CN104531756A - 一种使烟草获得马铃薯y病毒抗性的方法及vigs载体 - Google Patents

Abstract

一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，该方法是首先制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒HC-Pro序列；再于烟苗剪叶后，喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将HC-Pro基因片段导入烟草。本发明同时提供一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的上述VIGS载体。本发明以种植普通烟草为试材，以烟田危害广泛的马铃薯Y病毒为靶标病毒进行具体实验验证，实验数据显示，导入HC-Pro基因的烟草获得良好的PVY病毒抗性。

Description

一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法及VIGS载体

技术领域

本发明涉及利用RNA沉默技术诱导植物抗性技术领域，特别是一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法及VIGS载体。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物。烟草马铃薯Y病毒病(Potato virus Y，PVY)在烟草上引起严重花叶坏死斑和坏死条斑，植株矮小。马铃薯Y病毒寄主范围广泛，可侵染茄科多种植物，烟草上马铃薯Y病毒主要靠蚜虫传播。根据近年调查发现：烟草PVY的危害日益严重，防治困难，严重影响烟草的产量和品质，已造成巨大的经济损失。目前针对烟草马铃薯Y病毒病缺乏有效地药剂防治，外加烟株上经常存在复合侵染，加大病害的防治难度。选育抗性品种成为不失成为一种有效方式，但抗性品种选育时间慢、抗性基因缺乏，有诸多局限。随着分子生物学的发展，RNA干扰为病毒防治提供了一条新途径。

RNA沉默技术在植物中发生常称为共抑制(Co-suppression)或转录后基因沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)，在果蝇等动物中发生常称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)，在真菌中发生常称为基因抑制(Quelling)。1990年Rich Jorgensen在矮牵牛中发现一种转基因同时抑制自身和相应內源基因表达的基因沉默现象。后来人们以拟南芥位研究模型，发现基因沉默发生的同时，转录后加工成熟的mRNA却大大减少。1998年Andrew Fire和Craig Mello将双链dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫，结果诱发了单独注射强得多的基因沉默。病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silence，VIGS)是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒基因组cDNA导入植株并表达后，诱发RNA介导的防御机制(RNA-mediated defence，RMD)，同时诱发与插入片段同源基因的表达沉默。早在20世纪20～30年代期间，人们就发现感染了病毒温和株系的植 株可以抵御随后的温和株系及与其亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染，即交叉保护现象。进一步研究发现，交叉保护现象是由于病毒诱导产生了RNA沉默，使植株产生了对该病毒的抗性，即病毒诱导的基因沉默。后来在转基因植株中出现了类似的现象，即病毒接种的初期，病毒正常增殖，接种叶片表现出被病毒感染的症状。但随着病毒在植株中的系统扩散，植株的新生叶片中虽仅含有少量的转入基因，但表现出对该病毒的抗性。

目前普遍接受的时双链RNA模型假说。长的dsRNA被RNAseⅢ家族的Dicer酶识别，并切割成具有21-23nt的双链RNA(siRNA),siRNA与一些酶和相关因子共同组成RNA介导的沉默复合体(RISC)，在ATP的作用下，沉默复合体由解旋酶解开siRNA的双链，使沉默复合体(RISC)转变成活性复合体(siRNA的双链解旋后形成的一种稳定的活性结构形式)；其次，由siRNA的反义链引导复合体与靶mRNA的特异序列杂交，在RdRp(RNA direction RNA ploymerase)的催化下，以siRNA的反义链为引物、靶mRNA为模板，合成新的长链dsRNA，新合成的长链dsRNA被核酸内切酶切割成21-23nt siRNA，这些新生成的siRNA和有活性的RISC重新进入以上循环。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使靶mRNA渐进性地减少，有效地抑制了mRNA翻译的形成，从而有效地阻止了靶向基因蛋白质或多肽的合成，使病毒表现出基因沉默现象。同时结合了RISC的靶mRNA因缺乏poly(A)尾巴和稳定头部的保护，也会被内切酶切割。

Ratciff等将其改造成TRV的RNA1和RNA2 cDNA的双元表达载体，并利用TRV载体成功使转基因烟草的绿色荧光蛋白基因沉默。TRV是目前应用最广的VIGS载体，具有沉默效率高且效果持久、各种组织均可产生沉默等优点，介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状，改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染,因而已被广泛应用于烟草、番茄、马铃薯、碧冬茄、辣椒等多种茄科植物。

马铃薯Y病毒辅助蛋白酶(Helper Component-Proteinase，HC-Pro)蛋白是类似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶，具有双重功能，既是蚜虫传毒的辅助成分，又具有蛋白酶活性，其C-末端可以自动将HC-Pro从多聚蛋白上切割下来。根据其已知功能HC-Pro可分为三部分：N-端、C-端和中间区域。其中HC-Pro N-端控制着病毒的蚜传、致病性、基因组的扩增和病毒的积累；中间区域具有影响病毒的长距离移动、协生作用、基因组的扩增、抑制RNA沉默和维持病毒的复制等功能。

