CN104592375A - 一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法 - Google Patents

一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，将已脱胶的熟丝溶解在LiBr溶液中，通过透析、离心、浓缩等步骤获得丝素蛋白溶液，将一定浓度的丝素蛋白溶液与不同分子量及浓度的聚乙二醇溶液放置在不同的温度条件下再按照一定体积比共混，并用吸枪上下来回轻轻推打使共混液混合均匀；在室温条件下孵育一段时间，然后离心，离心之后用去离子水洗涤，去除上清液，反复操作三次，冷冻干燥后便可收集到干燥的丝素微球。本发明选择药用助剂聚乙二醇与丝素蛋白溶液共混来制备丝素微球，制备过程不需要复杂的装置，操作流程简单易行、耗时短、成本低，而且不添加有机溶剂，所制备的丝素微球生物安全性高，可直接应用于临床。

Description

一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法
技术领域
本发明涉及一种丝素微球的制备方法，具体的说，是一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法。
背景技术
丝素蛋白是蚕丝中最重要的组成部分，约占重量的70％，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸组成，是一种天然蛋白质。丝素蛋白具有优良的理化性能，无毒、无刺激性、生物相容性好、可生物降解，在很大程度上满足生物材料的需求，同时丝素蛋白具有优异的加工性能，可以制备成膜、凝胶、微球、多孔支架等，为药物载体提供了广阔的材料应用范围。中国专利申请第201310203722.2号公开了一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，该方法通过将丝素蛋白水溶液和聚乙二醇或丙二醇溶液混合后凝固形成凝胶，由于凝胶颗粒的粒径较小不适用于负载药物，因此有必要开发一种简单可行的方法来制备丝素微球以作为药物载体。
目前制备丝素微球的方法主要有乳剂-有机溶剂蒸发/抽提法、相分离法、自组装法、超临界流体快速膨胀法、脂质体模板制备法、微流控法和喷雾干燥法等。乳化法、自组装法、脂质模板法都需要添加有机溶剂，而有机溶剂的残留会直接限制丝素微球在临床上的应用。超临界流体快速膨胀法、微流控法和喷雾干燥法虽然比较简单，但装置和制备条件都比较复杂。相分离法的制备过程虽然相对简单并安全无毒，但操作流程比较繁琐。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于克服现有丝素微球制备过程中有机溶剂残留、工序复杂、耗时长、成本高、不利于产业化生产和临床应用的缺点，提供一种高效安全、快速简单、资源利用度好、生产成本低、生物相容性好的丝素微球的制备方法。
本发明提供的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将质量百分比为1-30％的丝素蛋白溶液与质量百分比为10-60％的聚乙二醇溶液放置在4-60℃温度条件下30min，然后按一定比例将所述丝素蛋白溶液和聚乙二醇溶液混合均匀，孵育一定时间后离心洗涤，配制成丝素微球悬浮液。
进一步的，所述聚乙二醇的分子量范围为2000-20000。
进一步的，所述聚乙二醇的分子量的范围为4000-20000。
进一步的，所述聚乙二醇分子量为4000、6000的浓度范围是质量百分比为30-60％；分子量为10000的浓度范围是质量百分比为20-50％；分子量为20000的浓度范围是质量百分比为20-40％。
进一步的，所述丝素蛋白溶液的稀释范围是质量百分比为5-15％。
进一步的，所述丝素蛋白溶液和聚乙二醇溶液的放置温度范围为室温至60℃。
进一步的，所述丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇溶液的体积比范围是5:1-1:10。
进一步的，所述丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇溶液的体积比范围是2:1-1:5。
进一步的，所述孵育条件为：室温孵育1-24h。
