CN104531667A - 一种多酚氧化酶固定化载体的制备方法 - Google Patents

一种多酚氧化酶固定化载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多酚氧化酶固定化载体的制备方法及以其为载体固定化多酚氧化酶的方法。采用溶液插层法，将壳聚糖分子链插入蒙脱土片层间，制备壳聚糖/蒙脱土插层复合物，再利用壳聚糖多羟基和多氨基的化学结构，使其作为稳定剂和还原剂，原位还原氯金酸实现纳米金粒子的一步、绿色合成，制备壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物，并以此插层复合物为载体固定多酚氧化酶。以此插层复合物为多酚氧化酶的固定化载体，制备得固定化酶具有固定化效率高、酶活性高及稳定性好等优点。

Description

一种多酚氧化酶固定化载体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种固定化酶载体的制备方法，特别涉及一种固定化多酚氧化酶载体的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
多酚氧化酶是一类氧化还原酶，具有羟化酶和氧化酶的双重性质，在有氧条件下能催化单酚类化合物羟基化生成邻苯二酚，再氧化邻苯二酚脱氢生成醌，这一特性使得多酚氧化酶在工业、食品和环境保护等领域得到了广泛的应用。游离多酚氧化酶在使用过程中存在稳定性低、无法重复使用、易受环境条件的影响而使酶活受到抑制等缺陷，阻碍了其推广应用。
酶的固定化技术可以使酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现操作、储存稳定性高，可多次重复使用等优点，不仅降低了使用成本，还避免了酶蛋白质的污染问题，简化了后处理过程。固定化载体是固定化酶技术中的一个重要部分。载体直接影响酶的固定化效率、固定化酶活性及固定化酶的稳定性等重要性质。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，分子链上分布着大量的羟基和氨基。一方面，其分子链上丰富的氨基与各种蛋白质的亲和力非常高；另一方面，壳聚糖不存在易使酶失活的单体。因此，壳聚糖被广泛地用作酶的固定化载体。除此之外，多酚氧化酶大部分处于非活性的中间态，多羟基和多氨基的壳聚糖可以和多酚氧化酶上的羟基和氨基形成氢键，使其中间态变为活性还原态，不仅在多酚氧化酶的固定化过程中避免了酶活的损失，而且还能够矫正酶的空间构型，使酶的活性中心外露，从而提高酶的活性。
纳米金具有良好生物相容性及表面吸附能力，固定到纳米金上的酶分子与自由酶相比，呈现出更高的生物活性和储存稳定性。且有研究表明，纳米金粒子对儿茶酚和对苯二酚等简单酚有明显的催化氧化作用。但对纳米金粒子的深入研究发现，直接在纳米金粒子表面进行酶组装，会不同程度地导致酶活性的降低。壳聚糖因其多羟基和多氨基的化学结构可以作为稳定剂和还原剂一步合成壳聚糖-纳米金粒子。因此，壳聚糖-纳米金粒子兼具了壳聚糖和纳米金粒子的优势，是性能更优的酶固定化载体。但是，壳聚糖-纳米金粒子分离困难，不利于固定化酶的重复使用。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种固定化效率高、稳定性好的多酚氧化酶固定化载体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种在上述载体上固定多酚氧化酶的方法。
本发明采用溶液插层法制备多酚氧化酶固定化载体，将壳聚糖分子链插入蒙脱土片层间，制备壳聚糖/蒙脱土插层复合物，再利用壳聚糖多羟基和多氨基的化学结构，使其作为稳定剂和还原剂还原氯金酸，实现纳米金粒子的一步、原位、绿色合成，制备壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物，并以此插层复合物为载体固定多酚氧化酶。
天然蒙脱土是一种2：1型含水层状硅酸盐，具有独特的层状结构。特殊的片层结构赋予了蒙脱土良好的离子交换性、膨胀性及吸附性等。天然蒙脱土晶格中的Si4+和Al3+被低价阳离子取代后，片层间存在过剩负电荷，对阳离子具有良好的吸附性，可以与蛋白质的－NH3 +结合。除此之外，蒙脱土层间具有可设计的反应性，因而可以将聚合物插入其片层间，使其比表面积增加、层间距增大，降低表面能，并能与聚合物协同增效，产生更优异的性能。
本发明的壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物的具体制备步骤如下：
（1）壳聚糖/蒙脱土插层复合物的制备：壳聚糖/蒙脱土插层复合物是利用溶液插层法将壳聚糖分子链插入蒙脱土片层间制备的；将蒙脱土分散于蒸馏水中，制成1～4%(w/v)的悬浊液，20～60℃搅拌2～8 h，使其充分溶胀；将壳聚糖溶于0.5～3%(v/v)醋酸溶液中，充分溶解后用10～20%(w/v)NaOH溶液调节pH值至4.5～5.3；将与蒙脱土物质的量比为1：1～1：5壳聚糖溶液缓慢加入充分溶胀的蒙脱土悬浮液中，40～60℃下搅拌反应6～12 h；反应结束后，离心、洗涤、干燥，获得壳聚糖/蒙脱土插层复合物。
（2）壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物的制备：将氯金酸溶于蒸馏水中，制备浓度为0.01～0.10 mM的氯金酸溶液，用1 M HCl或1 M NaOH溶液调节pH至3.0～9.0；将壳聚糖/蒙脱土插层复合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸与壳聚糖/蒙脱土插层复合物的质量比为0.15%～1.50%(w/w)，40～80℃恒温搅拌反应1～4 h，反应结束后，离心分离，产物用蒸馏水洗涤至上清液pH值为中性，即得用于多酚氧化酶固定化载体的壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物。
所述壳聚糖的分子量为10万～35万，脱乙酰度为75～95%。
所述蒙脱土为Na基蒙脱土。
本发明还提供了以壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物为载体固定化多酚氧化酶的方法：将壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物加入pH 5.0～7.0的多酚氧化酶磷酸盐缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物载体质量比为20～80 mg/g；20～30℃下振荡吸附4～6 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.0～7.0，浓度为0.05～0.50 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。
酶活性测定：以每分钟催化氧化4.4 μmol/L的左旋多巴(L-DOPA)所需酶量为一个酶活单位(U)；固定化酶活用每克单位载体具有的酶活单位(U/g)表示。
固定化多酚氧化酶重复使用的方法：将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 6.0～7.0，浓度为0.05～0.50 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，可除去固定化酶上附着的反应产物，固定化酶可重复使用。
本发明提供的固定化多酚氧化酶是以壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物为载体制备的。壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物的制备方法简单，复合物耦合了壳聚糖、纳米金及蒙脱土的优势，以此为载体制备的固定化多酚氧化酶具有固定化效率高、酶活性高及稳定性好等优点。
附图说明
图1为壳聚糖(a)、壳聚糖/蒙脱土(b)和壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物(c)的红外光谱图。
图2为壳聚糖(a)、蒙脱土(b)、壳聚糖/蒙脱土(c)和壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物(d)的X-射线衍射图。
图3为壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1：
将4.0 g Na基蒙脱土加入100 mL 蒸馏水中，室温搅拌2 h，使其充分溶胀。将3.3 g壳聚糖溶于250 mL 1%(v/v)醋酸溶液中，充分溶解后用20% (w/v) NaOH溶液调节pH值至4.9。将此壳聚糖溶液缓慢加入上述蒙脱土悬浮液中，加热至60℃，搅拌反应6 h。反应结束后，离心、洗涤、干燥，获得壳聚糖/蒙脱土插层复合物。
将氯金酸溶于蒸馏水中，制备浓度为0.01 mM的氯金酸溶液，用1 M NaOH溶液调节pH至9.0。将壳聚糖/蒙脱土插层复合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸与壳聚糖/蒙脱土插层复合物的质量比为0.15% (w/w)。80℃恒温磁力充分搅拌1 h，反应结束后，离心分离，产物用蒸馏水洗涤至上清液pH值为中性，即得壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物。
如图1所示，壳聚糖(a)在1655cm-1和1597cm-1处的吸收峰分别为壳聚糖酰胺I带和－NH2的N－H变形振动，1420 cm-1和1383 cm-1处的吸收峰分别归属为－CH3和－CH2的C－H变形振动。壳聚糖/蒙脱土插层复合物(b)中3614cm-1处的吸收峰为蒙脱土Al－O－H的伸缩振动，3423cm-1的吸收峰为－OH和壳聚糖中N－H伸缩振动的叠加。1635cm-1处的吸收峰为壳聚糖酰胺I带和蒙脱土中－OH弯曲振动的叠加吸收峰。壳聚糖在1597cm-1处－NH2中N－H变形振动的吸收峰向低波数方向移动，表明壳聚糖的－NH3 +与蒙脱土片层间负电荷间发生了静电作用。与壳聚糖/蒙脱土插层复合物相比，壳聚糖-纳米金/蒙脱土(c)插层复合物在3626 cm-1处的－OH伸缩振动吸收峰增强，在1652cm-1处出现了C=O的吸收峰，这可能是由于壳聚糖/蒙脱土中的－OH参与了HAuCl4的还原反应，HAuCl4将壳聚糖/蒙脱土插层复合物(b)中的－OH氧化成了C=O。3347cm-1和1543 cm-1处N－H的伸缩振动和变形振动吸收峰表明壳聚糖的N－H参与了HAuCl4的还原和稳定，形成了Au－N。
如图2所示，壳聚糖(a) 2θ＝12.9o和19.9o处有两个特征峰，呈现“L-2 polymorph”晶形衍射图。蒙脱土(b)的特征衍射峰出现在2θ＝7.08o，对应层间距为1.25nm。壳聚糖/蒙脱土(c)和壳聚糖-纳米金/蒙脱土(d)插层复合物在小角度的衍射峰向小角方向移动，出现在2θ＝6.22o处，对应层间距为1.42 nm。
