CN104540959A - γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够有效制备γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的方法。具体地，提供一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法，该方法包括:获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的工序，混合溶液中，相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸，含有20质量％以上的缬氨酰甘氨酸或其盐；将获得的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量为0.1质量％以上低于20质量％，获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液的工序；以及将所述γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶,获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序。

Description

γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法
技术领域
本发明涉及γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法。具体地，本发明涉及如下方法:由缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体的酶反应，获得与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液，通过调节其混合溶液中存在的残留缬氨酰甘氨酸或其盐的量，从而有效制备γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体。
背景技术
γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸(γ-Glu-Val-Gly)作为赋予食品醇厚味(コク味)的肽为人所知(专利文献1)。γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸通过诸如化学合成法或酶法制备。其中，通过酶法制备γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸时，例如如下进行:在γ-谷氨酰转移酶(γ-谷氨酰转肽酶，以下也称为“GGT”)的存在下使缬氨酰甘氨酸或其盐作用于谷氨酰胺之类的谷氨酰基供体，获得含有γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的溶液后，由该溶液获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸(非专利文献1)。
现有技術文献
专利文献
专利文献1:WO2007/055393号公报
非专利文献
非专利文献1:Suzuki，H.等(2008)用细菌γ-谷氨酰转肽酶提高氨基酸和肽的风味(Improvement of the flavor of amino acids and peptides using bacterialγ-glutamyltranspeptidase).风味化学与生物的近期关注(In Recent High lights inFlavor Chemistry&Biology).Hofmann，T.等编著.p.227-232，德国食品化工研究院
发明内容
本发明要解决的课题
本发明人尝试着从含有缬氨酰甘氨酸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸，结果发现多存在以下情况:γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液中残留较多缬氨酰甘氨酸或其盐时，溶液凝胶化，无法结晶。
因此，本发明的目的是提供能够有效制备γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的方法。
本发明的目的是提供能够制备具有更大晶体尺寸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的方法。
本发明的目的是提供能够有效制备γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的方法。
解决课题的方法
本发明人发现，在从含有缬氨酰甘氨酸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体时，例如，在以缬氨酰甘氨酸为起始物质通过酶法获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸时，通过调节缬氨酰甘氨酸的残留量后结晶γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体，就不发生凝胶化的问题，能够有效地获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体，从而完成了本发明。此外，本发明人发现，通过该方法结晶的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体与通过以往的方法得到的晶体相比，具有较大的晶体尺寸。
即，本发明是具有以下特征的发明。
[1]一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法，该方法包括:
在γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物的存在下，使缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体反应，获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的工序，此处,所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量比为20质量％以上；
将获得的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为相对于该溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量为0.1质量％以上低于20质量％，获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液的工序；以及
将所述γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶,获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序。
[2]如上述[1]所述的方法，其中,所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量在其相对于该溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量在1质量％～18质量％的范围内进行调节。
[3]如上述[1]或[2]所述的方法，其中,所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量如下进行调节:使所述混合溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸吸附于吸附树脂，而所述混合溶液中的缬氨酰甘氨酸或其盐流过所述吸附树脂后，将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸从吸附树脂上洗脱。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中,γ-谷氨酰基供体是谷氨酰胺。
[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的方法，其中,γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物是属于肠杆菌科的细菌。
[6]如上述[5]所述的方法，其中,所述细菌是大肠埃希氏菌。
[7]如权利要求[1]～[6]中任一项所述的方法，其中,缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体的反应在选自水或缓冲液的溶剂中进行。
[8]一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的晶体，所述晶体中含有2.0质量％以下的选自缬氨酰缬氨酸、缬氨酰缬氨酸盐、缬氨酰缬氨酰甘氨酸和缬氨酰缬氨酰甘氨酸盐中的一种以上，且长轴方向长度在35μm以上的晶体的短轴方向直径的平均值在2.1μm以上。
[9]如上述[8]所述的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的晶体，其中,用光学显微镜拍摄的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体图像在415μm×332μm的区域内包含了全体晶体图像的结晶中，长轴方向长度在35μm以上的晶体的短轴方向直径的平均值在2.1μm以上。
[10]如上述[8]或[9]所述的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的晶体，其中,γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体中缬氨酰甘氨酸的浓度在3质量％以下。
通过本发明可以有效地制备γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体。
通过本发明还可以制备具有较大晶体尺寸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体。
此外，通过本发明，由于获得较大的晶体，因此实现了更适合于工业处理的优异的处理工艺。
附图说明
