CN104523745A - 含有多聚-γ-谷氨酸的防病毒感染组合物 - Google Patents

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CN104523745A CN201410657737.0A CN201410657737A CN104523745A CN 104523745 A CN104523745 A CN 104523745A CN 201410657737 A CN201410657737 A CN 201410657737A CN 104523745 A CN104523745 A CN 104523745A
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Abstract

本发明涉及抑制或预防病毒感染的药物组合物，其包括有效剂量的多聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)，更具体地说，本发明涉及能够抑制病毒感染并预防病毒性疾病的药物组合物、功能性食品和饲料添加剂，其包括对诸如诱导呼吸感染或者全身感染的流感病毒等病毒具有抑制感染效果的多聚-γ-谷氨酸作为有效成分。根据本发明的含有多聚-γ-谷氨酸作为有效成分的组合物用作动物饲料添加剂或者预防流感病毒感染和各种病毒性疾病的治疗剂以及药物组合物和促进人类健康的功能性食品是有效的。

Description

含有多聚-γ-谷氨酸的防病毒感染组合物
本申请是中国专利申请200780101513.X的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种抑制或预防病毒感染的药物组合物，其包括有效剂量的多聚-γ-谷氨酸，更具体地说，本发明涉及能够抑制病毒感染并预防病毒性疾病的药物组合物、功能性食品和饲料添加剂，其包括对诸如诱导呼吸感染或者全身感染的流感病毒等病毒具有抑制感染效果的多聚-γ-谷氨酸作为有效成分。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)并具有8个RNA片段，PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS。其基本上由具有脂双层结构的病毒包膜和由外部糖蛋白(external glycoprotein)或者与核蛋白结合的RNA围绕的内部核衣壳(interior nucleocapsid)构成。病毒包膜的内层主要由基质蛋白(matrix protein)构成，其外层由绝大多数来自于宿主的脂物质组成。在这些物质中，构成外壳蛋白的两种蛋白，即红细胞凝集素(hemagglutinin，此后称为HA)和唾液酸苷酶(neuraminidase，此后称为NA)在诱导免疫抗体方面是主要的免疫原，并且它们的特征在于通过抗原性转变和抗原性漂移(antigenic shift and drift)过程变换。由于流感病毒的这种变换使病毒能够避免针对同一亚型的其他流感病毒的免疫系统，一般说来，由流感病毒诱导的免疫性仅仅持续很短的时间段，因此每次应当针对预测的流行病病毒诱导免疫性。流感分为A、B和C三组。
流感病毒诱导了严重的呼吸疾病重感冒，其症状在1-5天的潜伏期之后显示。受到感染的人在开始的时候不显示症状，但后来，它们显示诸如发烧、发冷、头疼、食欲减退等类似症状。在一些病例中，流感病毒引起可导致死亡的病毒性肺炎、细菌性肺炎等。在过去的250年间，至少出现10次流感流行病，由A型流感病毒引起的流感大流行以2-3年的间隔出现。由于流感病毒(flu，流感病毒)是呼吸系统感染病毒，其具有高度传染性具有很高比例的无症状感染，因此许多人一度(at one time)被感染。其在5-9岁的儿童中和55岁以上的老人中频繁发生，通常在秋季和春季之间爆发最多。由于难以控制流感病毒感染，并且大多数流感病毒感染式无症状感染，不需要对患者进行隔离。作为与各种疫苗混合的失活疫苗的流感疫苗具有一些副作用并且仅仅持续3-6个月，因此对流感病毒高度易感的儿童和老人应当每年都接种针对流感的疫苗。
多聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)是由微生物产生的粘液聚合物。特别是，PGA由分离自Chungkookjang(使用稻草制备的韩国传统发酵大豆食品)、Natto(日本传统发酵大豆食品)、Kinema(在Nepal制备的发酵大豆食品，)等的芽孢杆菌菌株(genus Bacillus strain)产生。由芽孢杆菌属菌株产生的γ-PGA是可食用的水溶性带阴离子的可生物降解聚合物，其可被用作保湿剂、保湿液和化妆品的原材料。近来，关于γ-PGA在非降解聚合物的材料和通过酯化的耐热塑料替代材料以及生产水溶性纤维和膜方面用途的研究在发达国家活跃地进行。
同时，本发明的发明人获得了有关使用嗜盐纳豆菌(halophilic Bacillussubtilis var)生产γ-PGA的方法的专利chungkookjang生产高分子量的γ-PGA(韩国专利注册号：500,796)。而且，他们获得了涉及含有γ-PGA的抗癌组合物、免疫佐剂和免疫增强剂的专利(韩国专利注册号：496,606；517,114和475,406)。
因此，本发明的发明人已经付出了极大的努力开发食品添加剂、功能性食品和药物组合物，它们没有副作用，对人体无害，并对诸如诱导呼吸感染或全身感染的流感病毒等病毒具有的抑制感染效果，结果发现，当将γ-PGA给药的家畜暴露于病毒感染时病毒感染可被抑制，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供能够抑制病毒感染的药物组合物、功能性食品和饲料添加剂以预防疾病，其含有对诸如诱导呼吸感染或者全身感染的流感病毒等病毒具有抑制感染效果的多聚-γ-谷氨酸作为有效成分。
为了实现上述目的，本发明提供了抑制病毒感染或者预防病毒性疾病的药物组合物，其包括有效剂量的多聚-γ-谷氨酸。
另外，本发明提供了抑制病毒感染或预防病毒性疾病的功能性食品，其包括有效剂量的多聚-γ-谷氨酸。
而且，本发明提供了抑制病毒感染或预防病毒性疾病的饲料添加剂，其包括有效剂量的多聚-γ-谷氨酸。
另外，本发明提供了多聚-γ-谷氨酸在抑制由H1N1流感病毒引起的病毒感染或预防由H1N1流感病毒引起的病毒性疾病的药物组合物中的应用，其中所述多聚-γ-谷氨酸的分子量为3,000至15,000kDa。
而且，所述组合物为使用乙醇将多聚-γ-谷氨酸稀释在其中的分散剂。
另外，本发明提供了多聚-γ-谷氨酸在抑制由H1N1流感病毒引起的病毒感染或预防由H1N1流感病毒引起的病毒性疾病的功能性食品中的应用，其中所述多聚-γ-谷氨酸的分子量为3,000至15,000kDa。
另外，本发明提供了多聚-γ-谷氨酸在抑制由H1N1流感病毒引起的病毒感染或预防由H1N1流感病毒引起的病毒性疾病的饲料添加剂中的应用，其中所述多聚-γ-谷氨酸的分子量为3,000至15,000kDa。
通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的上述和其他目的、特征和实施方式将更清楚地被理解。
附图说明
图1是从感染开始经过数天的感染小鼠鼠存活数目的变化图表；
图2是从感染开始经过数天的小鼠的死亡数目变化的图表；
图3是从感染开始经过数天的感染小鼠鼠肺部组织的病毒滴度变化的图表；
图4是从感染开始经过数天的病毒感染小鼠体重减少比例的图表；和
图5是使用多聚-γ-谷氨酸处理的巨噬细胞中INF-β增加的图表。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及用于抑制病毒感染或者预防病毒性疾病的药物组合物，其含有有效剂量的多聚-γ-谷氨酸。
