述硅胶柱为170mm×30mm，200～300目，洗脱剂：二氯甲烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序：体积比1∶0，30min；1∶1,30min；1∶0，30min；洗脱流速：1mL/min；用收集管收集洗脱液2mL/管；
4)每隔10～15min收集样品，收集管内洗脱液利用薄层层析分析，扩增剂为乙酸乙酯,采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分；
5)合并洗脱液于旋转蒸发仪30℃下真空蒸干，溶解于DMSO验证抑藻活性；
6)活性组分再通过硅胶柱，所述硅胶柱为170mm×30mm，200～300目；层析，洗脱剂：正己烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脱程序：体积比100∶1，30min；60∶1，30min；40∶1，30min；20∶1，30min；洗脱流速：1mL/min；用收集管收集洗脱液2mL/管；重复步骤4)和5)检测活性组份；
7)上述所得活性组份利用Sephadex LH‐20葡聚糖凝胶柱进一步分离，洗脱流动相采用99％甲醇，每6min收集一组分；收集管内洗脱液利用薄层层析分析，采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分，于旋转蒸发仪30℃下真空蒸干，溶解于DMSO验证抑藻活性，得源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310451825.0A CN103484409B (zh) | 2013-09-27 | 2013-09-27 | 一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310451825.0A CN103484409B (zh) | 2013-09-27 | 2013-09-27 | 一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103484409A CN103484409A (zh) | 2014-01-01 |
| CN103484409B true CN103484409B (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=49825005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310451825.0A Active CN103484409B (zh) | 2013-09-27 | 2013-09-27 | 一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103484409B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107188797B (zh) * | 2017-05-23 | 2020-08-28 | 集美大学 | 一种从海洋球石藻中提取棕榈酸的方法 |
| CN111991385A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-27 | 暨南大学 | 棕榈油酸在抑制水产病原菌中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154181B (zh) * | 2011-02-18 | 2012-07-04 | 厦门大学 | 一种弧菌bs02的培养基及其制备方法 |
-
2013
- 2013-09-27 CN CN201310451825.0A patent/CN103484409B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103484409A (zh) | 2014-01-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101845468B (zh) | 一种鼠李糖脂的制备方法及其应用 | |
| CN103070167B (zh) | 一种鼠李糖脂作为助剂的应用 | |
| CN103497980B (zh) | 尼日利亚菌素的制备方法 | |
| Wang et al. | Effects of three macroalgae, Ulva linza (Chlorophyta), Corallina pilulifera (Rhodophyta) and Sargassum thunbergii (Phaeophyta) on the growth of the red tide microalga Prorocentrum donghaiense under laboratory conditions | |
| US20120244603A1 (en) | Production of Cyanobacterial or Algal Biomass Using Chitin as a Nitrogen Source | |
| CN100408643C (zh) | 海洋微生物发酵产生的化合物在抗生物污损中的应用 | |
| CN103202295B (zh) | 一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用 | |
| CN103937726A (zh) | 一种溶藻铜绿假单胞菌及其用途 | |
| CN103451105B (zh) | 一种高吸附镉的丝状真菌产黄青霉j-5及制备方法和应用 | |
| US10173913B2 (en) | Process of treating buchu mercaptan production wastewater using microalgae and chitin as a nitrogen source | |
| CN103484409B (zh) | 一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 | |
| CN103911321B (zh) | 海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用 | |
| Effiong et al. | Sustainable utilization of agricultural straw for harmful algal blooms control: a review | |
| CN105950500A (zh) | 一株溶藻气单胞菌及其在控制蓝藻水华中的应用 | |
| CN103952359A (zh) | 一株短波单胞菌及其应用 | |
| CN104152389A (zh) | 高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 | |
| CN102206605B (zh) | 具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用 | |
| CN101444228B (zh) | 一种海洋放线菌发酵提取物及其组合物和在抗生物污损的应用 | |
| CN102899270B (zh) | 拟除虫菊酯类农药降解菌及其分离纯化方法和应用 | |
| CN104232524B (zh) | 抑藻活性物质灵菌红素及其制备方法 | |
| CN108130287B (zh) | 一种黄杆菌、分泌物的应用及制备方法 | |
| CN102321089A (zh) | 一种螺环生物碱化合物及其制备方法和抗海洋生物污损方面的应用 | |
| CN104561104A (zh) | 一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用 | |
| CN104630119A (zh) | 抑藻活性物质紫色杆菌素及其制备方法 | |
| CN104630118B (zh) | 一株杀藻乳化剂产生菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |