CN104531558A - 一种用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法 - Google Patents

一种用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法 Download PDF

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CN104531558A CN201410727584.2A CN201410727584A CN104531558A CN 104531558 A CN104531558 A CN 104531558A CN 201410727584 A CN201410727584 A CN 201410727584A CN 104531558 A CN104531558 A CN 104531558A
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    • A61L9/01—Deodorant compositions

Abstract

本发明涉及用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法，可有效解决用于蛋鸡鸡舍空气净化微生物菌剂的制备，以满足冬季蛋鸡养殖的需要问题，方法是，分别制备沼泽红假单胞菌AS1.2180发酵液、枯草芽孢杆菌AS1.108发酵液和德氏乳杆菌AS1.2624发酵液，将重量计为沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液＝65～75︰18～22︰9～11混配在一起，搅拌均匀即成，本发明方法简单，菌株易购，安全性高，绿色环保，易操作，用该微生物菌剂处理冬季蛋鸡养殖鸡舍环境，在不降低正常鸡舍室温的前提下可有效净化蛋鸡鸡舍空气，去除效率高，处理成本低廉，运行维护容易，可避免二次污染。

Description

一种用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法。
背景技术
一般情况下，蛋鸡养殖多为封闭式饲养，蛋鸡养殖既要保证鸡舍内的温度，蛋鸡养殖较适宜温度为21℃～25℃，过高或过低都会影响蛋壳质量，出现耗料多、产蛋少；还要保证鸡舍内空气新鲜，鸡舍内通风不良，易受氨气、硫化氢等有害气体的侵袭，直接影响蛋鸡的健康，容易引发各种疾病。温度控制是蛋鸡养殖的空气环境控制核心，通风管理是蛋鸡养殖空气环境控制的关键，通风和保温的平衡及空气质量直接影响鸡群的健康和生产力水平，蛋鸡养殖要解决好温度与空气质量问题的矛盾，注意正确处理通风换气与保暖的关系，特别是冬季有一个不易处理的问题是鸡舍内有害气体的排除问题，因为通风过大不利于棚内保温，天气寒冷，外界气温较低，大多数养殖户注意到防寒保暖的重要性，然而在保暖的同时，往往忽视了通风换气，致使蛋鸡鸡舍内有害气体如氨气、硫化氢等浓度升高，严重时导致蛋鸡中毒或引发其它疾病；还有的养殖户注意到了通风换气，但冷空气进入鸡舍后降低了鸡舍内温度，容易引发一些疾病，通风处理操作不当如冷风直接吹到鸡群也容易使蛋鸡患呼吸道疾病。冬季在不降低正常鸡舍室温的前提下，要想蛋鸡鸡舍空气新鲜，避免蛋鸡呼吸道病的发生，减少蛋鸡鸡舍内有害气体的含量成为一个寒冷季节蛋鸡养殖的难题。
氨气、硫化氢等为蛋鸡养殖鸡舍中主要有害气体，主要来自蛋鸡粪便、饲料残渣和垫料等有机物腐败、细菌分解等，处理方法主要有物理法（物理吸附法、稀释扩散法、遮蔽法）、化学法（氧化法、化学吸收法、化学吸附法）、生物法等三种，化学法和物理法处理费用高，成本高，设备要求高，不易操作，处理中存在二次污染物，利用微生物降解蛋鸡鸡舍恶臭物质而使鸡舍气体脱臭、净化蛋鸡鸡舍空气的方法，去除效率高，处理成本低廉，运行维护容易，可避免二次污染。但至今未见有如何制备用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法，可有效解决用于蛋鸡鸡舍空气净化微生物菌剂的制备，以满足冬季蛋鸡养殖的需要问题。
本发明解决的技术方案是，由方法由以下步骤实现：
A、制备沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）AS1.2180发酵液，方法是：
（1）、制备沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基：将磷酸氢二钾（K2HP04）0.9～1.1g、氯化钙（CaCl2）0.08～0.12g、碳酸氢钠（NaHC03）2.8～3.2g、乙酸钠（CH3COONa）0.9～1.1g、氯化镁（MgCl2）0.4～0.6g、氯化铵（NH4Cl）0.9～1.1g、氯化钠（NaCl）0.9～1.1g、微量元素溶液0.9～1.1mL、维生素溶液0.9～1.1mL、琥珀酸钠0.9～1.1g、酵母膏0.4～0.6g、蛋白胨0.4～0.6g、琼脂14～16g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基；
所述的微量元素溶液是由四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）1.8g、六水合氯化钴（CoCl2·6H2O）0.25g、六水合二氯化镍（NiCl2·6H2O）0.01g、二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）0.01g、四水合氯化锰（MnCl2·4H2O）0.70g、氯化锌（ZnCl2）0.1g、硼酸（H3BO3）0.5g、二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.03g、五水亚硒酸钠（Na2SeO3·5H2O）0.01g和蒸馏水1000mL混合均匀制成；
