CN104592189B

CN104592189B - 一种异黄酮类化合物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN104592189B
Application number: CN201510047872.8A
Authority: CN
Inventors: 廖循; 贾颜维; 龚舒; 石海利; 邹方东; 丁立生
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: CN104592189A

Abstract

本发明涉及一种新的异黄酮类化合物——去亚甲基次野鸢尾黄素，及其在制备抗癌活性药物中的应用。属于医药技术领域。所述异黄酮类化合物，具有C₁₉H₁₈O₈的分子式，化学名称为：6，7–二羟基–5，3'，4'，5'–四甲氧基异黄酮。本发明还提供了一种该化合物的制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。对该化合物采用MTT法检测进行了抗癌实验研究，结果表明，该化合物对人前列腺癌细胞和人肝癌细胞生长有抑制作用。

Description

一种异黄酮类化合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种去亚甲基次野鸢尾黄素，具体涉及从次野鸢尾黄素的体外代谢产物中提取分离一种新的异黄酮类化合物——去亚甲基次野鸢尾黄素，及其在制备抗癌活性药物中的应用。属于医药技术领域。

背景技术

癌症是危害人类健康最为严重的疾病之一，具有病程长病死率高的特点。据世界卫生组织(WTO)统计，全球每年有600万人死于癌症，每年新发病例约有1000万人。在全球范围内，癌症的总发病率呈现逐年升高的趋势，由于人口老龄化以及可能危险因素的作用，预计全世界癌症死亡将继续增加，因此癌症的预防和治疗是至关重要的。

射干[Belamcanda chinensis(L.)DC.]为鸢尾科植物射干的干燥根茎。春初刚发芽或秋末茎叶枯萎时采挖，除去须根及泥沙，干燥，用于清热解毒，消痰利咽。射干始载于《神农本草经》，性寒味苦，有毒，入肺、肝经，为清热解毒类中药，具有解毒利咽，清热化痰，散热消结的作用。主治热毒痰火郁结，咽喉肿痛，痰涎壅盛，咳嗽气喘。

药理及临床实验表明：射干中异黄酮类化合物具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基、防治心血管疾病等重要的生物活性与药理作用。植物化学研究表明次野鸢尾黄素、野鸢尾苷、鸢尾苷和野鸢尾黄素等异黄酮是射干中的主要成分。其中次野鸢尾黄素为最主要的活性成分，其含量已被药典规定为射干质量控制标准。近年来的研究表明，射干的某些异黄酮类化合物还具有抗癌活性，但其抗癌活性机制还有待进一步研究。

鉴于此，我们对射干的主要活性成分次野鸢尾黄素进行体外抗癌实验，发现其抗癌作用非常微弱。因此，我们进一步研究次野鸢尾黄素的体外代谢，从而发现了其体外代谢物具有更好的抗癌活性。

发明内容

一种异黄酮类化合物，具有C₁₉H₁₈O₈的分子式，化学结构式如式(I)所示：

本发明提供的化合物为未见文献报道的新化合物，命名为去亚甲基次野鸢尾黄素，化学名称为：6，7–二羟基–5，3'，4'，5'–四甲氧基异黄酮。

本发明还提供了所述异黄酮类化合物(I)的制备方法：

(1)取射干中分离提纯的单体化合物次野鸢尾黄素，用80～1000倍质量的甲醇、乙醇或DMSO溶解，制得次野鸢尾黄素溶液；

(2)取次野鸢尾黄素8～10倍质量的大鼠肝微粒体与上述次野鸢尾黄素溶液一起，分散在上述次野鸢尾黄素溶液50～500倍体积的缓冲溶液中，制得次野鸢尾黄素缓冲溶液；然后，加入上述次野鸢尾黄素缓冲溶液0.05～0.1倍体积的0.1M的镁盐溶液，于35～40℃下预孵育3～10min；最后再加入上述次野鸢尾黄素缓冲溶液0.1～0.2倍体积的NADPH钠盐溶液或NADPH再生体系启动反应，震荡摇匀后置摇床中35～40℃孵育，用HPLC检测反应，直至底物次野鸢尾黄素被代谢完全后终止反应；

(3)上述代谢液经离心后，用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，有机相减压浓缩后用甲醇溶解，以甲醇-0.1％醋酸水或乙腈-0.1％甲酸水为流动相，紫外检测器，检测波长为254nm或282nm，在制备液相中分离纯化其最主要的代谢产物，即去亚甲基次野鸢尾黄素。