因为马铃薯Y病毒在烟草上的传播主要是蚜虫传毒，所以选用对蚜虫传毒有重要影响的HC-Pro基因作为抗马铃薯Y病毒的靶标基因，但到目前为止，通过基因沉默原理，特异性的沉默马铃薯Y病毒HC-Pro基因使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，以及该方法涉及到的VIGS载体。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，该方法步骤如下：

(1)制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒HC-Pro序列；

(2)烟苗剪叶后喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的体积比为1：1的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将HC-Pro基因片段导入烟草。

本发明同时提供一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的VIGS载体，所述VIGS载体的靶标序列为HC-Pro序列。

本发明还保护转化有上述VIGS载体的菌株，其出发菌株为根癌农杆菌GV3101。

本发明目的在于，以烟草马铃薯Y病毒脉坏死株系为材料，构建靶向HC-PRO基因的VIGS载体，诱发烟草自身防御机制的同时，干扰烟草马铃薯Y病毒在植物体内的复制、运输、致病性和传播，并使病毒失去保护作用，达到防御烟草马铃薯Y病毒病的目的。本发明区别现有技术的思路是：构建的使烟草产生马铃薯Y病毒抗性的VIGS载体的沉默对象是入侵病毒的HC-Pro基因，而非植物本身基因。

本发明以种植普通烟草为试材，以烟田危害广泛的马铃薯Y病毒为靶标病毒进行具体实验验证，实验数据显示，喷施菌液的烟草获得良好的PVY病毒抗性。基于本发明的构思，说明书中记载的实验方法的指导以及本领域普通技术人员所具备的常规实验技能，本领域技术人员可以将本发明的方法应用到多种烟草病毒病，这种应用都在本发明请求保护的范围内。

附图说明

图1是含PVY HC-PRO基因片段载体的构建。

图2是含马铃薯Y病毒脉坏死株系马铃薯总RNA提取的电泳图。

其中：从左至右，第1-6泳道：含马铃薯Y病毒脉坏死株系马铃薯总RNA提取，可以观察到有明显的两条带，证明RNA提取成功，可进行反转录；第7泳道：2k plus mark。

图3是马铃薯Y病毒HC-Pro基因PCR扩增电泳图。

其中，M：2k plus mark；1：退火温度54℃；2：退火温度58℃；6：阴性对照。

图4是PTV00-HC-Pro载体质粒酶切电泳图。

其中，M:2K plus mark 1：PTV00-HC-Pro质粒；2：PTV00-HC-Pro质粒酶切，显示二条带。

图5是大田验证PTV00-HC-Pro的转入。

其中，1-12：田间试验随机采样，反转录后用PTV00R/PTV00F PCR扩增,除 2孔和9孔为阴性，其余10个样本为阳性；M：2K plus mark。

具体实施方式

本发明中所有引物皆由上海生工生物工程公司合成。

实施例1 PVY的HC-PRO基因的克隆及测序验证

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Y病毒属中的典型种，对马铃薯、烟草等重要经济作物危害相当严重，特别是PVY坏死株系(PVYN)可以造成寄主植物提前死亡而绝产。

本发明针对马铃薯Y病毒(PVY)脉坏死株系的HC-PRO基因设计引物：HC-Pro F:5`-ATGGATCCTGGCTGAGTTTAGGCGGAAGA-3`(如SEQ ID No.2所示)，HC-Pro R:5`-TCGGTACCTGATACCCAGTCGTTTGTGAG-3`(如SEQ ID No.3所示)，下划线部分为引入的酶切位点，采用PCR方法克隆PVY的HC-PRO基因，具体步骤如下：

提取含马铃薯Y病毒总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪检测其质量和浓度，见图2，通过反应体系(RNA 50ng-5ug、Anchored oligo(dT)Primer 1ul、2*TS Rection Mix 10ul、Enzyme Mix 1ul、gDNA Remover 1ul、去RNA水补足至20ul)进行反转录成cDNA。

利用引物HC-PROF/HC-PROR，以该马铃薯Y病毒cDNA为模板，进行PCR扩增，获得PVY-HC-PRO基因片段，见图3。其中，PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2ul、DNA模板1ul、dNTP 1.6ul、上下游引物各0.8ul、Taq酶0.4ul、去离子水补足至20ul；PCR反应条件为：94℃3min预变性，94℃30sec变性；50-68℃30sec退火；72℃1min延伸(目的片段大于500 bp用1分钟，小于500 bp用40秒)，35个循环，72℃10min，4℃保存。