图1是显示缬氨酰甘氨酸浓度为10质量％时(实施例6)获得的本发明的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的光学显微镜照片。
图2是显示缬氨酰甘氨酸浓度为15质量％时(实施例7)获得的本发明的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的光学显微镜照片。
图3是显示缬氨酰甘氨酸浓度为20质量％时(比较例2)获得的本发明的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的光学显微镜照片。
图4是显示缬氨酰甘氨酸浓度为25质量％时(比较例3)获得的本发明的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的光学显微镜照片。
图5是显示比较例5中获得的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的光学显微镜照片。
具体实施方式
[1]γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法
本发明涉及一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法，该方法包括:(1)在γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物的存在下，使缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体反应，获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的工序；(2)将获得的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为相对于该溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量为0.1质量％以上低于20质量％，获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液的工序；以及(3)将所述γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶,获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序。
(1)获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸混合溶液的工序
作为获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸混合溶液的工序，例如有如下方法：(a)在γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物的存在下，使缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体反应，获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的方法；(b)如日本专利特开2012-85637号公报(该文献作为参考引入此处)所记载的那样，在谷胱甘肽合成酶或含有该酶的微生物的存在下，使γ-谷氨酰缬氨酸与甘氨酸反应，生成γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸，然后通过该酶或含有该酶的微生物具有的γ谷氨酰转移酶分解γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸而在反应液中生成缬氨酰甘氨酸，由此获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液；以及(c)对合成γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸而制备的溶液进行工业化处理工序中，在酸性条件下热处理时生成缬氨酰甘氨酸。虽然这些中的每一种方法都可以适用于本发明晶体的制备方法，但是其中优选(a)在γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物的存在下，使缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体反应，获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的方法。以下，对(a)详细说明。
通常，理想的是通过γ-谷氨酰转移酶进行的缬氨酰甘氨酸与γ-谷氨酰基供体的反应获得转移反应高效进行的缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液。已知通常通过γ-谷氨酰转移酶进行的转移反应的反应效率根据受体或受体与γ-谷氨酰基供体的比率而变化，残留未反应的受体[Amino acids 200732:333-340.γ-Glutamylcompounds and their enzymatic production using bacterialγ-glutamyltranspeptidase.Suzuki H.等(该文献作为参考引入此处)]。使用缬氨酰甘氨酸作为受体的情况下，反应液中也残留未反应的缬氨酰甘氨酸。残留的未反应的缬氨酰甘氨酸的量取决于产率。大概的反应产率与残留的缬氨酰甘氨酸量的关系如下：产率30％左右时缬氨酰甘氨酸相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量比为134质量％左右，产率70％左右时该质量比为25质量％左右。
具体地，所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量比例如为20质量％以上，优选25～850质量％，优选30～134质量％，更优选40～86质量％。此处,质量％是换算成游离体表示的数值。“换算成游离体”是指混合液中缬氨酰甘氨酸以及γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸成盐的情况下，分别换算成缬氨酰甘氨酸、γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的游离体(非盐形态)的质量。
此处,所述混合溶液中存在的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸或其盐的量换算成游离体表示的话，例如为0.05～50质量％，优选0.1～50质量％，更优选0.5～50质量％。
γ-谷氨酰转移酶(GGT)由大亚单位和小亚单位构成。GGT可以是野生型，也可以是变异型。此处,氨基酸只要没有特别限定则指L型。
野生型GGT可以例举由大肠埃希氏菌的ggt基因编码的GGT及其同系物，例如大肠埃希氏菌的GGT、特别是与小亚单位结构类似的其他微生物的GGT。
大肠埃希氏菌K-12株ggt基因的碱基序列记载于日本专利特开平02-231085号(该文献作为参考引入此处)。此外，大肠埃希氏菌K-12W3110株ggt基因的碱基序列在数据库中注册为GenBank accession AP009048的4053592..4055334。该ggt基因的碱基序列如序列号1所示。此外，由该碱基序列编码的氨基酸序列如序列号2所示。序列号2中，1～25位是前导肽，26～390位是大亚单位，391～580位是小亚单位。
与大肠埃希氏菌的GGT类似的GGT同系物优选含有具有如下氨基酸序列的小亚单位，所述氨基酸序列与相当于序列号2所示的氨基酸序列中的小亚单位的部位(391-580)具有90％以上的同一性。此外，GGT同系物优选含有具有如下氨基酸序列的大亚单位，所述氨基酸序列与相当于序列号2中的大亚单位的部位(26-390位)具有90％以上的同一性。
γ-谷氨酰转移酶(GGT)或含有该酶的微生物例如有大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌等革兰氏阴性菌、牙胞杆菌属细菌等革兰氏阳性菌、棒状杆菌属细菌等。
此外，GGT或含有该酶的微生物也可以使用GGT或含有该酶的微生物处理物，即，例如，菌体破碎物、菌体提取物、它们的部分纯化物、纯化酶等以及用丙烯酰胺、卡拉胶等将其固定化得到的菌体或将GGT固定在树脂等固相上得到的固定化酶等。
GGT或含有该酶的微生物可以特别例举属于肠杆菌科的细菌的GGT。属于肠杆菌科的细菌没有特别限定，包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、光杆状菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森氏菌属等的细菌。特别优选根据NCBI(美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information))数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)采用的分类法分类为肠杆菌科的细菌。属于肠杆菌科的细菌具体地可以例举大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)以及阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)等。
GGT或含有该酶的微生物可通过如下方法制备：将以能够表达的形态导入了ggt基因的微生物在该基因能够表达的条件下培养，使菌体增殖。培养使用的培养基只要是目标微生物能够增殖的就无特别限定，可以使用含有碳源、氮源、硫源、无机离子以及根据需要的其他有机成分的通常的培养基。
碳源可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、乙醇、糖蜜或淀粉的水解物等的糖类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸。氮源可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮，氨气、氨水等。硫源可以例举硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、连二亚硫酸盐、硫代硫酸盐等的无机硫化合物。作为有机微量营养源，理想的是适量含有维生素B1等必须物质或酵母提取物等。此外，还可以根据需要少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养条件根据使用的微生物适当设定即可，例如，培养温度为20℃～45℃、优选在24℃～45℃下培养。培养优选有氧培养，氧浓度优选调节为相对于饱和浓度为5～50体积％，理想的是10体积％左右。此外，培养中的pH优选5.0～9.0。pH调节可以使用无机或有机的酸性或碱性物质，例如，碳酸钙、氨气、氨水等。培养时间优选10小时～120小时左右。