上述步骤(2)中的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液(pH 6～8)、磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 6～8)、硼酸盐缓冲溶液(pH 6～8)或氨基酸缓冲溶液(pH 6～8))。所述NADPH钠盐溶液或NADPH再生体系由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。

本发明的去亚甲基次野鸢尾黄素可以制备成用于治疗癌症的药物制剂，该制剂含有治疗有效量的该化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。用该化合物作为药效成分来制备用于治疗癌症的药物制剂，还可单独使用。所述药学上可接受的载体指药学领域常规的药物载体，例如药用辅剂、稀释剂、赋形剂等。

本发明所述药物制剂可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、糖浆、悬浮剂等，通过口服、静脉注射、鼻吸入等方式通过舌下、皮下或经由呼吸道施用。

本发明药物制剂的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使用本发明所述的活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需要的剂型。

本发明制得的去亚甲基次野鸢尾黄素采用MTT法检测进行了抗癌实验研究，结果表明，去亚甲基次野鸢尾黄素对人前列腺癌细胞和人肝癌细胞生长有抑制作用，具体数据为去亚甲基次野鸢尾黄素对人肝癌细胞Hep G2和前列腺癌肿瘤细胞22RV1的IC₅₀分别为：52μM和37μM。

具体实施方式

实施例1

取射干中分离提纯的单体化合物次野鸢尾黄素8mg，用5mL甲醇溶解，制得次野鸢尾黄素溶液。

取次野鸢尾黄素8倍质量的大鼠肝微粒体与上述次野鸢尾黄素溶液一起，分散在300mL Tris-HCl缓冲液(pH＝6)中，制得次野鸢尾黄素缓冲溶液；然后，加入0.05倍次野鸢尾黄素缓冲溶液体积的0.1M的MgCl₂溶液，于35℃下预孵育3min；最后加入0.1倍次野鸢尾黄素缓冲溶液体积的NADPH钠盐溶液(由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成)启动反应，震荡摇匀后置摇床中35℃孵育，用HPLC检测反应，直至底物次野鸢尾黄素被完全代谢后终止反应。

上述代谢液经离心后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，有机相减压浓缩后用甲醇溶解，以甲醇-0.1％醋酸水为流动相，紫外检测器，检测波长为282nm，在制备液相中分离纯化其最主要的代谢产物。

将上述代谢产物通过HR-ESI-MS、UV、¹H-NMR、¹³C-NMR、HMQC、HMBC等现代波谱技术鉴定得到其化学结构，其理化常数和谱学特征为：C₁₉H₁₈O₈，深紫色粉末状固体，易溶于甲醇和DMSO，难溶于水；254nm紫外下显暗黄色斑点，碘熏出现棕黄色斑点；UVλ_max(MeOH)nm：265和221nm，HR-ESI-MS：m/z＝375.1079[M+H]⁺，计算值375.1074。

¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表1：

表1新化合物的¹H-NMR(600MHz，DMSO)和¹³C-NMR(600MHz,DMSO)数据(TMS，ppm)

具有C₁₉H₁₈O₈的分子式，化学结构式如式(I)所示：

命名为去亚甲基次野鸢尾黄素，化学名称为：6，7–二羟基–5，3'，4'，5'–四甲氧基异黄酮。

实施例2

与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于：

取射干中分离提纯的单体化合物次野鸢尾黄素10mg，用1mLDMSO溶解，制得次野鸢尾黄素溶液。

取次野鸢尾黄素9倍质量的大鼠肝微粒体与上述次野鸢尾黄素溶液一起，分散在50mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，制得次野鸢尾黄素缓冲溶液；然后，加入0.1倍次野鸢尾黄素缓冲溶液体积的0.1M的MgCO₃溶液，于37℃下预孵育5min；最后加入0.1倍次野鸢尾黄素缓冲溶液体积的NADPH再生体系(由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成)启动反应，震荡摇匀后置摇床中37℃孵育，用HPLC检测反应，直至底物次野鸢尾黄素被完全代谢后终止反应。