在本发明中，作为具有感染抑制效果和疾病预防效果的多聚-γ-谷氨酸，优选使用具有10kDa-15,000kDa分子量的多聚-γ-谷氨酸，更优选具有3,000kDa-15,000kDa的更高分子量的多聚-γ-谷氨酸。
在本发明中，病毒可以是能够诱导呼吸感染或者全身感染的病毒，并且病毒优选为流感病毒。
本发明的用于抑制病毒感染和预防病毒性疾病的药物组合物可被用于预防大流行性感冒(pandemic influenza)、流感(flu)、感冒(cold)、咽喉感染、支气管炎或者由流感病毒引起的肺炎。
优选100重量份的本发明的用于抑制病毒感染的药物组合物含有0.2-2重量份的γ-PGA，并且在其中γ-PGA含量少于0.2重量份的情况下，不能预期感染抑制效果，在其中γ-PGA含量高于2重量份的情况下，不能预期根据含量增加的感染抑制效果并且其引起成本增高，因此在经济方面不是有效的。
在制备含有乙醇的液体制剂形式的包括0.1-2.0重量份的γ-PGA组合物的情况下，能够制备可被用于喷洒单个动物包括人或者大规模消毒的分散剂。在其中用于分散剂的乙醇含量超过50％的情况下，多聚-γ-谷氨酸可被沉淀，在少于1％的情况下，粘度增加，于是分散不能发生，因此优选加入1-50％浓度的乙醇。
在另一方面，本发明涉及预防病毒感染的功能性食品，其含有有效剂量的多聚-γ-谷氨酸。
本发明的功能性食品可以是粉末、颗粒、片剂、胶囊或者饮料形式，并可含有调味剂，天然碳水化合物、维生素、矿物质、香料(flagrance)、着色剂、膨胀剂、稳定剂、防腐剂以及类似物。
在还一方面，本发明涉及预防病毒感染的饲料添加剂，其含有有效剂量的多聚-γ-谷氨酸。
本发明的饲料添加剂可有效预防家畜感染疾病，并可喂养哺乳动物诸如牛、猪、兔、马、山羊、狗、猫、鹿以及类似动物以及家禽诸如鸡、鸭、火鸡、鹌鹑等。
优选100重量份的本发明的饲料添加剂含有0.2-2重量份的γ-PGA，并且在其中PGA含量少于0.2重量份的情况下，感染抑制效果不能被预期，在其中γ-PGA含量高于2重量份的情况下，根据含量增加的感染抑制效果不能被预期并且其引起成本增高，因此在经济方面不是有效的。
实施例
下文将通过实施例更详细地描述本发明。但是应当理解的是，这些实施例仅仅用于说明的目的，而不解释为对本发明的范围的限制。
实施例1:具有超高分子量的γ-PGA的生产及其分子量的测定
在含有3L用于生产γ-PGA的基本培养基(GS培养基，含有5％L-谷氨酸，5％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，0.27％KH2PO4，0.42％Na2HPO4·12H2O，0.05％NaCl，0.3％MgSO4·7H2O，pH 6.8)的5L发酵罐中，接种1％的chungkookjang嗜盐纳豆菌(Bacillus subtilis var)(KCTC 0697BP)培养液，然后在150rpm的搅拌速度、1vvm的空气注入率和37℃的温度下培养72小时。在培养完成后使用滤纸从培养液中除去细胞，由此得到含有γ-PGA的样品液。
将2N的硫酸溶液加入到含有γ-PGA的样品液中并在10℃静置12小时以收集γ-PGA沉淀。使用Nutsche过滤器以过量的蒸馏水洗涤沉淀以得到γ-PGA。使用GPC(凝胶渗透柱)测定得到的γ-PGA的分子量，结果确定产生了具有1-15,000kDa分子量的γ-PGA，然后根据分子量进行分离以收集具有平均分子量为7,000kDa的γ-PGA。收集的γ-PGA在下面的实施例中使用。
实施例2:γ-PGA口服给药时的毒性检测结果
为了检查γ-PGA口服给药的安全性，使用大鼠进行多聚-γ-谷氨酸单独口服给药的毒性检测由根据生物毒理技术标准操作流程(Biotoxtech StandardOperating Procedures,SOPs)、良好实验室规范(Good Laboratory Practice,GLP)规则和检测指南的良好实验室规范(Good Laboratory Practice,GLP)批准的Biotoxtech公司来进行。