所述的维生素溶液是由生物素0.1g、烟酸0.35g、盐酸硫胺素0.3g、对氨基苯甲酸0.2g、盐酸吡多胺0.1g、泛酸钙0.1g、维生素B12 0.05g和蒸馏水1000mL混合均匀制成；
（2）制备沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基：将白玉米面1.8～2.2g、甘油0.9～1.1g、酵母膏0.9～1.1g、磷酸氢二钾0.18～0.22g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基；
（3）制备沼泽红假单胞菌发酵培养基：将白玉米面1.0～3.0g、酵母膏0.5～1.5g和蒸馏水1000mL混合在一起，搅拌均匀，成沼泽红假单胞菌发酵培养基；
（4）沼泽红假单胞菌斜面培养：将沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基中接种沼泽红假单胞菌，接种量为培养基重量的3～5‰，28～30℃，照射，厌氧静置培养5～7d，得到包括斜面保藏培养基的斜面菌种；
（5）沼泽红假单胞菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面菌种接种于沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基重量的3～5%，28～30℃在转动下培养60～72h，得到扩大培养的种子，革兰氏染色阴性，镜检无杂菌；
（6）沼泽红假单胞菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于沼泽红假单胞菌发酵培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌发酵培养基重量的6～8%，置入发酵罐中，罐压0.03～0.05Mpa，以1.5NL/min的流量通入无菌空气，28～30℃在转动下发酵72～96h，质检沼泽红假单胞菌菌数≥5.0×108个/mL，镜检无杂菌，终止发酵，即得沼泽红假单胞菌发酵液；
B、制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AS1.108发酵液：
（1）制备枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏2.5～3.5g、氯化钠4～6g、琼脂14～16g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基；
（2）制备枯草芽孢杆菌种子培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏2.5～3.5g、氯化钠4～6g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，成枯草芽孢杆菌种子培养基；
（3）制备枯草芽孢杆菌发酵培养基：将蛋白胨1.0～3.0g、葡萄糖2.0～4.0g、豆粕粉5.0～10.0g、K2HPO4 0.6～0.8g、MgSO4·7H2O 0.25～0.35g、CaCO3 0.09～0.11g、植物油1.3～1.7 mL和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成枯草芽孢杆菌发酵培养基；
（4）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基中接种枯草芽孢杆菌，接种量为培养基重量的3～5‰，30～32℃，静置培养24～36h，得到包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种；
（5）枯草芽孢杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种接种于枯草芽孢杆菌种子培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌种子培养基重量的3～5%，30～32℃在转动下培养18～24h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）枯草芽孢杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌发酵培养基重量的3～5%，置入发酵罐中，罐压0.03～0.05Mpa，以12.0NL/min的流量通入无菌空气，30～32℃在转动下发酵24～32h，质检枯草芽孢杆菌菌数≥3.0×109个/mL，芽孢形成率≥85%，镜检无杂菌，终止发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；
C、制备德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）AS1.2624发酵液：
（1）制备德氏乳杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏9～11g、酵母膏4.5～5.5g、乙酸钠4.5～5.5g、柠檬酸二胺1.8～2.2g、磷酸氢二钾1.8～2.2g、乙酸钠4.5～5.5g、葡萄糖4.5～5.5g、吐温-80 0.9～1.1g、MgSO4·7H2O 0.18～0.22g、MnSO4·H2O 0.04～0.06g、CaCO3 18～22g、琼脂14～16g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2；
