CN101451133B - 硅基介孔分子筛sba-15固定化酶生物催化剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用硅基介孔分子筛SBA-15的固定化酶生物催化剂的制备方法，属固定化酶生物催化剂制备技术领域。本发明以硅基介孔分子筛SBA-15为载体，辣根过氧化物酶为固定对象，吸附法为固定化方法，利用介孔分子筛的属性和SBA-15的孔径与辣根过氧化物酶的分子尺寸相匹配的特性，实现酶在硅基介孔分子筛SBA-15的孔道和外表面的同时固定化。本发明制备的固定化酶生物催化剂具有较好的酶分散性、较高的载酶量和较好的酶活。本发明还可适用于蛋白酶、脂肪酶等多种酶的固定化。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用硅基介孔分子筛SBA-15的固定化酶生物催化剂的制备方法，并着重对固定化过程进行了机理分析，属固定酶生物催化剂制备技术领域。
背景技术
1992年Mobil公司的Kresge和Beck等首次以表面活性剂为模板，合成了新颖的有序介孔氧化硅材料MCM-41(Mobile Composition Material 41)，这是分子筛与多孔物质发展史上的一次飞跃。由于在重油催化和大分子分离等领域的广阔应用前景，介孔分子筛成为人们的研究热点之一，不久即开发出一系列的介孔材料，如SBA系列、MSU系列、CMK系列、HMS、KIT、以及金属和金属氧化物系列等。介孔分子筛是具有广泛应用前景的一类新材料，可用作功能材料、吸附剂、催化剂及其载体，不仅弥补了微孔沸石分子筛的不足，还可以利用有序介孔作为“微反应器”，制备具有特殊光、电、磁等性能的纳米材料，因此在化学工业、能源与环境、生物技术、吸附分离、催化及光、电、磁等众多领域具有重要的应用价值。在生物催化剂制备领域中，固定化酶技术占有重要地位，而酶固定化载体在催化剂制备中又起着重要作用。传统的酶固定化载体主要有以下几类：(1)高岭土、硅胶、皂土、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃等无机化合物，这类载体的缺点是酶与载体之间结合力弱，对pH、盐浓度、温度等条件要求苛刻；(2)戊二醛和双藕联苯胺-2，2’-二磺酸等，用这类载体制备固定化酶，制备过程较困难，且酶不能再生；(3)聚丙烯酰胺类，以聚丙烯酰胺作为包埋剂，该方法制得的固定化酶易漏失，常存在着扩散限制、催化反应受传质阻力影响、不宜催化大分子底物反应等问题。因此，为了提高酶活性、稳定性以及降低催化剂使用成本，采用新的酶固定化载体、发展酶的固定化技术是有意义和迫切需要的。介孔分子筛均一可调的介孔孔径、稳定的骨架结构、易于修饰的内表面、一定壁厚且易于掺杂的无定型骨架，以及高比表面积等属性，使其可用于酶蛋白质的固定化，充当生物催化剂的载体，制得优良的固定化生物酶催化剂。使用介孔分子筛固定化酶的潜在优势在于：(1)介孔分子筛具有的高比表面积，可导致高的酶负载量；(2)介孔分子筛孔道的可控制性，可增强酶的稳定性和活性；(3)介孔分子筛高度有序的孔道结构和均一的表面性质，可预测酶在固定化过程中的行为；(4)固定化酶的操作过程简单和可靠。
发明内容
本发明提供一种固定化酶生物催化剂的制备方法。以硅基介孔分子筛SBA-15为载体，辣根过氧化物酶为固定对象，吸附法为固定化方法，利用介孔分子筛的属性和SBA-15的孔径与辣根过氧化物酶的分子尺寸相匹配的特性，实现酶在硅基介孔分子筛SBA-15的孔道和外表面的同时固定化。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
a.硅基介孔分子筛SBA-15的制备：以聚环氧乙烯醚-聚环氧丙烯醚-聚环氧乙烯醚三嵌段共聚物(P123)为模板剂，以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源。将4重量份聚环氧乙烯醚-聚环氧丙烯醚-聚环氧乙烯醚三嵌段共聚物(P123)溶解于120重量份的2M的盐酸溶液和30重量份的去离子水中，然后加入8.5重量份的正硅酸乙酯(TEOS)，并在35℃下持续搅拌20h。随后将反应物转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在80℃静置条件下反应24h。最后将固体产物收集，水洗，室温干燥，在8h内将温度缓慢升至500℃，并恒温煅烧6h。