使用十只6周龄的雄性大鼠(159.76-199.27g)和10只雌性大鼠(121.60-138.80g)，并且给药到单个小鼠的γ-PGA的剂量以给药当天禁食后测定的体重为基础进行计算。给药前所有小鼠被禁食16小时但可自由接近饮用水，然后使用单剂量的γ-PGA通过胃管使用具有与其连接的用于口服给药导管的一次性注射器(5ml)对它们进行强制口服给药，接着在给药后喂养饲料4小时。
作为初步实验，将100mg/ml的γ-PGA分别以20ml/kg的单剂量口服给药到2只雄鼠和2只雌鼠，结果没有观察到死鼠，因此使用2000mg/20ml/kg作为单剂量。将expedient以与实验材料被给药的实验组相同的剂量给药到对照组。待给药的剂量被设定为20ml/kg。
结果，如表1中所示，在观察阶段没有观察到由γ-PGA口服给药引起的死亡和一般症状。在观察阶段，观察到对照组和实验材料被给药的实验组中雄鼠和雌鼠的体重增加。在对照组和实验材料被给药的实验组的雄鼠和雌鼠中尸体解剖结果没有揭示任何肉眼可见的异常发现。通过单次γ-PGA口服给药到小鼠的结果，由实验材料引起的一般症状和死亡没有被观察到，因此可以确定在雌鼠和雄鼠中γ-PGA的致死计量为超过2000mg/kg。
表1
实施例3:γ-PGA对流感病毒的免疫增强效果1
在本实施例中，为了检查多聚-γ-谷氨酸专一性对鸟类流感病毒的感染抑制效果，分析了感染流感病毒的实验动物中动物的死亡、病毒的增殖和抗体的产生。
(1)病毒的制备
作为用作抗原的流感病毒，H1N1高致病性流感病毒株(A/PuertoRico/8/34(H1N1))从由忠北国立大学药学院微生物实验室Choi，Young-Ki教授捐赠的小鼠中分离，以便在犬肾细胞(Madin-Darby MDCK)中扩增待用，并且6周龄的雌性Balb/C小鼠被用作实验动物。
纯病毒的分离按照如下方式进行。
首先，在含有抗生素的PBS中稀释分离的病毒以接种到10天大的带有胚胎的白色产蛋母鸡的卵中，然后在37℃下静置培养48小时，从其中收获尿囊液并使用扩增的病毒。
第二，将在6孔细胞培养板中含有青霉素和链霉素以及5％胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基(最低必需培养基，Gibco，USA)中生长的MDCK细胞使用PBS洗涤3次并使用其中含有青霉素和链霉素(此后称为P/S)但不含FBS的培养基中稀释，然后将稀释的病毒加入到每个孔中以感染细胞，接着在37℃，5％CO2的培养箱中培养1小时。将使用胰岛素EDTA处理的不含FBS的0.1％TPCK(对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基甲酮，N-alpha-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone)和含有P/S的α-MEM培养基加入到每孔中以便在细胞培养箱中培养。接种24小时之后，使用PBS洗涤细胞培养板并使用含有0.1％诺布尔琼脂(noble agar)的培养基固定。
将培养的菌斑(plaque)以每孔一个菌斑的密度接种到在其中培养制备的MDCK细胞的24孔板中，并将不含FBS的胰岛素EDTA处理的0.1％TPCK和含有P/S的α-MEM培养基加入到每孔中以在细胞培养箱中进行培养。接种48小时后，将从每孔中收集的培养基离心，并在含有通过与上面描述的相同方法制备的含MDCK细胞的烧瓶中感染上清液以培养36-48小时，然后将得到的培养液离心，接着将得到的上清液转移到微管中以在低温冰箱中储存(-80℃)直到用于动物实验。
(2)动物实验