上述代谢液经离心后，用等体积的乙酸乙酯萃取上述代谢液4次，有机相减压浓缩，用甲醇溶解后，以乙腈-0.1％甲酸水为流动相，紫外检测器，检测波长为254nm，在制备液相中分离纯化其最主要的代谢产物，即去亚甲基次野鸢尾黄素。

实施例3

与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于：

取射干中分离提纯的单体化合物次野鸢尾黄素12mg，用11mL乙醇溶解，制得次野鸢尾黄素溶液。

取次野鸢尾黄素10倍质量的大鼠肝微粒体与上述次野鸢尾黄素溶液一起，分散在500mL硼酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，制得次野鸢尾黄素缓冲溶液；然后，加入0.1倍次野鸢尾黄素缓冲溶液体积的0.1M的MgSO₄溶液，于40℃下预孵育10min；最后加入0.2倍次野鸢尾黄素缓冲溶液体积的NADPH再生体系(由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成)启动反应，震荡摇匀后置摇床中40℃孵育，用HPLC检测反应，直至底物次野鸢尾黄素被完全代谢后终止反应。

上述代谢液经离心后，用等体积的乙酸乙酯萃取5次，取有机层减压浓缩，用甲醇溶解后，以甲醇-0.1％醋酸水为流动相，紫外检测器，检测波长为282nm，在制备液相中分离纯化其最主要的代谢产物，即去亚甲基次野鸢尾黄素。

实施例4

去亚甲基次野鸢尾黄素在人肿瘤细胞中的抗癌活性应用研究。

(1)人肿瘤细胞株

人肝癌细胞系HepG2，前列腺癌肿瘤细胞系22RV1，购自ATCC，保存在四川大学生命科学学院细胞室。用DMEM-H培养液(含10％的胎牛血清，100KU·L^-1青霉素，100mg·L^-1链霉素)，在37℃，5％CO₂，相对湿度100％条件下培养。

(2)试剂及主要仪器

PBS溶液(pH＝7.4)；DMEM-H培养基；0.25％胰酶消化液；胎牛血清；青霉素；链霉素；Cell Counting Kit-8(CCK-8)；超净台；全波长酶标仪(Thermo)；5％CO₂恒温细胞培养箱。

(3)癌细胞株的抑制实验

取对数生长的肿瘤细胞，以0.25％胰蛋白酶消化后，将细胞悬液接种于96孔板(100μL/孔)，放入37℃、5％CO₂培养箱，待细胞贴壁并长至30％～40％，分别加入药物，使药物的终浓度分别为20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，对照组加DMSO，使终浓度为0.1％；调零组(只加培养基和CCK-8)，继续培养。

(4)CCK-8法测定

培养72h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续培养4h。用酶标仪在450nm波长处测其OD值，根据下式计算细胞抑制率：

细胞抑制率(％)＝(对照组OD值－实验组OD值)/对照组OD值×100％。

结果如表2所示。

表2去亚甲基次野鸢尾黄素的细胞抑制率

(5)结果(加药后72h)

测定去亚甲基次野鸢尾黄素对人肝癌细胞Hep G2和前列腺癌肿瘤细胞22RV1的IC₅₀分别为：52μM和37μM。结果表明去亚甲基次野鸢尾黄素对人肝癌细胞和前列腺癌肿瘤细胞生长均有一定的抑制作用，可用于制备新型的抗癌药物。

实施例5

取20mg去亚甲基次野鸢尾黄素，加入淀粉178mg，硬脂酸镁2mg，混匀，用85％乙醇制粒，干燥，整粒，压制成片，每片重200mg，活性成分含量为20mg。

实施例6

取10mg去亚甲基次野鸢尾黄素，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg，按制备胶囊剂的常规方法，混匀，装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

实施例7

取5mg去亚甲基次野鸢尾黄素和20mg氯化钠溶解于注射用水中，过滤后在无菌条件下装入安瓿瓶中。

Claims

1.一种异黄酮类化合物，化学结构式如式(I)所示

2.如权利要求1所述的化合物(I)的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)上述代谢液经离心后，用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，有机相减压浓缩后用甲醇溶解，以甲醇-0.1％醋酸水或乙腈-0.1％甲酸水为流动相，紫外检测器，检测波长为254nm或282nm，在制备液相中分离纯化其最主要的代谢产物，即制得化合物(I)去亚甲基次野鸢尾黄素。

3.如权利要求1所述的化合物(I)在制备抗癌药物中的应用。