b.在硅基介孔分子筛上固定化酶：以SBA-15为载体，辣根过氧化物酶为固定对象，吸附法为固定化方法，实现酶在硅基介孔分子筛SBA-15的孔道和外表面的同时固定化。将步骤a制备的0.2g的硅基介孔分子筛SBA-15载体加入到10～30ml、吸附反应pH为4～12的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌1～2h，使其在溶液中分散均匀；搅拌完毕，将1～15mg的辣根过氧化物酶加入溶液中搅拌，吸附反应时间为1～10h；随后过滤，并用二次水和磷酸盐缓冲溶液轮流反复冲洗分子筛料，最后将得到的载酶分子筛自然干燥，得到固定化酶生物催化剂。
本发明的原理及实验验证：
硅基介孔分子筛SBA-15的孔径在5-30nm内可调，其孔径与大部分的酶分子尺寸相匹配。本发明中采用的辣根过氧化物酶的分子尺寸为
制备的硅基介孔分子筛SBA-15的孔径大于
因此，制备的硅基介孔分子筛SBA-15的孔径与辣根过氧化物酶的分子尺寸相匹配。在实验中发现，用0.2g制备的硅基介孔分子筛SBA-15固定3mg辣根过氧化物酶后，载体的比表面积和孔容分别减少51.6％和29.7％，而用0.2g SBA-15分别固定4mg、6mg和8mg辣根过氧化物酶时，固定化后SBA-15比表面积分别减少55.1％、56.4％和58.1％，孔容分别减少35.2％、36.7％和36.1％。由上述结果可看出，在辣根过氧化物酶的加入量达4mg/0.2g SBA-15时，随着辣根过氧化物酶加入量的增加，载体的比表面积缓慢减少，而孔容则达到一个相对稳定的减少量，比表面积和孔容的减少量都没有显著增加，因此，可认为在采用的固定化条件下，采用4mg辣根过氧化物酶/0.2g SBA-15的固定化量时，在载体SBA-15上的酶负载基本达到饱和，辣根过氧化物酶分子不仅可以固定在硅基介孔分子筛SBA-15的外表面上，还能有相当一部分进入到介孔分子筛的孔道内，这有利于提高酶的稳定性及减少固定化酶在使用过程中的酶漏失，此外，硅基介孔分子筛SBA-15的孔道结构也有利于底物在孔道内的传递，有利于酶与底物之间催化反应，从而使固定化酶具有较高的催化效率，采用硅基介孔分子筛SBA-15固定化辣根过氧化物酶是可行的。
表1固定不同酶量时固定化载体的孔容和比表面积的对比
注：1、SBA-15-x中的x代表0.2g SBA-15所固定化的辣根过氧化物酶的量；
2、比表面积单位为m2/g，孔容积单位为cm3/g。
本发明的酶固定化方法采用了吸附法，这不仅使一部分酶分子固定在介孔分子筛的外表面上，还使相当一部分的酶分子进入到介孔分子筛的孔道内。制得的固定化酶生物催化剂具有良好的酶分散性、较高的载酶量和较高的酶活。另外，固定化酶生物催化剂制备工艺简单和可靠，操作过程方便，而且产品存储稳定性好。
附图说明
图1为本发明固定化酶生物催化剂工艺流程图。
图2为制备的硅基介孔分子筛的XRD图。
图3为制备的硅基介孔分子筛的SEM图。
图4为制备的硅基介孔分子筛的TEM图。
图5为固定化酶生物催化剂的重复使用性能。
图6为负载不同每两的SBA-15生物催化剂的相对酶活和活性回收率。
图7为不同吸附反应时间下载酶SBA-15生物催化剂的相对酶活。
图8为不同吸附反应pH下载酶SBA-15生物催化剂的相对酶活。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1
参见附图1的工艺流程图。首先制备介孔分子筛SBA-15载体。以聚环氧乙烯醚-聚环氧丙烯醚-聚环氧乙烯醚三嵌段共聚物(P123)为模板剂，以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源。先称量2.0g P123于烧杯中，加入15g水和60g 2M的盐酸溶液，在35℃下搅拌至P123完全溶解，然后加入4.25gTEOS，并在35℃下持续搅拌20h。随后将反应物转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在80℃静置条件下反应24h。最后将固体产物收集，水洗，室温干燥，在8h内将温度缓慢升至500℃，并恒温煅烧6h。煅烧后的粉末是带有孔道的SBA-15。制得的SBA-15孔径约为6.7nm，比表面积为686m2/g，比孔容为0.91cm3/g。XRD图谱显示在0.9°处有一很强的衍射峰，对应着SBA-15的(110)和(200)峰，在1.56°和1.8°附近出现两个较小衍射峰，如附图2所示。通过SEM图(附图3)看出，制备的SBA-15为麦穗状的聚集体，聚集体长度在10-20um之间，而聚集体中的每个单体重长度则基本为1um。由附图4的TEM图可以看出，制备的SBA-15具有很好的六方相结构且具有很好的长程有序性。
