CN101618043B

CN101618043B - 1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感药物的用途

Info

Publication number: CN101618043B
Application number: CN2009100401576A
Authority: CN
Inventors: 北里海雄; 王一飞; 张颖君; 刘格; 钱垂文; 熊盛
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-06-10
Also published as: CN101618043A

Abstract

本发明提供了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖不仅有很强的抗病毒活性，还具有灭活病毒活性，且活性浓度在细胞毒性范围之外，其对病毒有直接灭活作用，可以将接触到的病毒灭活使病毒失去感染能力或对已被病毒感染的细胞起到治疗作用，不仅可以作为药物开发，还可以应用于饮料等食品领域或者化妆品领域，可以在防治病毒的卫生保健品中广泛应用。

Description

1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感药物的用途

技术领域

本发明属于药品领域，特别涉及1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。

背景技术

流感病毒是人类感染的最大的呼吸道传染病的病原体，由于流感病毒的抗原变异能力极强且相当频繁，每年世界各国都有小范围流行，导致免疫力弱的被感染的幼儿及老人死亡，目前仍然是人类面临的最大的公共卫生威胁之一。近年来，高致病性禽流感H5N1的流行，不但对养鸡业带来毁灭性打击，并能感染接触的人导致50％以上的高致死率，给我们敲响了警钟，一旦变异可以在人与人之间传播，将对人类的生存构成巨大威胁。正当人们对H5N1禽流感警戒之时，今年4月从墨西哥开始流行的甲型H1N1流感现正在世界范围传播，阻止此流感病毒在世界范围的大流行的药物研究已经迫在眉睫。

对流感病毒的预防及治疗方法主要包括疫苗和抗流感药物治疗。疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒保护率不高或无效。目前，临床上使用抗流感药物有离子通道阻断剂和NA抑制剂两大类共四种药物，但是，由于现有药物在临床上的广泛应用，使得流感病毒发生变异，对这些药物产生了不同程度的耐药性。因此，寻找具有预防和治疗作用的新型抗流感药物就显得尤为重要和紧迫。

本研究从中国南方药用植物余甘子中提取的天然化合物中筛选出具有高活性的抗流感病毒的化合物1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖(PGG)，此化合物对乙肝病毒(HBV)，呼吸合胞病毒(RSV)等病毒有抑制活性。抗流感病毒活性属首次报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供了1，2，3，4， 6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，简称PGG)作为制备抗流感病毒的药物的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。

所述抗流感病毒的药物含有治疗有效量的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。

所述流感病毒为甲型流感病毒。

所述食品为饮料、保健食品或食品添加剂。

所述抗流感病毒的药物制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、乳膏剂、口服液、喷雾剂、针剂或粉针剂。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：本发明首次证明1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖(PGG)不但有很强抗病毒活性，感染12小时后还有明显治疗效果，更重要的是首次发现此化合物还具有灭活病毒(virucidal)活性，且活性浓度在细胞毒性范围之外，其对病毒有直接灭活作用，可以将接触到的病毒灭活使病毒失去感染能力或对已被病毒感染的细胞起到治疗作用，因此，PGG不仅可以作为药物开发，还可以应用于饮料等食品领域或者化妆品领域；另外，此化合物也可以在防治病毒的卫生保健品中广泛应用。

附图说明

图1是1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖的细胞毒性检测结果图。

图2是1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖抗流感病毒活性结果图。

图3是不同浓度1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对流感病毒复制的抑制作用图。

图4是MDCK细胞感染流感病毒48小时后细胞病变图(×200)，其中A为非感染组，B为二甲基亚砜处理组，C为1.56μg/ml PGG处理组，D为3.13μg/ml PGG处理组，E为6.25μg/ml PGG处理组，F为12.50μg/ml PGG处理组。

图5是1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对流感病毒在MDCK 细胞中复制的抑制作用图。

图6是流感病毒感染细胞的细胞内病毒m RNA和蛋白表达图。

图7是不同时间点加药实验步骤图。

图8是不同时间点加药实验结果图。

图9是1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖灭活流感病毒活性的实验图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验材料的说明如下：

