CN102154181B - 一种弧菌bs02的培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种弧菌BS02的培养基及其制备方法。涉及微生物培养基，提供一种适合于培养弧菌BS02，可显著提高其细胞生物量和杀藻活性物质产量的培养基。将胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、NaCl、MgSO₄·7H₂O、KCl、K₂HPO₄·3H₂O、CaCl₂·2H₂O、Fe₂(SO₄)₃加入蒸馏水中定容至1L，灭菌后即得弧菌BS02的培养基。以LB培养基为基础培养基，考察了培养基组分和添加量对弧菌BS02摇瓶培养的影响，并利用Plackett-Burman(PB)设计法和响应面优化设计法对培养基进行优化，开发出了一个适合高密度培养弧菌BS02的复合培养基。

Description

一种弧菌BS02的培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物培养基，尤其涉及一种弧菌BS02的培养基及其制备方法。

背景技术

随着现代工业化的快速发展和人口的增多，大量的工农业废水和生活污水不经任何处理直接排放到海洋中，引起海洋水体富营养化加剧，赤潮频繁发生(1、Hallegraeff GM.A reviewof harmful algal blooms and their apparent global increase[J].Phycologia.1993，32：79-99)。有害赤潮已成为全球性的海洋灾害，严重制约了沿海经济的发展，破坏海洋生态环境和威胁人类健康，因而如何有效的防治赤潮成为当前国内外急需解决的难题。

在海洋生态系统中，微生物在海洋生物多样性、海洋生物丰度及海洋循环系统中占据重要的地位。海洋微生物在赤潮生消的过程中所扮演的重要角色也越来越受到相关研究人员的关注。研究报道较多的是杀藻细菌通过分泌胞外杀藻活性物质杀藻，细菌可以通过分泌胞外物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素、羟胺和含氮化合物等杀死藻细胞(2、Amaro AM，Fuentes MS，Ogalde SR，et al.Identification and characterization of potentially algal-lytic marinebacteria strongly associated with the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella[J].J EukaryotMicrobiol，2005，52(3)：191-200)。

目前，利用杀藻细菌控制赤潮的研究还处于起步阶段，而且赤潮灾害具有复杂性和多样性的特点，必须在了解杀藻细菌的杀藻机制的基础上进一步优化其发酵条件，从而生产高效的杀藻剂。目前，对大规模发酵生产杀藻物质进行杀藻正处于初始阶段，因此须对杀藻微生物的发酵条件进行优化，以及对该培养条件进行放大，从而达到工业生产应用级别，为今后应用微生物杀藻打下一个坚实的基础。

微生物发酵是一个极其复杂的生物过程，涉及到许多相互影响的因素，产物生物合成水平除受微生物内部代谢机理、调控机制等影响外，适宜的培养基配方成为微生物发酵的关键因素，而一般的培养基种类多且各成分的相互作用复杂，因此，培养基的优化工作显得尤为重要。目前比较成熟的优化培养基的方法有Plackett-Burman(PB)设计法、单因素法、正交设计法、均匀设计法、响应面优化设计法等。人们努力寻找一种试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究因素间交互作用的回归分析方法。Plackett-Burman(PB)设计法和响应面优化设计法能减少实验的次数，很好的拟合因素与响应间的全局函数关系，有助于快速建模，缩短优化时间和提高应用可信度。

Plackett-Burman(PB)设计法是一种两水平的试验设计方法，它试图用最少试验次数达到使因素的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用(3、Xia Li，Tongcheng Xu，Xiaohang Ma et al.Optimiz ationof culture conditions for production of cis-epoxysuccinic acid hydrolase using response surfacemethodology.Bioresource Technology.2008，99，5391-5396)。PB方法主要通过对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。筛选试验设计不能区分主效应与交互作用的影响，但对显著影响的因子可以确定出来，从而达到筛选的目的，避免在后期的优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源。响应曲面分析法(response surface analysis，RSA)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，是数学方法和统计方法结合的产物，它可以用来对人们受多个变量影响的响应问题进行数学建模与统计分析，并可以将该响应进行优化，其目的是优化这个响应，确定系统的最优进行条件或确定因素空间中满足进行规范的区域。响应面优化设计法目前已成为降低成本、优化加工条件的一种有效方法，广泛地应用于农业、生物、食品、化学等领域(4、李铭，杨亚力，杨顺楷.响应面法优化固定粘红酵母细胞条件及生物转化制L-苯丙氨酸.应用与环境生物学报.2010，16(2)：279-284)。其中最常用的是Box-Behnken设计法(BBD)和中心组合设计法(Central composite design，CCD)。其中，与中心复合试验相比，Box-Behnken试验设计不存在轴向点，因而在实际操作时其水平设置不会超出安全操作范围，并且在因素数相同时比中心复合设计所需的试验次数少。Box-Behnken设计法可以进行因素数在3～7个范围内的试验，试验次数一般为15～62次。