（2）制备德氏乳杆菌种子培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏9～11g、酵母膏4.5～5.5g、乙酸钠4.5～5.5g、柠檬酸二胺1.8～2.2g、磷酸氢二钾1.8～2.2g、乙酸钠4.5～5.5g、葡萄糖4.5～5.5g、吐温-80  0.9～1.1g、MgSO4·7H2O  0.18～0.22g、MnSO4·H2O 0.04～0.06g、CaCO3 18～22g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2；
（3）制备德氏乳杆菌发酵培养基：将酵母膏3.0～5.0g、葡萄糖10.0～30.0g、蛋白胨3.0～5.0g、磷酸氢二钾0.18～0.22g、MgSO4·7H2O 0.04～0.06g、乙酸钠4.5～5.5 g、CaCO3  20～25g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2；
（4）德氏乳杆菌斜面培养：将德氏乳杆菌斜面保藏培养基中接种德氏乳杆菌，接种量为培养基重量的3～5‰，35～37℃，静置培养36～40h，得到包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种；
（5）德氏乳杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种接种于德氏乳杆菌种子培养基中，接种量为德氏乳杆菌种子培养基重量的3～5%，35～37℃在转动下培养20～24h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）德氏乳杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于德氏乳杆菌发酵培养基中，接种量为德氏乳杆菌发酵培养基重量的3～5%，35～37℃在转动下厌氧发酵22～25h，质检德氏乳杆菌菌数≥1.0×109个/mL，镜检无杂菌，得德氏乳杆菌发酵液；
D、混配：
将沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和德氏乳杆菌发酵液混配在一起，搅拌均匀成冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂，其配比经重量计为沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液＝65～75︰18～22︰9～11。
所述的沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、德氏乳杆菌均为现有技术，均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。
本发明方法简单，菌株易购，安全性高，绿色环保，易操作，用该微生物菌剂处理冬季蛋鸡养殖鸡舍环境，在不降低正常鸡舍室温的前提下可有效净化蛋鸡鸡舍空气，去除效率高，处理成本低廉，运行维护容易，可避免二次污染，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
A、制备沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）AS1.2180发酵液，方法是：
（1）、制备沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基：将磷酸氢二钾1.0g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠3.0g、乙酸钠1.0g、氯化镁0.5g、氯化铵1.0g、氯化钠1.0g、微量元素溶液1.0mL、维生素溶液1.0mL、琥珀酸钠1.0g、酵母膏0.5g、蛋白胨0.5g、琼脂15g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基；
（2）制备沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基：将白玉米面2.0g、甘油1.0g、酵母膏1.0g、磷酸氢二钾0.2g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基；
（3）制备沼泽红假单胞菌发酵培养基：将白玉米面2g、酵母膏1g和蒸馏水1000mL混合在一起，搅拌均匀，成沼泽红假单胞菌发酵培养基；
（4）沼泽红假单胞菌斜面培养：将沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基中接种沼泽红假单胞菌，接种量为培养基重量的4‰，29℃，在灯距15～25cm的40W白炽灯照射下，厌氧静置培养6d，得到包括斜面保藏培养基的斜面菌种；
（5）沼泽红假单胞菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面菌种接种于沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基重量的4%，置于三角瓶内，在转速80 r/min的在转动下，29℃培养6h，得到扩大培养的种子，革兰氏染色阴性，镜检无杂菌；
（6）沼泽红假单胞菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于沼泽红假单胞菌发酵培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌发酵培养基重量的7%，置入发酵罐中，罐压0.04Mpa，以1.5NL/min的流量通入无菌空气，29℃在转动下发酵86h，搅拌转速100 r/min，质检沼泽红假单胞菌菌数≥5.0×108个/mL，镜检无杂菌，终止发酵，即得沼泽红假单胞菌发酵液；
B、制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AS1.108发酵液：