GGT可以以包含在菌体中的状态使用，也可以使用从菌体提取的粗酶馏分或纯化酶。GGT可以通过与通常的周质酶提取同样的方法，例如渗透压冲击法、冷冻解冻法等提取。
GGT的纯化可以适当组合硫酸铵分级法、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、等电点沉淀等酶纯化中常用的方法来进行。GGT在菌体外分泌产生的情况下，可以使用从培养基收集的GGT。
本发明中γ-谷氨酰转移酶(GGT)或含有该酶的微生物可以使用如下的GGT或微生物处理物：菌体破碎物、菌体提取物、它们的部分纯化物、纯化酶等以及用丙烯酰胺、卡拉胶等将它们固定化得到的菌体或用树脂等将变异型GGT固定化得到的固定化酶等。
缬氨酰甘氨酸(Val-Gly)或其盐可以通过各种公知的方法制备。例如，也可以甲酰基‐L‐缬氨酸与甘氨酸乙酯为原料，通过化学合成法制备(Journal of the AmericanChemical Society(1958),80,pp.1154-1158(该文献作为参考引入此处))。在该制备中，也可以使用以缬氨酸的N-羧酸酐(缬氨酸-NCA)与甘氨酸为原料的化学合成法(CanadianJournal of Chemistry(1973),51(8),pp.1284-87(该文献作为参考引入此处))。此外，还可以使用作为其他的肽合成法通常公知的方法(《肽合成的基础与实验(ペプチド合成の基礎と実験)》丸善株式会社(1985)(该文献作为参考引入此处))或酶的肽合成方法(WO2004/011653等(该文献作为参考引入此处))。本发明中使用的缬氨酰甘氨酸如果不影响下一个工序的反应，可以直接使用通过上述各种方法获得的含有缬氨酰甘氨酸的反应溶液。此外，也可以使用含有纯化的缬氨酰甘氨酸的溶液或分离的晶体。
作为缬氨酰甘氨酸的盐，只要是化学上允许的盐则可以是任何盐。“化学上允许的盐”具体可以例举例如羧基等酸性基与铵的盐、与钠、钾等碱金属的盐、与钙、镁等碱土金属的盐、铝盐、锌盐、与三乙胺、乙醇胺、吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、二环己胺等有机胺的盐、与精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的盐。此外，还可列举碱性基与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸等无机酸的盐、与乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、鞣酸、丁酸、海苯酸、扑酸、庚酸、癸酸、茶氯酸、水杨酸、乳酸、草酸、扁桃酸、苹果酸等有机羧酸的盐、与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等有机磺酸的盐。
γ-谷氨酰基供体可以从γ-谷氨酰化合物中选择。γ-谷氨酰基供体例如可以例举谷氨酰胺、谷氨酸-γ-甲酯等的谷氨酸-γ-烷基酯等或它们的盐。其中优选谷氨酰胺或其盐。这里的盐可以使用上述定义的“化学上允许的盐”。
缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体的反应既可以是批量式的，也可以是柱式的。批量式的情况下，只要在反应容器内的溶剂中混合缬氨酰甘氨酸或其盐、γ-谷氨酰基供体以及γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物即可。反应在静置下或搅拌下均可。批量式的情况下，例如，通过在填充有固定化菌体或固定化酶的柱内使含有缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体的溶液流过来进行。
在γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物存在下的缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体的反应中使用的溶剂只要是能够发生酶反应的溶剂则无特别限定，合适的有水或缓冲液。缓冲液可以使用磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液)、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液等。盐可以使用上述定义的“化学上允许的盐”。使用溶剂的pH可以选择缓冲液或者适当使用酸、碱pH调节剂调节，pH范围例如是6.0～10.0，优选6.5～9.0。
反应时间或溶液的流过速度可以根据基质的浓度、γ-谷氨酰转移酶相对于基质的量等适当设定。具体地，例如酶量可以测定一定条件下的酶活性，基于该活性值确定添加量。例如，将溶液组成设定为0.1M谷氨酰胺、0.1M缬氨酰甘氨酸、0.1M磷酸钾(pH7.6)，反应温度设定为37℃，反应时间设定为1～10分，使用合适的酶量就可以测定酶活性。例如，将本条件下1分钟生成1μmol的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的酶量设为1U时，可以基质浓度γ-谷氨酰基供体谷氨酰胺为1～2000mM、缬氨酰甘氨酸为1～2000mM，酶浓度为0.1U/ml～100U/ml进行反应。反应温度通常为15～50℃，优选15～45℃，更优选20～40℃。
反应前溶液中的缬氨酰甘氨酸或其盐和γ-谷氨酰基供体的摩尔比根据反应使用的γ-谷氨酰基供体的种类有所不同，通常优选缬氨酰甘氨酸:γ-谷氨酰基供体＝1:0.1～1:10。溶液中的Val-Gly和γ-谷氨酰基供体的浓度通常分别为1～2000mM，优选100～2000mM，更优选100～1000mM。
相对于作为基质使用的缬氨酰甘氨酸或其盐，γ-谷氨酰转移酶的量如下：相对于基质1mmol，通常为0.01～1000U，优选0.1～500U，更优选0.1～100U。
使用γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物的情况下，如果含有肽酶，特别是含有PepD，基质缬氨酰甘氨酸或其盐和/或产物γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸会被分解。因此，微生物优选使用PepD基因破坏株。或者，可以通过在反应体系中含有能够螯合对肽酶的酶活性必须的金属离子例如Co2+、Mn2+、Fe2+等离子的金属螯合剂，抑制肽酶活性。
如上所述，反应开始后，反应液中生成γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸，可以得到含有缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液。
此外，含有缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液是使用含有γ-谷氨酰转移酶的微生物菌体而得到的酶反应液的情况下，在下一个工序之前，优选适当地实施采用高压釜的加热、酸和碱处理、过滤等的除菌处理从而获得除菌液，或者进行适当的pH调节，这在处理过程的设计上也是优选的。
(2)将获得的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为0.1质量％以上低于20质量％的工序
缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量换算成游离体，相对于该混合溶液中含有的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量，例如，调节为0.1质量％以上低于20质量％、优选0.1质量％～18质量％、更优选0.1质量％～15质量％、进一步优选1质量％～10质量％。通过这样的调节，可以抑制γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液的凝胶化，而且在接下来的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的结晶工序中，可以提高γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的产率。此外，将缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节在这样的范围内结晶出来的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体具有希望的晶体尺寸，故而优选。
缬氨酰甘氨酸或其盐的量的调节例如可以例举以下方法：使混合溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸吸附在吸附树脂上，使混合溶液中的缬氨酰甘氨酸或其盐流过所述吸附树脂的方法；使用γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸能够通过而γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸不能通过的膜的方法等。具体地，可以通过如下所述的任意一种方法区分缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸而进行调节。
1.着眼于疏水性和亲水性相互作用之差的方法
2.着眼于等电点之差的方法
3.着眼于分子量之差的方法
第1点的着眼于疏水性和亲水性相互作用之差的方法利用的是γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的疏水性高于缬氨酰甘氨酸的疏水性。具体地，例如，在含有缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液中加入酸(盐酸或硫酸等)或碱(氢氧化钠等)，调节为pH＝3.0。然后，在室温(25℃)下，以γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸不会通过的程度的流量使该混合溶液流过合成吸附树脂，γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸吸附在树脂上，同时缬氨酰甘氨酸或其盐流过。液体流过后，使1～2倍量柱容量的水流过，将树脂上残留的非吸附的缬氨酰甘氨酸或其盐洗去，接着用例如10～30体积％的甲醇溶液洗脱吸附的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸。