通过将上述主要适用范围不同的优化设计进行合理的联用可大大加快目标最优值的获得。目前较为常用的是Plackett-Burman(PB)设计法和响应面优化设计法的联用，可通过摇瓶验试先用PB设计法从多种培养基中确定重要因素，然后用响应面优化设计法得到个重要因素的最佳水平值(5、褚以文.微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件[J].国外医药抗生素分册，1999，20(2)：58-66)。这两种方法的联用能减少实验的次数，很好的拟合因素与响应间的全局函数关系，有助于快速建模，缩短优化时间和提高应用可信度。其基本思路为：通过Plackett-Burman(PB)法筛选出主要的影响因素，然后通过最陡爬坡实验快速寻找最优区域，然后利用区域中心点进行中心组合设计法(CCD)或Box-Behnken设计法(BBD)建立回归方程，最后对方程求极值得到最优组合。周海鸥等人应用PB设计法对影响桑黄发酵的培养基组成进行筛选，再采用中心组合设计法(CCD)或Box-Behnken设计法(BBD)结合响应面对影响菌丝得率的关键因素最佳水平进行了深入研究，并通过二次方程回归求解得到最优化条件。朱会霞等人(6、朱会霞，孙金旭.Nisin液体发酵工艺条件的响应面分析优化.中国乳品工业.2009，37(8)：31-34)应用PB设计法对影响乳链菌肽液体发酵培养基组分进行了筛选，然后采用最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域，找到了最优化的水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于培养弧菌BS02(Vibrio sp.BS02)，可显著提高其细胞生物量和杀藻活性物质产量的弧菌BS02的培养基。

本发明的另一目的在于提供弧菌BS02(Vibrio sp.BS02)的培养基的制备方法。

所述弧菌BS02(Vibrio sp.BS02)已于2010年09月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学(邮编430072)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010217。

所述弧菌BS02(Vibrio sp.BS02)是一种杀藻菌。

所述弧菌BS02的培养基的组成为，在1L的蒸馏水中含有：

胰蛋白胨        1.5～2.7g；

酵母粉          0.75～2.25g；

葡萄糖          0.5～1.0g；

NaCl            20～30g，

MgSO₄·7H₂O     0.1～0.3g；

KCl             1～3g；

KBr             0.1～0.5g；

K₂HPO₄·3H₂O    0.07～0.21g；

CaCl₂·2H₂O     0.25～1.0g；

Fe₂(SO₄)₃       0.02～0.04g。

所述弧菌BS02的培养基的组成最好为，在1L的蒸馏水中含有：

胰蛋白胨        2.7g；

酵母粉          2.95g；

葡萄糖          0.17g；

NaCl            25g；

MgSO₄·7H₂O     0.2g；

KCl             2g；

K₂HPO₄·3H₂O    0.14g；

CaCl₂·2H₂O    1.15g；

Fe₂(SO₄)₃      0.03。

所述弧菌BS02的培养基的制备方法为：

将胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、NaCl、MgSO₄·7H₂O、KCl、K₂HPO₄·3H₂O、CaCl₂·2H₂O、Fe₂(SO₄)₃加入蒸馏水中定容至1L，灭菌后即得弧菌BS02的培养基。

所述灭菌，可采用高压灭菌，所述高压灭菌的条件可为：121℃，20min。

微生物发酵是一个极其复杂的生物过程，涉及到许多相互影响的因素，产物生物合成水平除受微生物内部代谢机理、调控机制等影响外，适宜的培养基配方成为微生物发酵的关键因素。LB培养基作为分离、培养海洋细菌的传统培养基在实践中具有重要作用，但不同的细菌有不同的营养需求。故要对弧菌培养基配方进行优化，从而促进杀藻物质的产生和杀藻剂的研制。本发明以LB培养基为基础培养基，考察了培养基组分和添加量对弧菌BS02摇瓶培养的影响，并利用Plackett-Burman(PB)设计法和响应面优化设计法对培养基进行优化，开发出了一个适合高密度培养弧菌BS02的复合培养基。