将步骤a制备的0.2g的硅基介孔分子筛SBA-15载体加入到10～30ml、吸附反应pH为4～12的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌1～2h，使其在溶液中分散均匀；搅拌完毕，将1～15mg的辣根过氧化物酶加入溶液中搅拌，吸附反应时间为1～10h；随后过滤，并用二次水和磷酸盐缓冲溶液轮流反复冲洗分子筛料，最后将得到的载酶分子筛自然干燥，得到固定化酶生物催化剂。
在H2O2存在的条件下，利用辣根过氧化物酶对酚类物质的催化氧化作用，通过水溶液中酚类物质的去除率来间接反应固定化酶生物催化剂的重复实用性。将0.1g制得的硅基介孔分子筛SBA-15固定化酶生物催化剂加入到10ml浓度为10mg/L的含酚水溶液中，H2O2的加入量为80mmol/L，持续搅拌3h。反应完全后，将含酚水溶液过滤，并将已经去除过水中酚的载酶介孔分子筛经二次水反复冲洗，再用于下次使用。通过附图5可以看出，制备的硅基介孔分子筛SBA-15固定化酶生物催化剂具有很好的重复使用性能，在重复使用6次以后，仍具有70％以上的苯酚去除率。
实施例2
本实施例中的步骤a与实施例1的步骤a相同；然后将制备的0.2g的硅基介孔分子筛SBA-15载体加入到15ml、吸附反应pH为8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌1h，使其在溶液中分散均匀。搅拌完毕，分别将1mg、2mg、4mg、6mg、8mg、10mg的辣根过氧化物酶加入溶液中搅拌，吸附反应时间为6h。随后过滤，并用二次水和磷酸盐缓冲溶液轮流反复冲洗分子筛料，最后将得到的载酶分子筛自然干燥，得到固定化酶生物催化剂。由附图5可以看出，在其他条件相同的情况下，随着给酶量的增加，固定化酶的相对活性也随之增高，当每克载体的给酶量为20mg时，固定化酶的相对活性最高，这可能是由于固定化酶达到饱和；另一方面，随着给酶量的增加，未被固定的酶量增多，从而酶的活力回收率下降。
实施例3
本实施例中的步骤a与实施例1的步骤a相同；然后将制备的0.2g的硅基介孔分子筛SBA-15载体加入到15ml、吸附反应pH为8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌1h，使其在溶液中分散均匀。搅拌完毕，将4mg的辣根过氧化物酶加入溶液中搅拌，吸附反应时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h。随后过滤，并用二次水和磷酸盐缓冲溶液轮流反复冲洗分子筛料，最后将得到的载酶分子筛自然干燥，得到固定化酶生物催化剂。由附图6可以看出，固定化酶的相对酶活随着吸附时间的增加而提高，时间为4h时，相对酶活达到最高，继续延长时间会导致相对酶活的下降。
实施例4
本实施例中的步骤a与实施例1的步骤a相同；然后将制备的0.2g的硅基介孔分子筛SBA-15载体加入到15ml、吸附反应pH为6、7、8、9、10的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌1h，使其在溶液中分散均匀。搅拌完毕，将4mg的辣根过氧化物酶加入溶液中搅拌，吸附反应时间为6h。随后过滤，并用二次水和磷酸盐缓冲溶液轮流反复冲洗分子筛料，最后将得到的载酶分子筛自然干燥，得到固定化酶生物催化剂。由附图7可以看出，随着pH的增高，固定化辣根过氧化物酶的相对酶活显著增高，当pH为8的时候，相对酶活最高，吸附效果最好，pH超过8以后，相对酶活下降。
Claims (1)
1.一种硅基介孔分子筛SBA-15固定化酶生物催化剂的制备方法，其特征在于该方法具有如下工艺过程：
a.硅基介孔分子筛SBA-15的制备：将4重量份聚环氧乙烯醚-聚环氧丙烯醚-聚环氧乙烯醚三嵌段共聚物(P123)溶解于120重量份的2M的盐酸溶液和30重量份的去离子水中，然后加入8.5重量份的正硅酸乙酯(TEOS)，并在35℃下持续搅拌20h；随后将反应物转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在80℃静置条件下反应24h；最后将固体产物收集，水洗，室温干燥，在8h内将温度缓慢升至500℃，并恒温煅烧6h，得到硅基介孔分子筛SBA-15；
b.在硅基介孔分子筛上固定化酶：将步骤a制备的0.2g的硅基介孔分子筛SBA-15载体加入到10～30ml、吸附反应pH为6～10的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌1～2h，使其在溶液中分散均匀；搅拌完毕，将1～15mg的辣根过氧化物酶加入溶液中搅拌，吸附反应时间为1～10h；随后过滤，并用二次水和磷酸盐缓冲溶液轮流反复冲洗分子筛料，最后将得到的载酶分子筛自然干燥，得到固定化酶生物催化剂。
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