首先，作为对照组，使用单独将流感病毒鼻内给药的小鼠。在实验1组中，多聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)被给药以增强针对病毒的免疫性，然后在第二天给药流感病毒，由此抑制病毒感染。具体地说，在实验1组织中，使用二乙醚将小鼠麻醉30秒，然后，将终浓度为0.5％的30μlγ-PGA(7,000kDa)经鼻腔给药到每只小鼠。第二天，将流感病毒与相同量的γ-PGA一起同时给药到小鼠。
作为实验2组，在实验1组感染病毒的那天以流感病毒和γ-PGA同时给药的小鼠被使用。实验组的构成在下表2中显示。
表2、实验组的构成
病毒体积A:2.5X 105EID50，病毒体积B:1.25X 105EID50
为了病毒感染，使用二乙醚将实验动物麻醉30秒以便将30μl病毒经鼻腔给药到每只小鼠，并且在给药病毒体积A的组中，2.5X 105EID50的病毒被给药，在给药病毒体积B的组中，1.25X 105EID50的病毒被给药。
结果，如图1所示，在对照组中，所有小鼠在病毒给药后7天死亡。在γ-PGA和病毒同时给药的实验组中，在以病毒体积A给药的组中给药之后第12天2只小鼠死亡。在病毒感染1天前给药γ-PGA的实验1组中，在病毒给药之后小鼠存活2周以上。这表明γ-PGA预先给药诱导了对抑制病毒感染的免疫性，并且同时给药有助于每个单个小鼠存活。
在将病毒经鼻腔给药之后1周，以3天为间隔将每组的一只小鼠实施无痛死亡(在病毒给药后的第7天，第10天以及第13天)以收获肺组织和血清。
根据天数和每组的在小鼠肺部组织中流感病毒的滴度通过下列HA(血细胞凝集反应，Haemagglutination)试验测定。
将从死亡小鼠以及在死亡小鼠死亡的相应那天使用二乙醚将麻醉30秒，通过中线切口(midline incision)打开胸腔的小鼠收集的肺部组织在液氮中迅速冷冻并-80℃下储存直到测定滴度。将收获的肺部组织浸泡在含有抗生素的PBS(500μl)中并在组织匀浆器中使用高压蒸汽灭菌3分钟的小磁珠粉碎。将粉碎的组织离心以得到上清液并通过log 10稀释度进行稀释，然后将稀释的溶液接种到10天大的白色产蛋母鸡的胚卵(enbryonated egg)中。
将接种的胚卵在37℃培养48小时以收集尿囊液。将50μl收集的尿囊液加入到圆底96孔板的第一孔中，接着每孔中为以相同体积的PBS log 2稀释度稀释，然后在最后一孔稀释后弃去50μl PBS。最后，将含有0.5％鸡红细胞的50μl PBS加入到每个孔中并允许在室温下反应40分钟。
每个滴度是通过接种液(200μl)的log 10稀释度计算的值。N值以对数值(log10N＝10N)来表示。
表3、流感病毒在小鼠肺部组织中的滴度
滴度是通过接种液(200μl)的log 10稀释度计算的值
N值以对数值(log10N＝10N)来表示。
结果，如表3所示，在对照组中，以病毒体积A给药的组显示滴度为5.3，以病毒体积B给药的组显示滴度为5，并且由于所有小鼠都死亡，滴度的增加或降低没有被显示。在实验1组中，以病毒体积B给药的组显示了滴度随着时间的推移而逐渐降低。但是，在实验2组中滴度降低很少。结果表明，γ-PGA给药有助于单独小鼠克服由高致病性病毒引起的感染。另外，在病毒给药前1天以γ-PGA免疫的组中滴度降低更多，表明以γ-PGA给药诱导了针对病毒的抗性。
根据天数和每组的小鼠血清中的抗体滴度通过下列HI(血细胞凝集反应抑制，Haemagglutination Inhibition)试验测定。
所有血清都使用从Vibrio cholerae中提取的RDE(受体-破坏酶)以1:3的体积比(例如，将30μl RDE加入到10μl血清中)进行处理以在培养箱中在37℃培养18-20小时。将血清中非专一活性的受体失活的25μl每种样品在圆底96孔板中连续稀释(log 2)。第二，将相同体积的4HAU病毒加入到血清样品中并允许在培养箱中37℃反应30分钟。最后，加入50μl含有0.5％鸡胚的PBS并允许在室温下反应40分钟。