附图说明

图1为本发明中弧菌BS02的生物量与杀藻效果相应曲线图。在图1中，横坐标为培养时间(h)，左纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD₆₀₀，右纵坐标为半致死率LD₅₀(％)；柱状图为OD₆₀₀，折线图为半致死率LD₅₀。

图2为不同培养基对Vibrio sp.BS02生长及杀藻效果的影响图。在图2中，横坐标为不同培养基种类，从左到右依次为2216E、B培养基、BK培养基、LB培养基、PY培养基、胰蛋白胨NaCl培养基、牛肉膏琼脂培养基，左纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD₆₀₀，右纵坐标为半致死率LD₅₀(％)；柱状图为OD₆₀₀，折线图为半致死率LD₅₀。

图3为根据回归模型做出的酵母粉和葡萄糖的响应面图。在图3中，X轴代表X₂酵母粉(g/L)，Y轴代表波长在600nm下的光密度值OD₆₀₀，Z轴代表X₃葡萄糖(g/L)。

图4为根据回归模型做出的酵母粉和葡萄糖的等高线图。在图4中，横坐标轴为X₂酵母粉(g/L)，纵坐标为X₃葡萄糖(g/L)。

图5根据回归模型做出的酵母粉和CaCl₂·2H₂O的响应面图。在图4中，X轴代表X₂酵母粉(g/L)，Y轴代表波长在600nm下的光密度值OD₆₀₀，Z轴代表X₉CaCl₂·2H₂O(g/L)。

图6根据回归模型做出的酵母粉和CaCl₂·2H₂O的等高线图。在图6中，横坐标轴为X₂酵母粉(g/L)，纵坐标为X₉CaCl₂·2H₂O(g/L)。

图7根据回归模型做出的葡萄糖(X₃)和CaCl₂·2H₂O(X₉)的响应面图。在图7中，X轴代表X₃葡萄糖(g/L)，Y轴代表波长在600nm下的光密度值OD₆₀₀，Z轴代表X₉CaCl₂·2H₂O(g/L)。

图8为根据回归模型做出的葡萄糖(X₃)和CaCl₂·2H₂O(X₉)的等高线图。在图8中，横坐标轴为X₃葡萄糖(g/L)，纵坐标为X₉CaCl₂·2H₂O(g/L)。

图9优化前后弧菌BS02培养基摇瓶培养生物量及杀藻效果对比结果图。在图9中，横坐标为优化前后的培养基，左纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD₆₀₀，右纵坐标为半致死率LD₅₀(％)；柱状图为OD₆₀₀，折线图为半致死率LD₅₀。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

本发明所用菌种、藻种、培养基和测定方法为：

菌种：弧菌BS02由厦门大学应用与环境微生物研究所依常规方法从漳江口云霄红树林沉积物中分离的一株具有较强杀藻活性的细菌，初步鉴定此菌为弧菌属(Vibrio sp.)。

藻种：Alexandrium tamarense(AT)无菌株，藻种购自暨南大学水生生物研究所，经本申请人无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株。藻类所用培养基为f/2培养基。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20±1℃，光照条件为：12h光照/12h黑暗。

培养基：

筛选培养基(2216E)：蛋白胨(Peptone)5g，酵母提取物(Yeast Extract)1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g(固体培养基)，pH7.6～7.8，陈海水定容到1L。

基础培养基(LB)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KBr 0.1g，陈海水定容到1L，pH 7.5。

以下给出浊度和杀率的测定方法：

1)浊度：取适当原液或是稀释的菌体发酵液，以2216E培养基为对照，采用分光光度计在波长600nm下测定光密度(OD₆₀₀)值。

2)杀藻率：取发酵培养后的无细胞滤液，按照1％的比例加入测试藻类中，作用24h后用鲁戈氏液固定染色，在光学显微镜下计数。杀藻率(％)＝(Nc-Nt)/Nc×100，式中，Nc表示对照组中的活细胞数，Nt表示实验组中的活细胞数。

实施例1

筛选合适的基础培养基，选取合适的培养基成分，利用Plackett-Burman(PB)设计法筛选显著因子，通过最陡爬坡试验寻找显著因子的最优区域，然后采用Box-Behnken设计法建立回归方程，最后对方程求极值得到最优组合。本发明中的实验设计、数据分析采用Minitab 13.0数据处理软件。