此处,合成吸附树脂可以使用SP-207(三菱化学制)等。
上述第2点的着眼于等电点之差的方法是通过使γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和缬氨酰甘氨酸吸附在强阳离子交换树脂等的吸附树脂上，使用碱洗脱液慢慢洗脱，将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和缬氨酰甘氨酸分离的方法。具体地，例如，在含有缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液中加入酸(盐酸或硫酸等)或碱(氢氧化钠等)，调节为pH＝2.0。然后，室温(25℃)下，以γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸不会通过的程度的流量使该混合溶液流过离子交换树脂，γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸吸附在树脂上，同时缬氨酰甘氨酸或其盐流过树脂。液体流过后，使约1倍量柱容量的水流过，洗去残留在离子交换树脂上的非吸附成分。然后用0.1～0.25N的氢氧化钠水溶液洗脱吸附的缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸。由此，γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸首先洗脱，接着缬氨酰甘氨酸或其盐洗脱。此外，通过将洗脱时的温度上升到50～60℃左右，可以提高两者的分离性能，故而优选。
此处,吸附树脂优选离子交换树脂，更优选强阳离子交换树脂，可以使用UBK-550(三菱化学制)、UBK-555(三菱化学制)等。
第3点的着眼于分子量之差的方法是：使用缬氨酰甘氨酸能够通过而γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸不能通过(或不易通过)的NF(纳米过滤)膜，将缬氨酰甘氨酸和γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸分离。
(3)将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶，获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序
作为从调节了缬氨酰甘氨酸或其盐的量的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的方法，可以使用通常的晶体化操作、重结晶法。晶体化操作可以例举例如采用冷却法的结晶、采用不良溶剂法的结晶、采用悬浊法的结晶、采用中和法的结晶、采用浓缩法的结晶，将目标物γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶解或悬浊于结晶溶剂中进行结晶化的工序就可以实施。此外，也可以组合冷却结晶和不良溶剂结晶。
结晶溶剂使用已知通常用作结晶溶剂的即可，可为一种，也可以是多种的混合溶剂。
作为多种的混合溶剂，可以使用容易溶解目标化合物(γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸)的溶剂(良溶剂)与能够与该良溶剂互溶但不易溶解目标化合物的溶剂(不良溶剂)以适当量混合而成的混合溶剂。此外，可以使用多种良溶剂或多种不良溶剂。此时，优选相互能够均匀混合的溶剂。
此外，优选通过向由前阶段获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液的工序得到的溶液(水溶液)中添加不良溶剂，得到结晶液。
此处,不良溶剂可以例举醇类(甲醇、乙醇、辛醇等)、醚类(二乙醚等)、乙酸酯类(乙酸乙酯等)、烃类(甲苯、环己烷、己烷等)或其与水的混合液。其中，优选醇类。
具体地，例如，可以例举以下的结晶方法。
即，首先在调节了缬氨酰甘氨酸或其盐的量的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液中任意加入甲醇或乙醇等，例如，冷却至0～15℃、优选5～10℃，析出晶体。从溶液中分离析出的晶体，用甲醇或乙醇等清洗，得到湿晶体。将该湿晶体在例如30～100℃、优选40～50℃下常压或减压下干燥，得到干燥晶体。
[2]γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体
本发明也涉及由上述方法制备的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体。
通过本发明的方法制备的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体经过使用缬氨酰甘氨酸为原料的酶反应容易含有该酶反应特有的杂质缬氨酰缬氨酸、缬氨酰缬氨酰甘氨酸等副产物，但是其浓度即使在相对提高结晶产率而得到的晶体中也显著降低。本发明中，选自晶体中含有的缬氨酰缬氨酸、缬氨酰缬氨酸盐、缬氨酰缬氨酰甘氨酸和缬氨酰缬氨酰甘氨酸盐之中的1种以上的杂质的总浓度通常在2.0质量％以下，优选在1.2质量％以下的范围。该杂质的总浓度的下限没有特别限定，一般在0.01质量％以上，优选0.02质量％以上，更优选0.1质量％以上。理想的杂质总浓度为0.02～2.0质量％，更优选0.02～1.2质量％的范围。
此外，通过本发明的方法制备的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体虽然容易含有原料缬氨酰甘氨酸作为杂质，但其浓度即使在相对提高结晶产率而得到的晶体中也显著降低。本发明中，晶体中含有的缬氨酰甘氨酸的浓度例如在3.0质量％以下，优选2.2质量％以下，该浓度的下限值没有特别限定，缬氨酰甘氨酸浓度优选0％，一般为0.01质量％以上，更典型的为0.1％质量以上较为合适(检测限～2.2质量％的范围即0～2.2质量％的范围合适)。
此外，由本发明的方法制备的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体通过降低缬氨酰甘氨酸或其盐的量进行结晶，与通过通常的酶反应获得的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体相比，具有晶体尺寸较大，特别是该晶体的短轴方向的直径(即粗细程度)大的特征。
即，通过本发明，提供一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的新晶体，选自该晶体中含有的缬氨酰缬氨酸、缬氨酰缬氨酸盐、缬氨酰缬氨酰甘氨酸和缬氨酰缬氨酰甘氨酸盐之中的1种以上的总含量为0.02～1.2质量％，用光学显微镜拍摄的该晶体图像在415μm×332μm区域内包含了全体晶体图像的晶体，且长轴方向长度在35μm以上的晶体的短轴方向直径平均值通常在2.1μm以上，更典型的是2.3μm以上，上限值没有特别限定，通常在4.0μm以下，更典型的是3.5μm以下，优选2.1～4.0μm，更优选2.3～3.5μm。此外，提供一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的新晶体，所述晶体中的缬氨酰甘氨酸的浓度在2.2质量％以下。
本发明晶体的短轴方向直径的平均值可以如下确定。即，少量取出晶体分离前的浆液，使用例如以下所示的光学显微镜装置等测量浆液中含有的晶体的晶体尺寸。
使用所述光学显微镜和透镜，用所述分析软件将拍摄的晶体图像作为图像文件(例如，TIF文件)保存。对图像的415μm×332μm的区域内包含了全体晶体图像的晶体且聚焦的晶体，使用分析软件的“测量”功能，在“旋转的四边形”模式下包围每个晶体，测量长轴方向长度(最大直径)和短轴方向直径(最小直径)。在得到的数据中，提取长轴方向长度在35μm以上的晶体的短轴方向直径数据，求出短轴方向直径的平均值。
以下，例举实施例进一步详述本发明，但本发明并不局限于此。
实施例
[1]γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法
如下所示，将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备如上所述分为如下工序进行：(1)获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的工序；(2)将获得的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为0.1质量％以上低于20质量％的工序；以及(3)结晶γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液，获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序。
(1)获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的工序
作为本发明的γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物，使用如下得到的通过γ-谷氨酰转移酶(GGT)和GGT表达质粒转化的大肠杆菌(大肠埃希氏菌)。
〔试验例1〕γ-谷氨酰转移酶(GGT)表达质粒的构建
GGT表达质粒通过将大肠埃希氏菌的ggt基因插入如下所示的含有rpoH启动子的表达质粒pSF12_Sm_Aet中构建。