（1）制备枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基；
（2）制备枯草芽孢杆菌种子培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，成枯草芽孢杆菌种子培养基；
（3）制备枯草芽孢杆菌发酵培养基：将蛋白胨2g、葡萄糖3g、豆粕粉7.5g、磷酸氢二钾0.7 g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCO3 0.1g、植物油1.5 mL和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成枯草芽孢杆菌发酵培养基；
（4）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基中接种枯草芽孢杆菌，接种量为培养基重量的4‰，31℃，静置培养30h，得到包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种；
（5）枯草芽孢杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种接种于枯草芽孢杆菌种子培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌种子培养基重量的4%，置于三角瓶内，在转速220 r/min下，31℃转动培养21h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）枯草芽孢杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌发酵培养基重量的4%，置入发酵罐中，罐压0.04Mpa，以12.0NL/min的流量通入无菌空气，31℃在转速500 r/min的转动下发酵28h，质检枯草芽孢杆菌菌数≥3.0×109个/mL，芽孢形成率≥85%，镜检无杂菌，终止发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；
C、制备德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）AS1.2624发酵液：
（1）制备德氏乳杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、葡萄糖5.0g、吐温-80 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、CaCO3 20.0g、琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7；
（2）制备德氏乳杆菌种子培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、K2HPO4 2.0g、乙酸钠5.0g、葡萄糖5.0g、吐温-80 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、CaCO3 20.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7；
（3）制备德氏乳杆菌发酵培养基：将酵母膏4g、葡萄糖20g、蛋白胨4g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.05g、乙酸钠5.0g、CaCO3 22.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7；
（4）德氏乳杆菌斜面培养：将德氏乳杆菌斜面保藏培养基中接种德氏乳杆菌，接种量为培养基重量的4‰，36℃，静置培养38h，得到包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种；
（5）德氏乳杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种接种于德氏乳杆菌种子培养基中，接种量为德氏乳杆菌种子培养基重量的4%，置于三角瓶内，在转速150 r/min，36℃转动培养22h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）德氏乳杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于德氏乳杆菌发酵培养基中，接种量为德氏乳杆菌发酵培养基重量的4%，36℃在搅拌转速300 r/min的转动下厌氧发酵23.5h，质检德氏乳杆菌菌数≥1.0×109个/mL，镜检无杂菌，得德氏乳杆菌发酵液；
D、混配：
将沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和德氏乳杆菌发酵液混配在一起，搅拌均匀成冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂，其配比经重量计为沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液＝70︰20︰10。
本发明所制备的冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂还可以沸石粉为载体，吸附冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂，40～50℃制干，成固体微生物菌剂。
所述的沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液的重量比在具体实施中，还可为68︰21︰11或73︰18︰9或71︰19.5︰9.5。