表4、小鼠血清中的抗体滴度
滴度是通过接种液(200μl)的log 10稀释度计算的值。N值以对数值(log10N＝10N)来表示。
结果，如表4所示，对病毒的抗体滴度在病毒和γ-PGA同时给药的实验组中增加。在实验2组中，给药后第13天抗体开始出现，并且增加直到第15天。在实验1组中，抗体在第15天开始出现。在对照组中，由于所有小鼠在第七天都已经死亡，仅仅样本中的滴度被测定，针对病毒的抗体没有显示。在病毒给药前的那天使用γ-PGA免疫的组中，与实验2组相比，抗体产生相对较晚，但实验1组显示了比使用γ-PGA和病毒同时给药的组更高的抗体产量。
通过该结果，确定根据本发明的γ-PGA具有针对病毒的免疫增强效果以抑制病毒感染。
实施例4:γ-PGA对流感病毒的免疫增强效果2
在本实施例中，为了检查多聚-γ-谷氨酸专一性对鸟类流感病毒的感染抑制效果，分析了感染流感病毒的实验动物中动物的死亡、病毒的增殖和抗体的产生。
作为用作抗原的流感病毒，H1N1高致病性流感病毒株(A/PuertoRico/8/34(H1N1))从由忠北国力大学药学院微生物实验室Choi，Young-Ki教授捐赠的小鼠中分离以便在犬肾细胞(MDCK)中扩增待用，并且将6周龄的雌性Balb/C小鼠用作实验动物。
动物实验按照如下方式进行。
对照组使用流感病毒单独给药。实验2组以γ-PGA给药两次，然后以流感病毒给药，并且实验3组以γ-PGA和流感病毒同时给药。
在使用二乙醚将小鼠麻醉30秒之后，将流感病毒和γ-PGA经鼻腔给药到实验小鼠，此时将终浓度为0.5％的30μlγ-PGA(7,000kDa)经鼻腔给药到每只小鼠。并以104EID50(30μl)的病毒给药。
在实验3组中，在实验2组感染病毒的那天以流感病毒和γ-PGA同时给药的小鼠被使用。
每组使用6只小鼠以便测定死亡率，使用18只小时以便测定根据天数的病毒量的变化，使用15只小鼠作为实验的对照组，并以天为基础在每组中监测体重变化以测定体重变化率作为病理指标。
结果，如图2所示，在对照组中，在病毒给药1周后一只小鼠开始死亡，第9天死亡3只小鼠，在第12天，2只严重病态的小鼠保持存活。在实验2和3组中，显示仅仅显示温和的疾病症状，并且在病毒给药后存活超过12天。
经鼻腔病毒给药1周后，将每组两只小鼠以2天为间隔麻醉(病毒给药后的第1天，第3天、第5天、第7天、第9天以及第12天)以收集每只小鼠的肺部组织和血清。
根据天数和每组的流感病毒在小鼠肺部组织中的滴度通过在实施例2中描述的HA(血细胞凝集反应，Haemagglutination)试验测定。
每个滴度是通过接种液(200μl)的log 10稀释度计算的值。N值以对数值(log10N＝10N)来表示。在对照组和实验3组中病毒给药后第5天病毒滴度显示最大值为5.5。
在病毒给药前使用γ-PGA免疫的实验2组中，病毒滴度在病毒给药后第一天相对较低，随后增加直到第5天，在给药第5天之后开始降低，在给药第7天之后迅速降低，并且在第12天再也不能检测到病毒。在多聚γ-谷氨酸和病毒同时给药的实验3组中，在给药后第5天滴度与对照组的滴度相同，但在给药第5天之后开始下降，与实验2组相似在病毒给药第7天之后迅速下降，并且在第12天再也不能检测到病毒。这表明给药的γ-PGA有助于个体小鼠抵抗病毒感染，因此对个体小鼠由于增强的免疫性而克服病毒感染来说是有效的。
为了测定体重变化率作为病理指标，在每组中以天为基础监测体重变化(图4)。每个值以下降率的百分比表示(病毒给药后测定的体重/病毒给药前测定的体重)。
在病毒给药后，在对照组中，观察到体重减轻在给药第5天之后开始迅速加快，给药7天之后死亡率超过20％。在另外2个实验组中，直到病毒给药后的第7天体重都在下降，并在给药第7天之后开始增加并且小鼠开始康复，这表明在病毒给药后死亡率与肺部组织中的病毒滴度之间存在关联。