首先，为了使含有鞘氨醇SP FERM BP-8124来源的肽生成酶和phoC启动子的pUC18来源的质粒pSF_Sm_Aet(WO2006/075486A1)中所含有的NdeI识别位点(pUC18来源的限制酶位点)缺失，使用Stratagene公司的“Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit”，以pSF_Sm_Aet为模板，按照制造商的操作步骤(protocol)，使用序列号5、6的序列所示的引物实施PCR。用DpnI消化得到的PCR产物后，以该反应液将大肠埃希氏菌JM109株转化，涂布于含有100mg/L的氨苄西林钠(Amp)的LB琼脂培养基后，在25℃下培养36时间。按照公知的方法从存活的转化体菌落中提取质粒，使用3100遗传分析仪(美国应用生物系统公司制)进行碱基序列确认，将具有目标结构的质粒命名为pSF1_Sm_Aet。FERMBP-8124株命名为AJ110003，于2002年7月22日根据布达佩斯条约保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心)(〒305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，登记号为FERM BP-8124。
接着，为了在pSF1_Sm_Aet的鞘氨醇SP.FERM BP-8124来源的肽生成酶基因的起始蛋氨酸部分导入NdeI识别序列，使用所述的“Quik change Site-Directed Mutagenesis Kit”，以pSF1_Sm_Aet为模板，使用序列号7、8的序列所表示的引物实施PCR。以DpnI消化得到的PCR产物后，以该反应液将大肠埃希氏菌JM109株转化，涂布于含有100mg/L的Amp的LB琼脂培养基后，在25℃下培养24时间。按照公知的方法从存活的转化体菌落中提取质粒，使用3100遗传分析仪(美国应用生物系统公司制)进行碱基序列确认，将具有目标结构的质粒命名为pSF2_Sm_Aet。
接着，按照以下方法将pSF2_Sm_Aet的phoC启动子取代为rpoH启动子。通过PCR从大肠埃希氏菌W3110株的染色体DNA取得rpoH启动子区域。PCR以W3110株的染色体DNA为模板，使用序列号9的序列所表示的引物(rpoH启动子区域的5'末端附加有含XbaI识别序列的碱基序列的引物)作为正义引物(sence primer)，使用序列号10的序列所表示的引物(与rpoH启动子区域互补的碱基序列的5'末端附加有含NdeI识别序列的碱基序列的引物)作为反义引物(antisence primer)，使用KOD-plus-(东洋纺株式会社)作为聚合酶，按照制造商的操作步骤，以94℃下30秒、52℃下1分钟、68℃下30秒的条件进行30循环。
接着，用XbaI/NdeI消化得到的PCR产物后，通过琼脂糖凝胶电泳切出目标约0.4kb的DNA，使用DNA连接试剂盒Ver.2.1(宝生物公司制)连接到通过XbaI/NdeI消化的pSF2_Sm_Aet片断(约4.7kb)。以该反应液将大肠埃希氏菌JM109株转化，涂布于含有100mg/LAmp的LB琼脂培养基后，25℃培养36小时。按照公知的方法从存活的转化体菌落提取质粒，使用3100遗传分析仪(美国应用生物系统公司制)进行碱基序列的确认，将具有目标结构的质粒命名为pSF12_Sm_Aet。
大肠埃希氏菌的ggt基因通过PCR从大肠埃希氏菌W3110株的染色体DNA取得。PCR以W3110株的染色体DNA为模板，使用序列号11的序列所表示的引物(在含有ggt基因的起始密码子的区域的5'末端附加有含NdeI识别序列的碱基序列的引物)作为正义引物，使用序列号12的序列所表示的引物(在与含有ggt基因的终止密码子的序列互补的碱基序列的5'末端附加有含PstI序列的碱基序列的引物)作为反义引物，使用KOD-plus-，按照制造商的操作步骤，以94℃下30秒、52℃下1分钟、68℃下120秒的条件进行30次循环。接着，用NdeI/PstI消化得到的PCR产物后，通过琼脂糖凝胶电泳切出目标约1.8kb的DNA，使用DNA连接试剂盒Ver.2.1(宝生物公司制)连接到通过NdeI/PstI消化的pSF12_Sm_Aet片断(约3.0kb)。该反应液将大肠埃希氏菌JM109株转化，涂布到含有100mg/L的Amp的LB琼脂培养基后，25℃培养36小时。按照公知的方法从存活的转化体菌落提取质粒，使用3100遗传分析仪(美国应用生物系统公司制)进行碱基序列的确认。得到的质粒是具有目标结构的GGT表达质粒，命名为pSF12_ggt。
〔试验例2〕大肠埃希氏菌JM109株来源的pepD基因破坏株(宿主株)的制备
以大肠埃希氏菌JM109株为亲株进行不产生PepD株的构建。PepD由pepD基因(GenBankAccession；7438954，序列号3)编码。
基因的破坏通过组合了由Datsenko和Wanner最初开发的称为“Red-drivenintegration”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645)和λ噬菌体来源的切出系统(J.Bacteriol.2002Sep；184(18):5200-3.Interactionsbetween integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoproteincomplex.Cho EH,Gumport RI,Gardner JF.(该文献作为参考引入此处))的方法(参照WO2005/010175号，该文献作为参考引入此处)进行。通过“Red-driven integration”方法，可以使用将目标基因的一部分设计在合成寡核苷酸的5'侧、抗生素耐性基因的一部分设计在3'侧的合成寡核苷酸作为引物得到的PCR产物以一个阶段构建基因破坏株。此外，通过进一步组合λ噬菌体来源的切出系统，可以除去整合入基因破坏株的抗生素耐性基因。
使用质粒pMW118-attL-Cm-attR作为PCR的模板。pMW118-attL-Cm-attR(WO2006/078039)是在pMW118(日本基因公司制)上插入λ噬菌体的附加位点attL以及attR基因与抗生素耐性基因cat基因的质粒，按照attL-cat-attR的顺序插入。将引物的3'末端具有与该attL与attR的两端对应的序列、引物的5'末端具有与目标基因pepD基因的一部分相对应的序列的合成寡核苷酸用作为引物，进行PCR。
pepD基因破坏用DNA片断按如下方法制备：使用序列号13和序列号14的序列所表示的引物，使用KOD-plus-，按照制造商的操作步骤，以94℃下30秒、52℃下1分钟、68℃下120秒的条件进行30次PCR循环。
通过琼脂糖凝胶电泳纯化如上所述得到的各基因破坏用DNA片断，通过电穿孔导入含有具有温敏性复制能力的质粒pKD46的大肠埃希氏菌JM109株。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645)含有λ噬菌体共2154个碱基的DNA片段(GenBank/EMBL Accession；JO2459，第31088～33241位)，所述λ噬菌体含有编码由阿拉伯糖诱导性ParaB启动子控制的λRed相同重组系统的Red重组酶的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于将基因破坏用DNA片断整合入JM109株的染色体是必须的。电穿孔用的感受态细胞如下制备。即，将在含有100mg/L的Amp的LB培养基中于30℃下培养了20小时的含有质粒pKD46的大肠埃希氏菌JM109株用含有Amp(100mg/L)的2ml SOB培养基(分子克隆:实验室手册第2版，Sambrook,J.等，冷泉港实验室出版社(1989年)(该文献作为参考引入此处))稀释50倍。使得到的稀释物在30℃下生长到OD600约0.3后，添加10％(v/v)的L-阿拉伯糖70μl，37℃下培养1小时。将得到的培养液浓缩65倍，通过10％(v/v)甘油清洗3次，可用于电穿孔。电穿孔使用30μL的感受态细胞和约100ng的PCR产物进行。
电穿孔后，在细胞悬浊液中加入0.27mL的SOC培养基(分子克隆:实验室手册第2版，Sambrook,J.等，冷泉港实验室出版社(1989年)(该文献作为参考引入此处))，37℃下培养3小时后，37℃下在含有氯霉素(Cm)(50mg/L)的LB-琼脂培养基上培养，选择Cm耐性重组体。接着，为了除去pKD46质粒，在含有Cm(50mg/L)的LB-琼脂培养基上于42℃培养，试验得到菌落的Amp耐性，取得pKD46脱落的Amp感受性株。通过PCR确定了能够通过Cm耐性基因识别的变异体的pepD基因的破坏。将得到的pepD基因破坏株命名为JM109ΔpepD:att-cat株。
接着，为了除去导入pepD基因内的att-cat基因，使用pMW-intxis-ts作为辅助质粒。pMW-intxis-ts是搭载编码λ噬菌体的整合酶(Int)的基因和编码工作激酶(Xis)的基因且具有温敏性复制能力的质粒。通过导入pMW-intxis-ts，识别染色体上的attL或attR引起重组，切除attL和attR之间的基因，在染色体上仅残留attB序列。按照常法制备上述得到的JM109ΔpepD:att-cat株的感受态细胞，用pMW-intxis-ts转化，30℃下在含有100mg/L的Amp的LB-琼脂培养基上培养，选择Amp耐性株。接着，为了除去pMW-intxis-ts质粒，用LB琼脂培养基在42℃下培养，试验得到菌落的Amp耐性和Cm耐性，取得att-cat和pMW-intxis-ts脱落且pepD基因破坏的株Cm、Amp感受性株。该株是此后用GGT表达质粒转化时使用的大肠杆菌(大肠埃希氏菌)的宿主株，命名为JM109ΔpepD株。
〔试验例3〕大肠埃希氏菌的ggt基因增强株的培养菌体(B101株)的制备
将试验例2得到的JJM109ΔpepD株通过试验例1得到的GGT表达质粒pSF12_ggt转化，命名为B101株。使用含有100mg/L的Amp的LB培养基[1.0％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、1.0％(w/v)NaCl]，在25℃下培养B101株16小时。将得到的培养液以接种量为1.0％(v/v)植入50ml含有100mg/L的Amp的TB培养基[极品肉汤(Terrific Broth)(分子克隆:实验室手册第3版，Sambrook,J.等，冷泉港实验室出版社(2001年)](该文献作为参考引入此处)，使用500ml容积的坂口烧瓶，在25℃下培养24小时。
离心分离得到的培养液(8,000g、10分钟、4℃)，将湿菌体作为沉淀回收。每100ml培养液得到3.5g湿菌体。用0.85％(w/v)NaCl水溶液清洗湿菌体，制备35mg/ml的悬浊液(悬浊液I)。得到的悬浊液I用作通过GGT表达质粒转化的大肠杆菌(大肠埃希氏菌)的菌体(B101株)。
〔试验例4〕菌体(B101株)的GGT酶活性评价