1、MDCK细胞(狗肾细胞)，购于CELL BANK(细胞银行，理研生物资源中心3-1-1Koyadai，筑波，茨城县305-0074，日本传真：+81-29-836-9130/电子邮箱：cellbank@brc.riken.ip)；

2、流感病毒Influenza A/WSN/33(H1N1)：A型流感病毒(InfluenzaA/WSN/33(H1N1))接种于10日龄的鸡胚尿囊腔内，35℃培养2天后回收尿囊液，于-80℃保存备用；

3、培养基：

含体积百分比浓度为10％(v/v)的胎牛血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)；

含体积百分比浓度为1％(v/v)的维他命的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)；

含质量体积百分比浓度为1％(即1g/100m)的牛血清白蛋白(BSA)的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)；

无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)；

2×MEM培养基(含体积百分比浓度为2％的维生素，质量体积百分比浓度为2％的BSA(2g/100ml)，体积百分比浓度为6％的谷氨酰胺)；

2mM的1-甲氧基-5-甲基硫酸甲酯盐(1-Methoxy PMS)：将0.01g1-Methoxy PMS溶解于1ml双氧水(ddH₂O)中，然后进行梯度稀释，经酶标仪检测波长从420nm到600nm范围内的吸收光值，找到最大吸收峰值所在的波长，将该最大吸收值波长代入公式C＝A/ε(ε＝2.7×10³，C为浓度，A为吸收光值)，计算该吸收值对应的浓度，用ddH₂O稀释到浓度为2mM，4℃保存备用；

WST-1溶液：16.3mgWST-1粉末，即2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑钠盐，(2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl-2H-tetrazolium，monosodium salt.)(DOJINDO)溶解于5ml 0.2mM 1-Methoxy PMS溶液中，经0.2μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备用；

固定液(EtOH∶AcOH(v/v＝1∶1))：醋酸和乙酸等体积混合而成；

质量体积百分比为0.5％的氨基黑(Amino black 10B)：将2g Amino black10B溶解于400ml ddH₂O中；

1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖(PGG)：将PGG粉末经二甲基亚砜(DMSO)充分溶解后于-80℃保存备用，PGG(C₄₁H₃₂O₂₆)的分子量为940，化学式如下式所示：

实施例1：PGG的细胞毒性和抗流感病毒活性检测

(1)PGG的细胞毒性检测方法如下：将3×10⁴个MDCK细胞/孔接种于96孔板，在含体积百分比浓度为10％(v/v)的胎牛血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养24小时后，吸取除去培养基，加入200μl含系列梯度稀释浓度(0.39μg/ml-25μg/ml，2倍稀释)PGG的含体积百分比浓度为1％(v/v)的维他命的MEM培养基(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时后用WST-1法进行检测。每个实验组设三个复孔，重复四次实验。

WST-1法：向培养72小时后的96孔板里每孔加入10μl WST-1溶液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时后，混匀，酶表仪检测450nm吸收光值。

实验结果如图1所示。

(2)PGG的抗流感病毒活性检测方法如下：将3×10⁴个MDCK细胞/ 孔接种于96孔板，在含体积百分比浓度为10％(v/v)的牛胎血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养24小时后，吸取除去培养基，加入100μl含不同浓度(0.39μg/ml-25μg/ml，2倍稀释)PGG的无血清MEM培养基和100μl流感病毒(influenza A/WSN/33，100TCID₅₀(半数组织培养感染剂量)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时后用WST-1法进行检测。以浓度为0.2μM Zanamivir(扎那米韦)作为阳性对照药物，每个实验组设三个复孔，重复四次实验。

WST-1法：向培养72小时后的96孔板里每孔加入10μl WST-1溶液，37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时后，混匀，酶表仪检测450nm吸收光值。

实验结果如图2所示。将四次重复实验的结果进行平均，根据Reed-Muench法计算半数致死浓度CC50(50％cell cytotoxic concentration)和半数抑制率IC50(50％virus-inhibitory concentration)以及选择系数SI(selective index)，结果表明PGG对MDCK细胞的IC50为2.36μg/ml，CC50为28.85μg/ml，SI为12.22。