1)生物量与杀藻效果的关系

将活化的BS02菌株按1％接种量转接到装有100mL 2216E的三角瓶中，3个平行。每4h取样测定OD₆₀₀，离心去除细胞，4℃冰箱保存以测定杀藻效果。

结果表明，在菌株生长的指数期大约8到20h内，随着菌株生物量的增加，杀藻效果也在逐渐的增加。24h以后，菌株的生长达到稳定期，随后的杀藻效果均达到71％以上，变化较小(参见图1)因此选取培养时间为12h，可以选用生物量OD₆₀₀来代替波动性较大的半致死剂量LD₅₀作为响应值进行以后的优化试验。

2)基础培养基的选择

分别配制各种培养基：胰蛋白胨-NaCl，牛肉膏琼脂，B培养基，PY培养基，BK培养基，LB培养基和2216E培养基7种培养基，选用250mL的三角瓶，分装100mL/瓶，115℃灭菌30min，备用。

将活化好的BS02(OD₆₀₀＝1.125)菌液按1％的比例接入上述7种培养基中，各3个平行，150rpm，28℃摇床培养12h。

取样测定OD₆₀₀，剩余样品7000rpm离心取上清，用于测定其杀藻活性，以灭菌的蒸馏水做为对照，计算不同培养基对塔玛亚历山大藻的半数致死剂量(LD₅₀)。

实验结果显示，该菌在LB培养基中，其生物量和杀藻率可达到较高值，故以LB培养基为基础培养基进一步优化(参见图2)。

实施例2

根据前期实验，基于响应面分析法对弧菌BS02的培养基进行优化：

1)Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman设计法是一种以不完全平衡块(balanced incomplete blocks)为原理的部分析因实验设计法，是一种两水平的试验设计方法，它试图用最少试验次数达到使因素的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用。对于N次实验至多可研究(N-1)个因素，但实际因素应该要少于N-1个，至少要有1个虚构变量用以估计误差。每个因素取两个水平：低水平为原始培养条件，高水平约取低水平的1.25倍。

结合上述结果，采用生物量(OD₆₀₀)最大，杀藻效果最好(LD₅₀)的LB培养基做为基础培养基进一步优化。通过minitab13.0软件进行试验设计，本实验选取影响因素10个，预留3个空项(Dummy)作误差分析，选用了N＝16的PB试验设计表。各参数所代表因素及水平见表格(参见表1、表2)。表1中X₁，X₂，X₃，X₄，X₅，X₆，X₇，X₈，X₉，和X₁₀分别代表胰蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，NaCl，MgSO₄·7H₂O，KCl，KBr，K₂HPO₄·3H₂O，CaCl₂·2H₂O，Fe₂(SO₄)₃；X₁₁，X₁₂和X₁₃代表空项；Y代表OD₆₀₀平均值。

表1

首先筛选出对OD₆₀₀影响显著(P＜0.05)的关键因子，以OD₆₀₀为响应值得到一阶拟合回归方程：Y＝1.5+0.2X₁+0.26X₂-0.4X₃+0.2X₅+0.2X₉

分析结果表示，X₄(NaCl)，X₆(KCl)，X₇(KBr)，X₈(K₂PO₄·3H₂O)，X₁₀(Fe₂(SO₄)₃)为非显著影响因子。X₁(胰蛋白胨)，X₂(酵母粉)，X₃(葡萄糖)，X₅(MgSO₄·7H₂O)，X₉(CaCl₂·2H₂O)为显著影响因子，其中X₁，X₂，X₅，X₉为正效应，X₃为负效应。

本研究的主要目的是提高菌株BS02的杀藻效果，但是由于代表杀藻效果的LD₅₀误差比较大，波动性比较大，而且OD₆₀₀与杀藻效果之间具有一个相应的关系，随着OD₆₀₀的增加，杀藻效果也逐渐增加。因此采用OD₆₀₀作为最终的优化响应值。从PB实验结果看出，有五个显著影响因子，选择显著性最大的三个影响因子X₂，X₃和X₉做下面的最陡爬坡试验试验。

表2

表3

2)最陡爬坡试验

响应面拟合方程只在考察的紧接区域里才充分近似真实情形，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域。