由上述可以看出，本发明制备方法简单，成本低，效果好，用该微生物菌剂处理冬季蛋鸡养殖鸡舍环境，在不降低正常鸡舍室温的前提下可有效净化蛋鸡鸡舍空气，去除效率高，处理成本低廉，运行维护容易，可避免二次污染，安全性高，绿色环保，且操作简单，培养方便，并经测试和实际使用，取得了非常满意的有益技术效果，有关实验资料如下：
本发明采用以下分析方法对培养微生物发酵液的菌数进行测定：
A.采用双层平板计数方法对沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）AS1.2180的菌数含量进行测定：
吸取沼泽红假单胞菌发酵液1.0mL，无菌条件下用无菌水采用常规方法将其稀释至10-6、10-7、10-8，分别吸取0.1mL不同稀释度的沼泽红假单胞菌菌液均匀涂布于已倒入培养皿凝固后的底层固体平板培养基上，置50℃下0.5h烘去水分后，加入冷却至50℃的上层固体平板培养基15mL，凝固后置28～30℃, 40瓦白炽灯照射，距灯泡12cm处，光照下培养5d，选取菌落数在30～300的培养皿计算测定菌落数，菌落数≥5.0×108个/mL，无杂菌；
所述的底层固体平板培养基是：NH4Cl 1.0 g、K2HP04 0.2 g、CH3COONa 3.0 g、NaHC03 1.0 g、酵母膏0.2 g、NaCl 1.0 g、MgCl2 0.20 g、 T.M储液1.5mL，8.0g琼脂和蒸馏水1000 mL混匀制成，调pH 6.8；
所述的上层固体平板培养基是：NH4Cl 1.0 g、K2HP04 0.2 g、CH3COONa 3.0 g、NaHC03 1.0 g、酵母膏0.2 g、NaCl 1.0 g、MgCl2 0.20 g、 T.M储液1.5mL，10.0g琼脂，蒸馏水1000 mL，pH 6.8；其中T.M储液：FeCl35.0 mg、CuSO4·5H2O 0.05 mg、H3BO31.0 mg、MnCl2·5H2O 0.05 mg、ZnSO4·7H2O 1.0 mg、Co(NO3) 2·6H2O 0.5 mg和蒸馏水1000 mL混匀制成。
B.采用单层平板计数法对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AS1.108菌数含量进行测定：
吸取枯草芽孢杆菌发酵液1.0mL，无菌条件下用无菌水采用常规方法将其稀释至10-7、10-8、10-9，分别吸取0.1mL不同稀释度的枯草芽孢杆菌菌液均匀涂布于已倒入培养皿凝固后的固体平板培养基上，温度为30～32℃下培养24～36h，选取菌落数在30～300的培养皿计算测定菌落数，菌落数≥3.0×109个/mL，无杂菌；
所述的固体平板培养基是：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL混匀制成，调pH7.0。
C. 采用单层平板计数法对德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）AS1.2624菌数含量进行测定：
吸取德氏乳杆菌发酵液1.0mL，无菌条件下用无菌水采用常规方法将其稀释至10-7、10-8、10-9，分别吸取0.1mL不同稀释度的德氏乳杆菌菌液均匀涂布于已倒入培养皿凝固后的固体平板培养基上，温度为35～37℃下培养24～36h，选取菌落数在30～300的培养皿计算测定菌落数，菌落数≥1.0×109个/mL，无杂菌；
所述的固体平板培养基是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，葡萄糖5.0g，吐温80 1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO3 20.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，调pH6.8。
恶臭物质往往有许多物质组成的复杂复合体，主要由氨气、硫化氢等，通过人的嗅觉器官对恶臭气体的反应进行了恶臭的平价和测定工作，恶臭的测定采用三点比较式臭袋法，准备三个无臭塑料袋，一个装入收集经微生物菌剂处理的蛋鸡鸡舍内的空气，一个装入用无臭空气稀释至50倍的经微生物菌剂处理的蛋鸡鸡舍内的空气，一个装入用无臭空气稀释至70倍的经微生物菌剂处理的蛋鸡鸡舍内的空气，组织6名成年嗅觉没有问题的臭气鉴别员分别进行了嗅觉恶臭的平价，当稀释倍数至70倍时，6人嗅觉器官已经不能辨别、感觉不到恶臭气味，表明净化空气效果非常好，并经实地应用，得到了充分证明。
如将由沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和德氏乳杆菌发酵液按规定比例，混合后制成的用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂在郑州某蛋鸡养殖厂试用，蛋鸡养殖采用密闭式鸡舍，水泥地面墙面，保温设施、光照设施齐全，三列三层蛋鸡笼阶梯式养殖，四个过道，养殖成年罗曼蛋鸡5000余只，自动饮水，机械喂料，清粪，将本发明的固体微生物菌剂铺撒在鸡笼下、粪沟里大约0.3cm薄薄的一层，将本发明的液体微生物菌剂喷洒在过道地面、墙面、承粪板、笼架上，微生物菌剂快速繁殖占领优势并分解蛋鸡粪便、饲料残渣等有机物等，为蛋鸡养殖营造一个良好的生长环境，氨气、硫化氢等为蛋鸡养殖鸡舍中主要有害气体，经应用实验证明：采用纳氏试剂比色法检测鸡舍内的氨气浓度不高于15mg/m3，采用碘量法测定鸡舍内的硫化氢浓度不超过10 mg/m3，而没有进行微生物菌剂处理的对照组经检测，鸡舍内的氨气浓度高于15mg/m3，硫化氢浓度超过10mg/m3，表明本发明微生物菌剂可有效净化蛋鸡鸡舍空气、使鸡舍气体脱臭，达到畜禽场空气环境质量要求。并经多个养殖场（9个）试用，均取得了相同或相近似的结果。