进一步的，所述丝素蛋白溶液的制备步骤如下：将已脱胶的熟丝浸润在9.3M的LiBr溶液中并置于60℃烘箱中4h，溶解后得到丝素蛋白溶液；将该丝素蛋白溶液倒入透析袋中用去离子水透析3d；透析结束后将丝素蛋白溶液离心去除不溶物杂质，然后倒入透析袋中用分子量20000、15wt％的聚乙二醇溶液透析24h，获得浓缩丝素蛋白溶液。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明选择药用助剂聚乙二醇与丝素蛋白溶液共混来制备丝素微球，制备过程不需要复杂的装置，操作流程简单易行、耗时短、成本低，而且不添加有机溶剂，所制备的丝素微球生物安全性高，可直接应用于临床。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是分子量4000、浓度40wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图2是分子量4000、浓度60wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图3是分子量6000、浓度40wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图4是分子量6000、浓度60wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图5是分子量10000、浓度30wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图6是分子量10000、浓度40wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图7是分子量20000、浓度20wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图8是分子量20000、浓度30wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图9是分子量20000、浓度40wt％的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的扫描电镜图；
图10是不同分子量及浓度的PEG溶液与8wt％丝素蛋白溶液共混所制备的丝素微球的粒径分布图；
图11是分子量10000、浓度50wt％的PEG溶液与5wt％丝素蛋白共混所制备的丝素微球扫描电镜图；
图12是分子量10000、浓度50wt％的PEG溶液与9wt％丝素蛋白共混所制备的丝素微球扫描电镜图；
图13是是分子量4000、浓度60％的PEG溶液与5wt％丝素蛋白共混所制备的丝素微球扫描电镜图；
图14是分子量4000、浓度30％的PEG溶液与5wt％丝素蛋白共混所制备的丝素微球扫描电镜图；
图15是分子量6000、浓度30％的PEG溶液与5wt％丝素蛋白共混制备的丝素微球扫描电镜图；
图16是9wt％丝素蛋白溶液制备的姜黄素-丝素微球的激光共聚焦图(荧光)；
图17是9wt％丝素蛋白溶液制备的姜黄素-丝素微球的激光共聚焦图(明场)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
丝素蛋白溶液的制备
称取25g已脱胶熟丝浸润在100mL 9.3M的溴化锂溶液中，之后放置在60℃烘箱中4h，每隔1h搅拌一次直至完全溶解，得到20％(w/v)的丝素蛋白溶液。将该丝素蛋白溶液倒入截留分子量为3500的Slide-a-lyzer透析袋中。将透析袋放入盛有去离子水的透析水槽中透析三天，期间换水10次。透析结束后的丝素蛋白溶液在离心机中以9000rpm/min、20min、4℃的条件离心，然后去除不溶物杂质。丝素蛋白溶液浓度的测定是先称取一定质量的丝素蛋白溶液，放在60℃烘箱中烘干，之后称重，两者之比为浓度值(质量百分比，wt％)。通常所获得丝素蛋白溶液的浓度约为7wt％。丝素蛋白溶液的浓缩过程是将制备好的丝素蛋白溶液100mL移入到同样的Slide-a-lyzer透析袋中，再将透析袋放置在15wt％、分子量20000、800mL的聚乙二醇溶液中连续透析24h，获得约30wt％的浓缩丝素蛋白溶液，放置在4℃冰箱中保存。
实施例2
聚乙二醇-丝素蛋白共混液的制备
将实施例1中的30wt％丝素蛋白溶液稀释至1％-5wt％；
将不同分子量的聚乙二醇(PEG)溶液配置成不同的浓度，分子量低于1000的聚乙二醇的浓度为40-100wt％；聚乙二醇分子量1000-6000的浓度为10-60wt％；分子量10000的浓度为10-50wt％；分子量20000的浓度为10-40wt％；
分别取等体积的1-5wt％丝素蛋白溶液至等体积的不同分子量及浓度的聚乙二醇溶液中，用吸枪上下来回轻轻推打，使共混液混合均匀；
将聚乙二醇-丝素蛋白共混液放置在室温条件下孵育30min；
观察孵育后共混溶液的状态，并记录。
实施例3
聚乙二醇-丝素蛋白共混液的制备
将实施例1中的30wt％丝素蛋白溶液稀释至6-30wt％；