以悬浊液I作为酶源，测定GGT酶活性。酶活性測定方法采用以γ-谷氨酰基对硝基苯胺为基质的水解活性测定法[J.Bacteriol.1986Dec；168(3):1325-1331.γ-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12:Purification andProperties.Suzuki H.等](该文献作为参考引入此处)。反应液成分中添加了2.5mMγ-谷氨酰基-对硝基苯胺、50mM Tris盐酸缓冲液(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)(pH8.73)和悬浊液I的稀释液。反应容量为0.5ml，37℃下反应10分钟后，通过添加1ml的3.5N乙酸水溶液停止反应。通过离心分离(10,000g、5分钟、4℃)除去不溶物。通过测定悬浊液I的稀释液和空白对照(使用0.85％(w/v)NaCl水溶液代替悬浊液I的稀释液)的上清在405nm处的吸光度的差异，对生成的对硝基苯胺进行定量(ε405nm＝9920M-1cm-1)。本条件下将1分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量定义为1U的情况下，悬浊液I的酶活性为2.6U/ml。
〔试验例5〕含有GGT的GGT粗酶溶液的制备
从试验例3得到的菌体(B101株)制备GGT集中存在的细胞周质馏分，制备含有GGT的GGT粗酶溶液。制备方法以参考文献[J.Bacteriol.1986Dec；168(3):1332-1335.γ-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12:Formation and Localization.Suzuki H.等](该文献作为参考引入此处)记载的方法为参考并作适当改变。
具体地，首先将1.2g的湿菌体均匀分散在15ml的0.2M Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、20％(w/v)蔗糖、1mM EDTA、30U/ml溶菌酶的溶液中，25℃下缓慢振荡10分钟。加入事先冰冻的纯水15ml，翻转混合后，在冰水中冷却10分钟。将通过离心分离(8,000g、15分钟、4℃)得到的上清液用0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行透析，作为细胞周质馏分。该细胞周质馏分中含有含GGT的蛋白质14mg，将该细胞周质馏分作为含有GGT的GGT粗酶溶液。通过与试验例4同样的方法测定该酶溶液的GGT酶活性，结果如下：GGT酶活性为0.45U/mg。
〔实施例1〕使用试验例5的GGT粗酶溶液合成γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸
使用试验例5得到的GGT粗酶溶液，以L-谷氨酰胺和Val-Gly为基质进行酶反应，得到γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸。
具体地，制备添加了0.2M的L-谷氨酰胺、0.2M的缬氨酰甘氨酸、0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)、试验例5得到的蛋白质浓度为1.2mg/ml的细胞周质馏分(GGT粗酶溶液)的溶液。溶液的pH根据需要在反应开始时通过添加KOH水溶液来调节。以反应温度37℃、反应时间1小时的条件进行反应。在反应结束后通过HPLC进行缬氨酰甘氨酸和γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的定量。该HPLC用的色谱柱使用菲罗门公司制的Synergi 4μHydro-RP 80A(粒径4μm、内径4.6mm、长250mm)。该HPLC用的洗脱液使用A液(50mM磷酸二氢钠(pH2.5、通过磷酸调节pH)和B液(A液与乙腈的1:1混合液)。柱温为40℃、UV检测波长为210nm，洗脱液的梯度为：0～5分钟B液0～5％、5～15分钟B液5％、15～30分钟B液5～80％、30～30.1分钟B液80～0％、30.1～50分钟B液0％。HPLC的测定结果如下：反应得到的混合溶液中含有γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸25.8mM、缬氨酰甘氨酸171.0mM(混合溶液中的缬氨酰甘氨酸相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸为381质量％)。
〔实施例2〕使用菌体(B101株)合成γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸
使用试验例3得到的菌体(B101株)，以缬氨酰甘氨酸和作为γ-谷氨酰基供体的L-谷氨酰胺为基质进行酶反应，得到γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸。
具体地，获得添加了0.2M的L-谷氨酰胺、0.2M的缬氨酰甘氨酸、0.1M的磷酸钾缓冲液和含有下表1所示量的菌体(B101株)的悬浊液I的溶液。
溶液的pH调节使用磷酸钾缓冲液和根据需要使用KOH水溶液。反应开始时的pH调节为7.0或8.0。反应温度37℃、反应时间1小时，边搅拌混合边反应。反应结束后，通过实施例1所示的HPLC对缬氨酰甘氨酸和γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸定量。结果如表1所示。此外,下面的表中记为缬氨酰甘氨酸(VG)、γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸(EVG)。
表1
〔实施例3〕使用菌体(B101株)合成γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸
使用试验例3得到的菌体(B101株)，以缬氨酰甘氨酸和作为γ-谷氨酰基供体的L-谷氨酰胺为基质进行酶反应，得到γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸。
具体地，获得添加了0.2M的缬氨酰甘氨酸、0.1M的磷酸钾缓冲液和含有17.6mg/ml的湿菌体(B101株)的悬浊液I。L-谷氨酰胺的量相对于缬氨酰甘氨酸为1.0～3.0当量。溶液的pH调节使用pH8.0的磷酸钾缓冲液和根据需要使用KOH水溶液。反应开始时的pH制备为8.0。反应温度37℃、反应时间1小时，边搅拌混合边反应。反应结束后，通过实施例1所示的HPLC，对缬氨酰甘氨酸和γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸定量。结果如表2所示。
表2
L-谷氨酰胺当量 VG(mM) EVG(mM) VG/EVG(wt％)
1.0 135.5 69.8 111％
1.5 113.2 84.3 77％
2.0 112.4 89.9 72％
2.5 109.5 89.3 70％
3.0 107.8 89.1 69％
如实施例1～3的结果所示，通过使用GGT或产生GGT的菌体，可以将缬氨酰甘氨酸γ-谷氨酰化，得到γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸。
(2)将得到的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为0.1质量％以上低于20质量％的工序
将所述实施例1～3记载的通过GGT酶反应得到的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量按如下方式调节。
〔实施例4〕缬氨酰甘氨酸量的调节
将通过GGT酶反应得到的含有缬氨酰甘氨酸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液用高压釜于121℃实施20分钟加热处理后，通过0.45μm的微滤膜(研华科技公司制)过滤该溶液含有的菌体，得到含有15.89g(52.39mmol)的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和6.09g(34.99mmol)的缬氨酰甘氨酸的除菌液209.08g。此外，用35％HCl将该除菌液调节为pH3.0(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝38.4质量％)。将该pH调节液以SV1(650mL/小时)的流速流过填充有合成吸附树脂(三菱化学公司制的SP207)650mL的内径5cm的色谱柱，接着以同流速流过去离子水1300mL。然后，以SV2(1300mL/小时)的流速流过1950mL的10％MeOH、1950mL的20％MeOH。流出液中，回收1.8～5.8RV(1170mL～3770mL)的馏分，得到含有15.07g(49.69mmol)的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和0.06g(0.33mmol)的缬氨酰甘氨酸的回收液2513.63g。回收液中缬氨酰甘氨酸的质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量的比率为0.4质量％。因此，通过本实施例4，可以将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液中存在的缬氨酰甘氨酸的量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量从38.4质量％调节为0.4质量％。
(3)将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶得到γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序
〔实施例5〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