找出主要影响因素之后，通过时主要因素同时朝响应值增大的方向变化，找出峰值，逼近最大响应区间。根据这主要因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验。可以得到最优条件可能所在的位置，以该条件为响应面实验的中心点。

拟合的一阶回归方程中，X₂，X₉为正效应，所以要离开设计中心，沿着最陡上升路径移动。X₃为负效应，所以要靠近设计中心沿最陡下降路径移动。其余的因子则按高水平与低水平的平均值加入。最陡爬坡试验表明(参见表3)，相应变量Y(OD₆₀₀)值接近最大响应值区域。因此，以处理10的培养基组分为原点进行响应面分析试验设计。

5)响应曲面试验设计

Box-Behnken设计法每个因素取3个水平，以(-1，0，1)编码。根据相应的实验表进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定的水平范围内求出最佳值。

采用Box-Behnken法，对Plackett-Burman试验设计筛选出来的显著因子和最陡爬坡试验确定的浓度进行进一步研究，以获得最佳培养基。根据Box-Behnken的设计原理，3因素各取3水平，设计了3因素3水平包括三个中心点共15个试验点的响应面分析试验，以测得的OD₆₀₀为响应值。

根据试验结果(参见表4、表5)，用minitab 13.0分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表(参见表6)。以OD₆₀₀为响应值，景二次回归拟合后球的响应函数。从回归分析结果可知，在α＝0.05水平只有X₉，X₂X₂，X₃X₃，X₃X₉四个因素在模型中显著，因此回归方程为：Y＝2.3987-0.0288X₉-0.1023X₂ ²-0.027X₃ ²-0.0292X₃X₉

复相关系数R²＝0.973，说明拟合程度很好，试验误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。

表4

表5

表6

根据回归模型做出相应的响应面和等高线图(参见图3～8)，对模型进行计算得到培养基中的各组分最佳用量：酵母粉2.95g/L，葡萄糖0.17g/L，CaCl₂·2H₂O 115g/L。建立回归方程得到培养基有关组分关系的回归模型，验证该模型的合理性，可以很好的预测和分析最佳响应值。对模型进行计算得到培养基中的各组分最佳用量：胰蛋白胨2.7g/L，酵母粉2.95g/L，葡萄糖0.17g/L，NaCl 25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KCl 2g/L，KBr 0.3g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.14g/L，CaCl₂·2H₂O 1.15g/L，Fe₂(SO₄)₃ 0.03g/L。

6)摇瓶试验

通过上述优化实验，得到了弧菌BS02的最优培养基配方。选取基础培养基LB和优化出来的培养基，进行摇瓶试验，比较前后生物量(OD₆₀₀)以及杀藻效果(LD₅₀)的改变。按上述培养基配方配制LB以及优化后的培养基，分装于250mL的三角瓶中，50mL/瓶。按1％的接种量接入活化后的菌种BS02(OD₆₀₀＝0.890)，培养12h，测定OD₆₀₀，同时测定LD₅₀，比较优化前后生物量以及杀藻效果的变化。优化后的培养基与基础培养LB培养基相比较，生物量增加了10.44％，通过二者LD₅₀比较可知，优化后的培养基其LD₅₀为0.66％，比基础培养基LB下降了42.2％(参见图6)。这将为下一步做分离纯化杀藻活性物质以及杀藻机理的研究奠定了良好的基础。

Claims (3)

1.一种弧菌BS02的培养基，其特征在于所述弧菌BS02于2010年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010217；

所述弧菌BS02的培养基的组成是在1L的蒸馏水中含有：

胰蛋白胨       2.7g；

酵母粉         2.95g；

葡萄糖         0.17g；

NaCl           25g；

MgSO₄·7H₂O    0.2g；

KCl            2g；

KBr            0.3g

K₂HPO₄·3H₂O   0.14g；

CaCl₂·2H₂O    1.15g；

Fe₂(SO₄)₃      0.03g。

2.如权利要求1所述的一种弧菌BS02的培养基的制备方法，其特征在于其具体步骤为：将胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、NaCl、MgSO₄·7H₂O、KCl、KBr、K₂HPO₄·3H₂O、CaCl₂·2H₂O、Fe₂(SO₄)₃加入蒸馏水中定容至1L，灭菌后即得弧菌BS02的培养基。

3.如权利要求2所述的一种弧菌BS02的培养基的制备方法，其特征在于所述灭菌的条件为：温度121℃，时间20min。

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