将不同分子量的聚乙二醇配置成不同的浓度，聚乙二醇分子量2000-6000的浓度为10-60wt％；分子量10000的浓度为10-50wt％；分子量20000的浓度为10-40wt％；
分别取等体积的6-30wt％丝素蛋白溶液至等体积的不同分子量及浓度的聚乙二醇溶液中，用吸枪上下来回轻轻推打，使共混液混合均匀；
将聚乙二醇-丝素蛋白共混液放置在室温条件下孵育30min；
观察孵育后共混溶液的状态，并记录。
通过表1总结实施例1与实施例2中的实验结果，从记录的数据可以看出，分子量高的聚乙二醇容易与丝素蛋白溶液共混形成颗粒；聚乙二醇的分子量及浓度和丝素蛋白溶液的浓度是形成颗粒的直接影响因素。
表1丝素蛋白与聚乙二醇溶液共混30min后的状态表
实施例4
丝素微球的制备
分别配置分子量4000的聚乙二醇溶液的浓度为40wt％、60wt％，分子量6000的聚乙二醇溶液的浓度为40wt％、60wt％，分子量10000的聚乙二醇溶液的浓度为30wt％、40wt％、50wt％，分子量20000的聚乙二醇溶液的浓度为20wt％、30wt％、40wt％；
将实施例1中的30wt％丝素蛋白溶液稀释至8wt％，取该溶液至等体积的上述浓度及分子量的聚乙二醇溶液中；
将聚乙二醇-丝素蛋白共混液放置在室温条件下孵育12h；
孵育结束后，将离心管放置在离心机中离心，条件：室温，10min，12000rpm/min；
加入去离子水洗涤，去除上清液，反复离心，洗涤操作三次；
用去离子水配置丝素微球的悬浮液，放置在4℃冰箱中或经冷冻真空干燥后保存。
参见图1至9所示，它是本实例制备的丝素微球的扫描电镜图，从图中可以看出，分子量为10000、浓度为40wt％的聚乙二醇溶液与8wt％的丝素蛋白溶液共混后得到的丝素微球颗粒粒径较大。
实施例5
丝素微球粒径的检测
分别取实施例4中的悬浮丝素微球溶液，移入到一次性比色皿中；
用激光粒度仪测试各组丝素微球样品的粒径，每组测三次，计算平均值。
参见图10所示，它是本实例中丝素微球的粒径分布图，从图中可以看出，分子量为10000、浓度为40wt％的聚乙二醇溶液与8wt％的丝素蛋白溶液共混后得到的丝素微球颗粒粒径较大，且粒径分布较窄。
实施例6
丝素微球的制备
配置分子量为10000、浓度为50wt％的聚乙二醇溶液；
将实施例1中的30wt％丝素蛋白溶液稀释至5wt％、9wt％；
取上述两个溶液等体积混合，室温条件下孵育2h；
孵育结束后，将离心管放置在离心机中离心，条件：室温，10min，12000rpm/min；
加入去离子水洗涤，去除上清液，反复离心，洗涤操作三次；
用去离子水配置丝素微球的悬浮液，放置在4℃冰箱中或经冷冻真空干燥后保存。
参见图11至12所示，它是本实例制备的丝素微球的扫描电镜图，由图可知，丝素微球的粒径受丝素蛋白溶液浓度的影响，9wt％丝素蛋白溶液制备的丝素微球的粒径要比5wt％丝素蛋白溶液制备的丝素微球的粒径大。
实施例7
丝素微球的制备
配置分子量为4000、浓度为60％的聚乙二醇溶液；
在实施例1中的30wt％的丝素蛋白溶液稀释至5wt％；
将上述两溶液放置在60℃烘箱中30min；
取上述两溶液按1/1(聚乙二醇/丝素蛋白)混合，室温条件下孵育1h；
孵育结束后，将离心管放置在离心机中离心，条件：室温，10min，12000rpm/min；
加入去离子水洗涤，去除上清液，反复离心，洗涤操作三次；
用去离子水配置丝素微球的悬浮液，放置在4℃冰箱中或经冷冻真空干燥后保存。
参见图13所示，它是本实例制备的微球的扫描电镜图，由图可知，放置在60℃烘箱里的溶液取出室温混合孵育后能在1h内形成微球。
实施例8
丝素微球的制备
配置分子量为4000、6000浓度为30％的聚乙二醇溶液；
在实施例1中的30wt％的丝素蛋白溶液稀释至5wt％；
将上述两溶液放置在60℃烘箱中30min,
取上述两溶液按2/1(聚乙二醇/丝素蛋白)混合，室温条件下孵育24h；
孵育结束后，将离心管放置在离心机中离心，条件：室温，10min，12000rpm/min；
加入去离子水洗涤，去除上清液，反复离心，洗涤操作三次；
用去离子水配置丝素微球的悬浮液，放置在4℃冰箱中或经冷冻真空干燥后保存。
参见图14至15所示，它是本实例制备的微球的扫描电镜图，由图可知，放置在60℃烘箱里的溶液取出室温孵育后能在24h内形成微球，同时丝素微球分散性好。
实施例9
丝素微球负载姜黄素
分别称取0.5mg，0.9mg的姜黄素；
分别配置1mL的50wt％、分子量10000的聚乙二醇溶液溶解上述姜黄素；
将实施例1中的30wt％丝素蛋白溶液稀释至5wt％、9wt％各1mL；
将5wt％的丝素蛋白溶液按等体积加入到含姜黄素0.5mg/mL的聚乙二醇溶液中，9wt％的丝素蛋白溶液按等体积加入到含姜黄素0.9mg/mL的聚乙二醇溶液中，用吸枪上下来回轻轻推打，使共混液混合均匀；
将姜黄素-聚乙二醇-丝素蛋白共混液放置在室温条件下孵育2h；