总之，本发明方法简单，原料易购，易操作，产品应用效果好，有效用于对冬季蛋鸡养殖鸡舍空气的净化处理，绿色环保，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.一种用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备沼泽红假单胞菌AS1.2180发酵液，方法是：
（1）、制备沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基：将磷酸氢二钾0.9～1.1g、氯化钙0.08～0.12g、碳酸氢钠2.8～3.2g、乙酸钠0.9～1.1g、氯化镁0.4～0.6g、氯化铵0.9～1.1g、氯化钠0.9～1.1g、微量元素溶液0.9～1.1mL、维生素溶液0.9～1.1mL、琥珀酸钠0.9～1.1g、酵母膏0.4～0.6g、蛋白胨0.4～0.6g、琼脂14～16g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基；
所述的微量元素溶液是由四水合氯化亚铁1.8g、六水合氯化钴0.25g、六水合二氯化镍0.01g、二水合氯化铜0.01g、四水合氯化锰0.70g、氯化锌0.1g、硼酸0.5g、二水合钼酸钠0.03g、五水亚硒酸钠0.01g和蒸馏水1000mL混合均匀制成；
所述的维生素溶液是由生物素0.1g、烟酸0.35g、盐酸硫胺素0.3g、对氨基苯甲酸0.2g、盐酸吡多胺0.1g、泛酸钙0.1g、维生素B12 0.05g和蒸馏水1000mL混合均匀制成；
（2）制备沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基：将白玉米面1.8～2.2g、甘油0.9～1.1g、酵母膏0.9～1.1g、磷酸氢二钾0.18～0.22g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基；
（3）制备沼泽红假单胞菌发酵培养基：将白玉米面1.0～3.0g、酵母膏0.5～1.5g和蒸馏水1000mL混合在一起，搅拌均匀，成沼泽红假单胞菌发酵培养基；
（4）沼泽红假单胞菌斜面培养：将沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基中接种沼泽红假单胞菌，接种量为培养基重量的3～5‰，28～30℃，照射，厌氧静置培养5～7d，得到包括斜面保藏培养基的斜面菌种；
（5）沼泽红假单胞菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面菌种接种于沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基重量的3～5%，28～30℃在转动下培养60～72h，得到扩大培养的种子，革兰氏染色阴性，镜检无杂菌；
（6）沼泽红假单胞菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于沼泽红假单胞菌发酵培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌发酵培养基重量的6～8%，置入发酵罐中，罐压0.03～0.05Mpa，以1.5NL/min的流量通入无菌空气，28～30℃在转动下发酵72～96h，质检沼泽红假单胞菌菌数≥5.0×108个/mL，镜检无杂菌，终止发酵，即得沼泽红假单胞菌发酵液；
B、制备枯草芽孢杆菌AS1.108发酵液：
（1）制备枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏2.5～3.5g、氯化钠4～6g、琼脂14～16g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基；
（2）制备枯草芽孢杆菌种子培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏2.5～3.5g、氯化钠4～6g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，成枯草芽孢杆菌种子培养基；
（3）制备枯草芽孢杆菌发酵培养基：将蛋白胨1.0～3.0g、葡萄糖2.0～4.0g、豆粕粉5.0～10.0g、K2HPO4 0.6～0.8g、MgSO4·7H2O 0.25～0.35g、CaCO3 0.09～0.11g、植物油1.3～1.7 mL和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2，成枯草芽孢杆菌发酵培养基；
（4）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基中接种枯草芽孢杆菌，接种量为培养基重量的3～5‰，30～32℃，静置培养24～36h，得到包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种；
（5）枯草芽孢杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种接种于枯草芽孢杆菌种子培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌种子培养基重量的3～5%，30～32℃在转动下培养18～24h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）枯草芽孢杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌发酵培养基重量的3～5%，置入发酵罐中，罐压0.03～0.05Mpa，以12.0NL/min的流量通入无菌空气，30～32℃在转动下发酵24～32h，质检枯草芽孢杆菌菌数≥3.0×109个/mL，芽孢形成率≥85%，镜检无杂菌，终止发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；