如图3的不同放大倍数的扫描电镜图所示，从放大倍数为15万倍(a)和5万倍(b)的壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物扫描电镜图中可以明显看到纳米金粒子存在，且纳米金粒子尺寸均匀；从放大倍数为8000倍的壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物扫描电镜图中(c)可以看出复合物保持了良好的片层结构。
上述结构表征结果表明，壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物不仅具有良好的片层结构，且成功还原HAuCl4获得了纳米金粒子。
将壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物加入pH 5.0的多酚氧化酶缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物载体质量比为20 mg/g。20℃下振荡吸附6 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.0，浓度为0.50 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。固定化酶的活性为16.62×103 U/g。将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 6.0，浓度为0.05 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，重复使用5次后，固定化酶活保留65.7%。
实施例2：
将氯金酸溶于蒸馏水中，制备浓度为0.05 mM的氯金酸溶液，用1 M HCl溶液调节pH至3.0。将壳聚糖/蒙脱土插层复合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸与壳聚糖/蒙脱土插层复合物的质量比为0.50% (w/w)。60℃恒温磁力充分搅拌2 h，反应结束后，离心分离，产物用蒸馏水洗涤至上清液pH值为中性，即得壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物。
将壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物加入pH 7.0的多酚氧化酶缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物载体质量比为80 mg/g。25℃下振荡吸附5 h，过滤除去酶溶液，用pH 7.0，浓度为0.25 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。固定化酶的活性为11.06×103 U/g。将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 7.0，浓度为0.50 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，重复使用5次后，固定化酶活保留69.8%。
实施例3：
将氯金酸溶于蒸馏水中，制备浓度为0.10 mM的氯金酸溶液，用1 M NaOH溶液调节pH至6.0。将壳聚糖/蒙脱土插层复合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸与壳聚糖/蒙脱土插层复合物的质量比为1.00% (w/w)。60℃恒温磁力充分搅拌1.5 h，反应结束后，离心分离，产物用蒸馏水洗涤至上清液pH值为中性，即得壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物。
将壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物加入pH 6.0的多酚氧化酶缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物载体质量比为60 mg/g。30℃下振荡吸附4 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.5，浓度为0.05 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。固定化酶的活性为20.19×103 U/g。将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 6.5，浓度为0.50 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，重复使用5次后，固定化酶活保留67.9%。
实施例4：
将氯金酸溶于蒸馏水中，制备浓度为0.10 mM的氯金酸溶液，用1 M NaOH溶液调节pH至7.0。将壳聚糖/蒙脱土插层复合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸与壳聚糖/蒙脱土插层复合物的质量比为1.50% (w/w)。40℃恒温磁力充分搅拌4 h，反应结束后，离心分离，产物用蒸馏水洗涤至上清液pH值为中性，即得壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物。
将壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物加入pH 6.0的多酚氧化酶缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物载体质量比为40 mg/g。20℃下振荡吸附5 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.0，浓度为0.05 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。固定化酶的活性为19.73×103U/g。将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 6.0，浓度为0.50 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，重复使用5次后，固定化酶活保留70.9%。
对比例1：
将壳聚糖/蒙脱土插层复合物（制备方法参见实施例1）加入pH 5.0的多酚氧化酶缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖/蒙脱土插层复合物载体质量比为20 mg/g。20℃下振荡吸附6 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.0，浓度为0.50 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。固定化酶的活性为4.96×103 U/g。将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 6.0，浓度为0.05 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，重复使用5次后，固定化酶活保留33.9%。
对比例2：
将壳聚糖/蒙脱土插层复合物（制备方法参见实施例1）加入pH 6.0的多酚氧化酶缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖/蒙脱土插层复合物载体质量比为60 mg/g。30℃下振荡吸附4 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.5，浓度为0.05 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。固定化酶的活性为7.76×103 U/g。将使用过的固定化多酚氧化酶用pH 6.0，浓度为0.05 M的磷酸盐缓冲溶液充分洗涤，重复使用5次后，固定化酶活保留36.1%。
从上述实施例和对比例的比较可知，相比以壳聚糖/蒙脱土插层复合物为多酚氧化酶的固定化载体，固定于壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物上的多酚氧化酶活性及重复使用性能均明显提高。

Claims (4)

1.一种多酚氧化酶固定化载体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）壳聚糖/蒙脱土插层复合物的制备：将蒙脱土分散于蒸馏水中，制成1～4%(w/v)的悬浊液，20～60℃搅拌2～8 h，使其充分溶胀；将壳聚糖溶于0.5～3%(v/v)醋酸溶液中，充分溶解后用10～20%(w/v)NaOH溶液调节pH值至4.5～5.3；将与蒙脱土物质的量比为1：1～1：5壳聚糖溶液缓慢加入充分溶胀的蒙脱土悬浮液中，40～60℃下搅拌反应6～12 h；反应结束后，离心、洗涤、干燥，获得壳聚糖/蒙脱土插层复合物；
（2）壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物的制备：将氯金酸溶于蒸馏水中，制备浓度为0.01～0.10 mM的氯金酸溶液，用1 M HCl或1 M NaOH溶液调节pH至3.0～9.0；将壳聚糖/蒙脱土插层复合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸与壳聚糖/蒙脱土插层复合物的质量比为0.15%～1.50%(w/w)，40～80℃恒温搅拌反应1～4 h，反应结束后，离心分离，产物用蒸馏水洗涤至上清液pH值为中性，即得用于多酚氧化酶固定化载体的壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物。
2.根据权利要求1所述多酚氧化酶固定化载体的制备方法，其特征在于所述壳聚糖的分子量为10万～35万，脱乙酰度为75～95%。
3.根据权利要求1所述多酚氧化酶固定化载体的制备方法，其特征在于所述蒙脱土为Na基蒙脱土。
4.一种多酚氧化酶的固定化方法，其特征在于它包括以下步骤：将壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物加入pH 5.0～7.0的多酚氧化酶磷酸盐缓冲溶液中，使得多酚氧化酶与壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物载体质量比为20～80 mg/g；20～30℃下振荡吸附4～6 h，过滤除去酶溶液，用pH 6.0～7.0，浓度为0.05～0.50 M的磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化酶，直至洗涤液在280 nm处无吸收，即得固定化多酚氧化酶。
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