孵育结束后，将离心管放置在离心机中离心，条件：室温，10min,12000rpm/min；
加入去离子水洗涤，去除上清液，反复离心，洗涤操作三次；
悬浮姜黄素-丝素微球，经冷冻真空干燥后保存；
分别称取1mg 5wt％、9wt％的丝素蛋白溶液制备的姜黄素-丝素微球，加入1mL甲醇溶液(每组各称三个样品)；
将离心管放在振荡器上振荡10min，然后放置在静音混合器中旋转2h；
取出离心管，离心，条件：室温，10min，12000rpm/min；
取上清液，用酶标仪在425nm处测姜黄素的吸光度值，对照姜黄素的吸光度-浓度标准曲线计算姜黄素在丝素微球中的含量，计算出载药率；
可以得出，5wt％丝素蛋白溶液制备的姜黄素-丝素微球的载药率为0.27％±0.07％，9wt％丝素蛋白制备的姜黄素-丝素微球的载药率为0.51％±0.15％。
参见图16至17，它是本实施例提供的9wt％丝素蛋白溶液制备的姜黄素-丝素微球的激光共聚焦图。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、选择药物助剂聚乙二醇与丝素蛋白溶液共混来制备丝素微球，材料来源广泛，同时可以实现资源的优化利用；
2、聚乙二醇和丝素蛋白都具有良好的生物相容性，制备过程中不添加有机溶剂，所制备的丝素微球生物安全性高，可以直接应用于临床；
3、直接混合孵育快速制备丝素微球，不需要复杂的实验装置，不需要干燥成膜再溶解，简化了操作流程，缩短了制备时间，可以实现产业化生产；
4、在常温条件下就可制备丝素微球，不需要放置在冰箱中冷冻或烘箱中干燥，不仅节能，同时也降低了生产成本；
5、制备的丝素微球的粒径受聚乙二醇相对分子量和浓度以及丝素蛋白浓度、两者温度等条件的调控，为下一步载药创造条件；
6、制备的丝素微球可用来包埋缓释药物，疏水中性药物可以溶解在聚乙二醇溶液中，然后与丝素蛋白溶液混合孵育，通过与丝素蛋白分子间微弱的结合力包埋在丝素微球中，从而提高疏水中性药物的载药率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将质量百分比为1-30％的丝素蛋白溶液与质量百分比为10-60％的聚乙二醇溶液放置在4-60℃温度条件下30min，然后按一定比例将所述丝素蛋白溶液和聚乙二醇溶液混合均匀，孵育一定时间后离心洗涤，配制成丝素微球悬浮液。
2.根据权利要求1所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量范围为2000-20000。
3.根据权利要求2所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量的范围为4000-20000。
4.根据权利要求3所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述聚乙二醇分子量为4000、6000的浓度范围是质量百分比为30-60％；分子量为10000的浓度范围是质量百分比为20-50％；分子量为20000的浓度范围是质量百分比为20-40％。
5.根据权利要求1所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液的稀释范围是质量百分比为5-15％。
6.根据权利要求1所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液和聚乙二醇溶液的放置温度范围为室温至60℃。
7.根据权利要求1所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇溶液的体积比范围是5:1-1:10。
8.根据权利要求7所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇溶液的体积比范围是2:1-1:5。
9.根据权利要求1所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述孵育条件为：室温孵育1-24h。
10.根据权利要求1所述的一种用聚乙二醇制备丝素微球的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液的制备步骤如下：将已脱胶的熟丝浸润在9.3M的LiBr溶液中并置于60℃烘箱中4h，溶解后得到丝素蛋白溶液；将该丝素蛋白溶液倒入透析袋中用去离子水透析3d；透析结束后将丝素蛋白溶液离心去除不溶物杂质，然后倒入透析袋中用分子量20000、15wt％的聚乙二醇溶液透析24h，获得浓缩丝素蛋白溶液。
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