C、制备德氏乳杆菌AS1.2624发酵液：
（1）制备德氏乳杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏9～11g、酵母膏4.5～5.5g、乙酸钠4.5～5.5g、柠檬酸二胺1.8～2.2g、磷酸氢二钾1.8～2.2g、乙酸钠4.5～5.5g、葡萄糖4.5～5.5g、吐温-80 0.9～1.1g、MgSO4·7H2O 0.18～0.22g、MnSO4·H2O 0.04～0.06g、CaCO3 18～22g、琼脂14～16g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2；
（2）制备德氏乳杆菌种子培养基：将蛋白胨9～11g、牛肉膏9～11g、酵母膏4.5～5.5g、乙酸钠4.5～5.5g、柠檬酸二胺1.8～2.2g、磷酸氢二钾1.8～2.2g、乙酸钠4.5～5.5g、葡萄糖4.5～5.5g、吐温-80  0.9～1.1g、MgSO4·7H2O  0.18～0.22g、MnSO4·H2O 0.04～0.06g、CaCO3 18～22g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2；
（3）制备德氏乳杆菌发酵培养基：将酵母膏3.0～5.0g、葡萄糖10.0～30.0g、蛋白胨3.0～5.0g、磷酸氢二钾0.18～0.22g、MgSO4·7H2O 0.04～0.06g、乙酸钠4.5～5.5 g、CaCO3  20～25g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为6.8～7.2；
（4）德氏乳杆菌斜面培养：将德氏乳杆菌斜面保藏培养基中接种德氏乳杆菌，接种量为培养基重量的3～5‰，35～37℃，静置培养36～40h，得到包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种；
（5）德氏乳杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种接种于德氏乳杆菌种子培养基中，接种量为德氏乳杆菌种子培养基重量的3～5%，35～37℃在转动下培养20～24h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）德氏乳杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于德氏乳杆菌发酵培养基中，接种量为德氏乳杆菌发酵培养基重量的3～5%，35～37℃在转动下厌氧发酵22～25h，质检德氏乳杆菌菌数≥1.0×109个/mL，镜检无杂菌，得德氏乳杆菌发酵液；
D、混配：
将沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和德氏乳杆菌发酵液混配在一起，搅拌均匀成冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂，其配比经重量计为沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液＝65～75︰18～22︰9～11。
2.根据权利要求1所述的用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述的冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂以沸石粉为载体，吸附冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂，40～50℃制干，成固体微生物菌剂。
3.根据权利要求1所述的用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备沼泽红假单胞菌AS1.2180发酵液，方法是：
（1）、制备沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基：将磷酸氢二钾1.0g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠3.0g、乙酸钠1.0g、氯化镁0.5g、氯化铵1.0g、氯化钠1.0g、微量元素溶液1.0mL、维生素溶液1.0mL、琥珀酸钠1.0g、酵母膏0.5g、蛋白胨0.5g、琼脂15g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基；
（2）制备沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基：将白玉米面2.0g、甘油1.0g、酵母膏1.0g、磷酸氢二钾0.2g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基；
（3）制备沼泽红假单胞菌发酵培养基：将白玉米面2g、酵母膏1g和蒸馏水1000mL混合在一起，搅拌均匀，成沼泽红假单胞菌发酵培养基；
（4）沼泽红假单胞菌斜面培养：将沼泽红假单胞菌斜面保藏培养基中接种沼泽红假单胞菌，接种量为培养基重量的4‰，29℃，在灯距15～25cm的40W白炽灯照射下，厌氧静置培养6d，得到包括斜面保藏培养基的斜面菌种；
（5）沼泽红假单胞菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面菌种接种于沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌繁殖种子培养基重量的4%，置于三角瓶内，在转速80 r/min的在转动下，29℃培养6h，得到扩大培养的种子，革兰氏染色阴性，镜检无杂菌；