通过该结果，确定根据本发明的γ-PGA具有针对病毒的免疫增强效果以抑制病毒感染。
实施例5:巨噬细胞中INF-β分泌的诱导
检查了本发明的γ-PGA对巨噬细胞的活性的影响，巨噬细胞在作为免疫系统的基本免疫反应的病毒抑制活性中起重要作用。
作为巨噬细胞活性的指标，检查一种由巨噬细胞分泌的介导初始免疫反应的细胞因子-干扰素β(INF-β)的分泌。
通过检查，作为Balb/c小鼠巨噬细胞系的RAW 264.7(ATCC TIB-71)被悬浮在DMEM(加入了100U/ml青霉素-链霉素，10％FBS)培养基中并以5x105个细胞/孔的密度分散到6孔板中以在CO2培养箱中培养12小时，然后，将γ-PGA(7,000kDa)在不含FBS的DMEM培养基中稀释至浓度分别为0.1％和0.5％，培养12小时。
在培养过程中，在3、6、12以及24小时时收集每孔中的培养上清液，并再次加入与收集的培养上清液相同体积的培养液。在收集的上清液中分泌的INF-β的量通过ELISA试剂盒(BD Bioscience，USA)测定。
将100μl的IFN-β标准溶液和100μl上清液加入到包被了IFN-β抗鼠单克隆抗体的96孔板中并允许在室温下反应1小时，然后使用洗涤缓冲液(250μl/孔)洗涤3次，然后加入作为初级抗体的生物素化的INF-β抗鼠多克隆抗体并允许在室温下反应1小时，使用洗涤缓冲液(250μl/孔)洗涤3次。此后，加入作为第二抗体的100μl抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶共轭物并允许在室温下反应1小时洗涤3次，然后允许其与显色剂TMB溶液反应15分钟，接着使用50μl终止液终止显色，由此通过使用ELISA阅读仪在450nm处进行测定来分析每种INF-β的量。
结果，如图5所示，观察到于γ-PGA一起培养的巨噬细胞在培养6小时之后开始分泌β干扰素，并且分泌的量随着时间的推移而增加。分泌的β干扰素的量随着γ-PGA浓度的增加而增加，表明INF-β的分泌是γ-PGA浓度依赖性的。
可以确定γ-PGA对诱导巨噬细胞的活性高度有效，并且巨噬细胞的活性是γ-PGA–浓度依赖性的。
结果发现，根据本发明的γ-PGA诱导了由巨噬细胞分泌的INF-β的分泌，其分泌是在免疫反应和病毒生长抑制活性中起重要作用的巨噬细胞活性的指示。
工业实用性
如上所述，本发明具有提供含有γ-PGA作为有效成分的组合物，其可被用作动物饲料添加剂或者预防病毒感染和各种疾病的治疗剂以及药物组合物和促进人类健康的功能性食品。
虽然已经参照特定解释性实施方式对本发明进行了描述，但本发明并不由实施方式所限定，而是仅由随附的权利要求书来限定。应当理解的是，在不偏离本发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员能够对实施方式进行变化或修改。

Claims (4)

1.多聚-γ-谷氨酸在抑制由H1N1流感病毒引起的病毒感染或预防由H1N1流感病毒引起的病毒性疾病的药物组合物中的应用，其中所述多聚-γ-谷氨酸的分子量为3,000至15,000kDa。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物为使用乙醇将多聚-γ-谷氨酸稀释在其中的分散剂。
3.多聚-γ-谷氨酸在抑制由H1N1流感病毒引起的病毒感染或预防由H1N1流感病毒引起的病毒性疾病的功能性食品中的应用，其中所述多聚-γ-谷氨酸的分子量为3,000至15,000kDa。
4.多聚-γ-谷氨酸在抑制由H1N1流感病毒引起的病毒感染或预防由H1N1流感病毒引起的病毒性疾病的饲料添加剂中的应用，其中所述多聚-γ-谷氨酸的分子量为3,000至15,000kDa。
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