将实施例4得到的调节了缬氨酰甘氨酸量的回收液2513.63g减压浓缩到99.03g后，保持在50℃，用1小时的时间添加237mL的MeOH。添加过程中，在添加了50mL MeOH的时间点添加144mg的晶种(γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体，按照专利文献1的实施例记载的方法调节，下同)。然后，以5℃/小时的速度将溶液整体冷却到10℃，析出晶体。将析出晶体后的溶液继续在10℃保持76.5小时，分离析出的晶体，得到未清洗的湿晶体。用40mL的MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，获得湿晶体29.67g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体11.05g。得到的晶体含有10.77g(35.52mmol)的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体(结晶产率71.5质量％)。
与未实施缬氨酰甘氨酸量调节工序的下述比较例1相比，可以确认产率提高。
〔比较例1〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
通过GGT酶反应得到的含有缬氨酰甘氨酸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液用高压釜于121℃实施20分钟加热处理后，通过0.45μm的微滤膜(研华科技公司制)过滤该溶液含有的菌体，得到含有1.26g(4.14mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和0.26g(1.48mmol)缬氨酰甘氨酸的除菌液100.11g。此外，用35％HCl将该除菌液调节为pH3.0(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝21质量％)。将该pH调节液减压浓缩至8.24g后，在50℃保持，用1小时的时间添加16.4mL的MeOH。在该添加过程中，添加17.7mg晶种。然后，以5℃/小时的速度将溶液整体冷却到10℃，析出晶体。将析出晶体后的溶液继续在10℃保持48小时后，分离析出的晶体，得到未清洗的湿晶体。用1.7mL的MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，获得湿晶体1.44g。得到的晶体含有0.54g(1.77mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.001g(0.003mmol)缬氨酰甘氨酸(结晶产率42.8质量％)。
〔实施例6〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在9.98g(32.89mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和1.14g(6.57mmol)的缬氨酰甘氨酸中添加纯水28.9mL，在75℃溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝11质量％)。以10℃/小时的速度将得到的溶液冷却到50℃，在该添加过程中，在60℃下添加约50mg晶种。到达50℃后保持1小时，用1小时的时间添加44mL的MeOH。然后，以5℃/小时的速度冷却到10℃析出晶体。析出晶体后的溶液继续在10℃下保持30小时以上，然后，分离析出的晶体，得到未清洗的湿晶体。用26mL的90％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体11.41g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体8.07g。得到的晶体含有8.04g(26.51mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.03g(0.19mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔实施例7〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在9.80g(32.32mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和1.68g(9.63mmol)缬氨酰甘氨酸中添加纯水28.7mL，在75℃下溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝17质量％)。与实施例6同样地使得到的溶液析出晶体，得到未清洗的湿晶体。用25mL的90％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体11.37g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体7.65g。得到的晶体含有7.61g(25.08mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.04g(0.24mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔实施例8〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在10.00g(32.97mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和1.30g(7.46mmol)缬氨酰甘氨酸中添加纯水28.7mL，在75℃下溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝13质量％)。以10℃/小时的速度将得到的溶液冷却到50℃，在该添加过程中，在60℃下添加约50mg晶种。到达50℃后保持1小时，用1小时的时间添加114.8mL的MeOH。然后，以5℃/小时的速度冷却到10℃析出晶体。析出晶体后的溶液继续在10℃下保持10小时以上后，分离析出的晶体，得到未清洗的湿晶体14.58g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体8.07g。得到的晶体含有7.89g(26.00mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.17g(0.96mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔实施例9〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在9.95g(32.80mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和1.57g(8.99mmol)缬氨酰甘氨酸中添加纯水28.5mL，在75℃溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝16质量％)。与实施例8同样地使得到的溶液析出晶体，得到未清洗的湿晶体。用10mL的90％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体15.2g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体7.82g。得到的晶体含有7.71g(25.43mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.11g(0.63mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔比较例2〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在9.52g(31.39mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和1.97g(11.28mmol)缬氨酰甘氨酸中添加纯水28.5mL，在75℃溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝21质量％)。与实施例6同样地使得到的溶液析出晶体，得到未清洗的湿晶体。用37mL的90％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体15.95g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体8.16g。得到的晶体含有7.23g(23.84mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.93g(5.35mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔比较例3〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在9.80g(32.32mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和2.51g(14.44mmol)的缬氨酰甘氨酸中添加纯水27.8mL，在75℃溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝26质量％)。与实施例6同样地使得到的溶液析出晶体，得到未清洗的湿晶体。用40mL的90％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体18.72g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体8.91g。得到的晶体含有7.28g(23.99mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和1.63g(9.38mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔比较例4〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
在9.85g(32.49mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和2.05g(11.76mmol)缬氨酰甘氨酸中添加纯水28.1mL，在75℃溶解，得到溶液(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝21质量％)。与实施例8同样地使得到的溶液析出晶体，得到未清洗的湿晶体。用10mL的90％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体16.2g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体8.24g。得到的晶体含有7.57g(24.97mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体和0.67g(3.84mmol)缬氨酰甘氨酸。