对PCR产物(PVY-HC-Pro基因片段)进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收该PVY-HC-PRO基因片段，将该回收片段与载体T1 Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有限公司)连接，取10ul连接产物，转化大肠杆菌感受态细胞(感受态大肠杆菌TransT1 Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术 有限公司)。根据载体上的氨苄青霉素抗性标记筛选阳性转化子，利用克隆载体检测引物(M13+：5'-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3'，如SEQ ID No.4所示，M13-：5'-GTGTGAAATTGTTATCCGCTC-3'，如SEQ ID No.5所示)，按前述的PCR扩增方法和体系筛选阳性克隆，其PCR产物大小约530bp，与HC-Pro基因片段长度基本一致。将阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，结果与预期完全一致。

实施例2 VIGS载体(PTV00-HC-Pro重组载体)构建

病毒载体：烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)，Ratciff等将其改造成TRV的RNA1和RNA2 cDNA的双元表达载体，通过进一步改造成PTV00和PBNTRA6，本实验亦有保存。

本发明中利用PTV00一组酶切位点BamHI/KpnI，将PCR扩增获得的HC-Pro基因片段(480bp)连接到PTV00酶切位点中。将PTV00-HC-Pro质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取质粒用于根癌农杆菌转化。酶切验证如图4，可结合参见图1。测序结果显示序列构建位置正确。操作如下：

步骤1.PTV00载体片段酶切与回收

提取大肠杆菌中PTV00质粒(质粒DNA的小量提取试剂盒)。取25ul质粒，利用BamHI和KpnI内切酶，采用100ul酶切体系，37℃酶切45min，回收酶切产物中3K左右长度的质粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光检测琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。回收片段标记为PTV00-BamHI/KpnI。

步骤2.PVY-HC-Pro基因PCR片段酶切与回收

分别纯化回收PCR产物得HC-Pro基因片段。各取25ul回收片段，利用KpnI和BamHI内切酶，采用100ul酶切体系，37℃酶切45min，回收酶切产物中对应序列长度的质粒片段。取1ul回收片段，进行凝胶电泳判断回收质量。HC-Pro回收片段标记为HC-Pro-KpnI/BamHI.

步骤3.PTV00-BamHI/KpnI和HC-Pro-KpnI/BamHI的连接与转化大肠杆菌

取5ul HC-Pro-KpnI/BamHI和2ul PTV00-BamHI/KpnI以反应体系(10×T4 DNA  Ligation Buffer 4ul、T4 DNA Ligase(1U/ul)2ul、酶切回收后PCR片段10ul、载体(50-400ng)4ul、无菌去离子水补足到20ul)分别进行接连，用PCR仪进行控温，16℃16h。

将链接产物进入大肠杆菌感受态细胞，参照实施例1中的PCR扩增方法和反应体系，于筛选平板加入50mg/L卡那霉素(Kan)为抗生素筛选阳性转化子，利用克隆载体检测引物M13+/-检测转化子，选择PCR检测为阳性的转化菌，测序验证：得到重组载体，标记为PTV00-HC-Pro。

实施例3 PTV00-HC-Pro重组载体转化农杆菌GV3101

步骤1.根癌农杆菌感受态细胞制备

(1)挑选根癌农杆菌GV3101菌落，接种于含有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃200rpm培养16h。

(2)取500ulGV3101菌液至50ml液体LB培养基中摇陪至OD600值为0.6左右。

(3)将菌液冰浴30min，4℃。5000rmp离心10min，收集菌。

(4)用40ml预冷的10％甘油重悬菌体，4℃4500rmp，离心10min，收集菌体。

(5)用20ml预冷的10％甘油重悬菌体，4℃4500rmp，离心10min，收集菌体。

(6)用10ml预冷的10％甘油重悬菌体，4℃4500rmp，离心10min，收集菌体。

(7)用2ml预冷的10％甘油重悬菌体，分装每管50ml液氮速冻。-80℃保存。步骤2.PTV00-HC-PRO电击转化进GV3101

(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。

(2)取1ul纯化后的PTV00-HC-PRO质粒于1.5ml的离心管中，将其和0.1cm的电击杯一起置于冰上预冷。

(3)将100ul解冻的感受态细胞转移至1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

(4)打开电转仪，调至Manal，使其电压2.1kv。

(5)将此混合物转移至已预冷的点击杯中，轻轻敲击电击杯，使其混合物 均匀进入电击杯的底部。

(6)将电击杯推入电转化仪，按(4)中设定的参数，听到蜂鸣后，向电击杯中迅速加入1ml的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