（6）沼泽红假单胞菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于沼泽红假单胞菌发酵培养基中，接种量为沼泽红假单胞菌发酵培养基重量的7%，置入发酵罐中，罐压0.04Mpa，以1.5NL/min的流量通入无菌空气，29℃在转动下发酵86h，搅拌转速100 r/min，质检沼泽红假单胞菌菌数≥5.0×108个/mL，镜检无杂菌，终止发酵，即得沼泽红假单胞菌发酵液；
B、制备枯草芽孢杆菌AS1.108发酵液：
（1）制备枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基；
（2）制备枯草芽孢杆菌种子培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，成枯草芽孢杆菌种子培养基；
（3）制备枯草芽孢杆菌发酵培养基：将蛋白胨2g、葡萄糖3g、豆粕粉7.5g、磷酸氢二钾0.7 g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCO3 0.1g、植物油1.5 mL和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7，成枯草芽孢杆菌发酵培养基；
（4）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌斜面保藏培养基中接种枯草芽孢杆菌，接种量为培养基重量的4‰，31℃，静置培养30h，得到包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种；
（5）枯草芽孢杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面枯草芽孢杆菌种接种于枯草芽孢杆菌种子培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌种子培养基重量的4%，置于三角瓶内，在转速220 r/min下，31℃转动培养21h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）枯草芽孢杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌发酵培养基重量的4%，置入发酵罐中，罐压0.04Mpa，以12.0NL/min的流量通入无菌空气，31℃在转速500 r/min的转动下发酵28h，质检枯草芽孢杆菌菌数≥3.0×109个/mL，芽孢形成率≥85%，镜检无杂菌，终止发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；
C、制备德氏乳杆菌AS1.2624发酵液：
（1）制备德氏乳杆菌斜面保藏培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、葡萄糖5.0g、吐温-80 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、CaCO3 20.0g、琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7；
（2）制备德氏乳杆菌种子培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、K2HPO4 2.0g、乙酸钠5.0g、葡萄糖5.0g、吐温-80 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、CaCO3 20.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7；
（3）制备德氏乳杆菌发酵培养基：将酵母膏4g、葡萄糖20g、蛋白胨4g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.05g、乙酸钠5.0g、CaCO3 22.0g和蒸馏水1000mL，混合在一起，搅拌均匀，用盐酸或氢氧化钠调pH值为7；
（4）德氏乳杆菌斜面培养：将德氏乳杆菌斜面保藏培养基中接种德氏乳杆菌，接种量为培养基重量的4‰，36℃，静置培养38h，得到包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种；
（5）德氏乳杆菌扩大培养：将包括斜面保藏培养基的斜面德氏乳杆菌种接种于德氏乳杆菌种子培养基中，接种量为德氏乳杆菌种子培养基重量的4%，置于三角瓶内，在转速150 r/min，36℃转动培养22h，得到扩大培养的种子，镜检无杂菌；
（6）德氏乳杆菌发酵培养：将得到的扩大培养的种子接种于德氏乳杆菌发酵培养基中，接种量为德氏乳杆菌发酵培养基重量的4%，36℃在搅拌转速300 r/min的转动下厌氧发酵23.5h，质检德氏乳杆菌菌数≥1.0×109个/mL，镜检无杂菌，得德氏乳杆菌发酵液；
D、混配：
将沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和德氏乳杆菌发酵液混配在一起，搅拌均匀成冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物液体菌剂，其配比经重量计为沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液＝70︰20︰10。
4.根据权利要求1所述的用于冬季蛋鸡养殖鸡舍空气净化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述的沼泽红假单胞菌发酵液︰枯草芽孢杆菌发酵液︰德氏乳杆菌发酵液的重量比为68︰21︰11或73︰18︰9或71︰19.5︰9.5。
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