〔比较例5〕γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备
将通过GGT酶反应得到的含有缬氨酰甘氨酸的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液在80℃下加热处理30分钟后，除去该溶液中含有的菌体。将含有8.80g(29.01mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸和3.46g(19.87mmol)缬氨酰甘氨酸的该除菌液300.6g(溶液中的缬氨酰甘氨酸质量相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸质量的比率＝39质量％)减压浓缩到76.04g后，保持在50℃，用1小时的时间添加56mL的MeOH。该添加过程中，添加86.40mg晶种。然后，以5℃/小时的速度将溶液整体冷却到10℃，析出晶体。将析出晶体后的溶液继续在10℃保持35小时，然后分离析出的晶体，得到未清洗的湿晶体。用20mL的90体积％MeOH清洗得到的未清洗的湿晶体，得到湿晶体14.72g。将该湿晶体在40℃条件下减压干燥，得到干燥晶体9.93g。得到的晶体(参照图5的晶体照片)含有3.09g(10.19mmol)γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体、0.004g(0.013mmol)缬氨酰缬氨酰甘氨酸和0.0002g(0.001mmol)缬氨酰缬氨酸(结晶产率35.1质量％)。
所述实施例和比较例的结果总结于下面的表3-1和3-2。
表3-1
实施例5 实施例6 实施例7 实施例8 实施例9
EVG溶液中的VG/EVG(质量％) 0.4 11 17 13 16
结晶MeOH浓度(体积％) 75 60 60 80 80
EVG晶体的产率(质量％) 71.5 80.6 77.6 78.9 77.1
干燥减量(质量％) 62.8 29.3 32.7 44.7 48.1
EVG晶体的纯度(质量％) 97.5 99.6 99.5 97.8 98.6
过滤速度(L/m2·小时) N.D. 1150 860 N.D. N.D.
表3-2
比较例1 比较例2 比较例3 比较例4 比较例5
EVG溶液中的VG/EVG(质量％) 21 21 26 21 39
结晶MeOH浓度(体积％) 78 60 60 60 60
EVG晶体的产率(质量％) 42.8 75.9 74.2 75.7 35.1
干燥减量(质量％) N.D. 48.8 52.4 49 32.5
EVG晶体的纯度(质量％) N.D. 88.6 81.7 91.9 31.1
过滤孔径(μm) N.D. 1 1 N.D. 3
过滤速度(L/m2·小时) N.D. 80 60 N.D. 489
如上述表3-1和3-2所示，将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为0.1质量％以上低于20质量％后，通过结晶γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体(实施例5～9)，与比较例相比，可以提高γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的产率。
此外，显示得到了干燥减量也减少且干燥前的晶体中含有的水分量减少的优异晶体。此外，也显示由于过滤速度大幅提高，因此得到晶体形状大且过滤性优异的晶体。此处，干燥减量通过下式计算。
干燥减量(质量％)＝{(干燥前的晶体质量-干燥后的晶体质量)/干燥前的晶体质量}×100
此外，显示得到了晶体纯度也优异的晶体。此处,用HPLC对所定量的实施例或比较例得到的晶体溶解于水制成的水溶液(X1g/ml)中EVG的浓度(X2g/ml)进行定量，通过下式求出EVG晶体的纯度。
纯度(质量％)＝X1/X2×100
该HPLC用的色谱柱使用YMC公司制的Hydrosphere C18(粒径5μm、内径4.6mm、长250mm)。该HPLC用的洗脱液使用A液(50mM磷酸二氢钾(pH3.0、通过磷酸调节pH)和B液(乙腈)。柱温为30℃，UV检测波长为210nm，洗脱液梯度为：0～25分钟B液0％、25～50分钟B液0～40％、50～51分钟B液40～0％、51～70分钟B液0％。
[2]γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的评价
实施例6和7、比较例1和2得到的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的光学显微镜照片分别如图1～4所示。根据这些光学显微镜照片，测定图1～4所示的各例的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的短轴方向的平均直径。
具体地，通过光学显微镜拍摄照片，随机选取10个晶体，测定求出平均值。结果总结于下面的表4-1。此外，使用上述光学显微镜装置和分析软件等算出的短轴方向直径的平均值如表4-2所示。
表4-1
表4-2
如表4-1、表4-2和图1～4所示，通过本发明的方法得到的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体与比较例相比，短轴方向的直径大，即得到了大且粗的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体。
按照与上述同样的HPLC条件测定实施例5和比较例1得到的晶体中含有的缬氨酰缬氨酰甘氨酸和缬氨酰缬氨酸的含量。结果如下:以结晶产率71.5质量％结晶的实施例5的晶体在干燥晶体11.05g中含有0.04g(0.16mmol)缬氨酰缬氨酰甘氨酸和0.08g(0.38mmol)缬氨酰缬氨酸。此外，以结晶产率35.1质量％结晶的比较例5的晶体在干燥晶体9.93中含有0.004g(0.013mmol)缬氨酰缬氨酰甘氨酸和0.0002g(0.001mmol)缬氨酰缬氨酸。
〔序列表的说明〕
序列号1:大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ggt基因的碱基序列
序列号2:大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GGT的氨基酸序列
序列号3:大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pepD基因的碱基序列
序列号4:大肠埃希氏菌(Escherichia coli)PepD的氨基酸序列
序列号5～12:pSF12_ggt制备用的PCR引物
序列号13～14:pepD基因破坏用的PCR引物

Claims (7)

1.一种γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的制备方法，该方法包括:
在γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物的存在下，使缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体反应，获得缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的混合溶液的工序，此处,所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸相对于γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量比为20质量％以上；
将获得的混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量调节为相对于该溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量为0.1质量％以上低于20质量％，获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液的工序；以及
使所述γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸溶液结晶,获得γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸晶体的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中,使所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量在其相对于该溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸的质量在1质量％～18质量％的范围内进行调节。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中,所述混合溶液中存在的缬氨酰甘氨酸或其盐的量如下进行调节:使所述混合溶液中的γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸吸附于吸附树脂，而所述混合溶液中的缬氨酰甘氨酸或其盐流过所述吸附树脂后，将γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸从吸附树脂上洗脱。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中,γ-谷氨酰基供体是谷氨酰胺。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中,γ-谷氨酰转移酶或含有该酶的微生物是属于肠杆菌科的细菌。
6.如权利要求5所述的方法，其中,所述细菌是大肠埃希氏菌。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中,缬氨酰甘氨酸或其盐与γ-谷氨酰基供体的反应在选自水或缓冲液的溶剂中进行。
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