(7)28℃、200rmp震荡培养3h。

(8)取50-100ul菌液涂布在加有抗生素Kan和Rif的LB培养基上，平板正向放置1h，28℃倒置培养2-3天，直至菌落长出。

(9)以实施例1中的PCR扩增方法和反应体系，利用克隆载体检测引物M13+/-检测转化子，阳性结果为PVY-HC-Pro基因片段长度为480bp，选择PCR检测为阳性转化菌，测序验证：得到根癌农杆菌阳性菌液，标记为PTV00-HC-Pro-GV3101。

实施例4含HC-Pro基因烟草的获得

步骤1.PTV00-HC-Pro导入被试烟草

(1)28℃、200rmp培养PTV00-HC-Pro-GV3101和PBNTRA6-GV3101菌液，摇至OD600为0.4-0.6左右；

(2)将PTV00-HC-PRO-GV3101和PBNTRA6-GV3101以1:1比例混合在一起，放置30min；

(3)选取将剪叶的烟草苗，进行剪叶‘喷施(2)中所述的混合菌液；

(4)10min后，用清水喷施，将叶片菌液洗净；

(5)每隔3天喷施1次，连续喷施3次。

步骤2.被试烟草RT-PCR检测

待育苗盘烟草长至足够移苗，提取被试烟苗RNA，反转录合成cDNA，利用引物(PTV00R:5`-TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC-3`，如SEQ ID No.6所示；PTV00F:5`-GGCAATCAGGTGCGACAATC-3`，如SEQ ID No.7所示)，RT-PCR检测HC-Pro基因是否成功转入被试烟草中。结果如图5所示，显示HC-PRO基因成果转入。

实施列5 VIGS技术处理烟草的抗性确定

本实验原理，TRV侵染烟草引起防卫反应，同时由于TRV的侵染将PVY HC-Pro基因导入烟草，启动VIGS，PVY侵染烟草时引起HC-Pro基因同源降解，抑制PVY的侵染。

待田间烟草进入旺长初期，摩擦接种马铃薯Y病毒脉坏死株系病毒。

(1)配置0.01mol/L、pH7.0磷酸缓冲液。PBS配置KCl 0.2g、KH₂PO₄0.2g、NaCl 8.0g、Na₂HPO₄·2H₂O 1.56g、溶于1000ml三蒸水中，分装消毒，高压锅中121℃20min消毒；

(2)病毒制备：取实验室保存含马铃薯Y病毒脉坏死株系烟草发病叶片。按1:200比例加磷酸缓冲液，捣碎，双层纱布过滤后立即使用；

(3)借种方法：选取长成新叶，在表面均匀撒上碳化硅(600目)，用毛笔蘸取接种悬浮液，在叶面轻度摩擦造成微伤，每株接种1片叶，接种后20min用清水冲洗叶面上多余的病毒汁液。接种当天温度为20-30℃，正常栽培管理；

(4)病情调查与分级标准，根据国家病害调查标准GB/T 233222-2008。

(5)调查时间：在接种后约30d进行；

(6)调查记载每一鉴定植株的病情级别，并计算病情指数、防治效果。病情指数按下列公式计算：

发病率＝发病株数/统计总数。

病情指数＝Σ(各级病株数*病级值)/(调查总株数*最高病级值)。

防治效果＝(对照病指-处理病指)/对照病指

湖南省浏阳市永安镇烟草基地中历年PVY发病较重的烟田，烟苗3月25日移栽，覆盖地膜，行株距为1.2×0.5m。选取健康、长势、土壤肥力均等的G80烟田，人工摩檫接种发病。划分4个小区，每个小区5排，每排19株，每小区共95株，共试验380株处理情况如下：标记1-19行、39-47行为空白CK组(栽植剪叶后喷施清水处理的烟苗)，20-38行、48-56行为处理HC-Pro组(栽植剪叶后喷施本发明混合液处理的烟苗)。4月26日全部摩檫接种PVY，30d后，调查PVY发病率，病情统计结果见下表1。

表1本发明混合液对PVY田间防治效果：

由上表1可知，烟苗剪叶后利用本发明混合液处理的HC-Pro组，较用清水处理的CK组不论是发病率还是病情指数都大幅度减弱，且防效极为显著。本发明混合液对PVY田间防效均达到60％以上。因此，本发明技术和施用方法对PVY的防治有一定的应用价值。

Claims (5)

1.一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，该方法步骤如下：

(1)制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒HC-Pro序列；

(2)烟苗剪叶后喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的体积比为1：1的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将HC-Pro基因片段导入烟草。

2.根据权利要求1所述的一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，所述VIGS载体为PTV00-HC-Pro载体。

3.一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的VIGS载体，其特征在于，所述VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒HC-Pro序列。

4.一种转化有权利要求3所述VIGS载体的菌株。

5.根据权利要求4所述的菌株，其出发菌株为根癌农杆菌GV3101。