实施例2：不同PGG浓度对流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用

实验方法：将8×10⁵MDCK个细胞/孔接种于12孔板，在含体积百分比浓度为10％(v/v)的胎牛血清MEM培养基(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养24小时。用磷酸缓冲液(PBS(-))洗细胞两次后，每孔加入用无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)稀释的流感病毒A/WSN/33(H1N1)200μl(病毒感染剂量为MOI＝0.001)。在37℃，5％CO₂培养箱中感染1小时后，吸取弃去病毒感染液，用磷酸缓冲液洗细胞两次，加入含不同浓度(1.56μg/ml～12.5μg/ml，2倍稀释)PGG的含体积百分比浓度为1％(v/v)的维生素的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)，继续培养48小时后回收培养上清液。通过空斑实验对培养上清液中放出的病毒进行滴定。重复三次实验，每次实验每个组设2复孔。

空斑实验：将1.6×10⁶MDCK个细胞/孔接种于6孔板，在含体积百分比浓度为10％(v/v)的牛胎血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养48小时以后汇合度达100％；用PBS(-)洗细胞两次后，每孔加入500μl用含质量体积百分比浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)的MEM培养基梯度稀释(10倍稀释)的病毒培养上清液，在37℃，5％CO₂培养箱中感染1小时后，吸取弃去病毒感染液，用PBS(-)洗细胞两次；等体积混合质量百分比浓度为1.6％(1.6g/100ml)的琼脂糖和2×MEM培养基(琼脂糖终浓度为质量百分比浓度为0.8％)，每孔加入3ml含终浓度0.8％琼脂糖的培养基，待琼脂糖培养基凝结后倒置于37℃，5％CO₂培养箱中培养三天。各孔加入1ml固定液(乙醇∶醋酸＝1∶1(v/v))室温固定1小时后，弃除琼脂糖，加入质量体积百分比为2.5％的氨基黑(amino black)染色3小时，对空斑进行计数，并计算病毒滴度(PFU/ml)。

实验结果如图3所示：图中星号表示具有显著性差异(^*P＜0.05，^**P＜0.01)，其中浓度为12.50μg/ml的PGG处理组的病毒滴度和对照组相比相差10⁵PFU/ml，表明PGG对流感病毒抑制作用具有浓度依赖性。

图4显示MDCK细胞感染流感病毒A/WSN/33(MOI＝0.001)48小时后不同浓度PGG条件下的细胞病变情况：6.255μg/ml和12.50μg/ml的PGG处理后，细胞病变程度明显降低.

实施例3：PGG对流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用

实验方法：将8×10⁵个MDCK细胞/孔接种于12孔板，在含体积百分比浓度为10％(v/v)的牛胎血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养24小时；用PBS(-)洗细胞两次后，每孔加入用无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)稀释的流感病毒A/WSN/33(H1N1)200μl(病毒感染剂量为MOI＝0.001)。在37℃，5％CO₂培养箱中感染1小时后，吸取弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次，加入2ml含不同浓度(1.56μg/ml～12.5μg/ml，2倍稀释)PGG的含体积百分比浓度为1％的维生素的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)；实验分对照组(加含DMSO(V/V＝0.1％)培养基)，实验组1(加含6.25μg/ml PGG的培养基)和实验组2(加含6.25μg/ml PGG的培养基)。在感染后8，24，36，48小时分别回收培养上清液。通过空斑实验对培养上清液进行滴定。重复三次实验，每次实验每个组设2复孔。空斑实验方法如实施例2所述。

实验结果如图5所示：病毒感染后经过6.25μg/ml和12.50μg/ml PGG处理组明显抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制，并且呈浓度依赖性。

实施例4：感染细胞细胞内病毒m RNA和蛋白的表达

实验方法：将8×10⁵个MDCK细胞/孔接种于12孔板，在含体积百分比浓度为10％的胎牛血清MEM培养基(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml) 中培养24小时。用PBS(-)(磷酸缓冲液)洗细胞两次后，每孔加入用无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)稀释的流感病毒A/WSN/33(H1N1)200μl(病毒感染剂量为MOI＝0.001)。在37℃，5％CO₂培养箱中感染1小时后，吸取弃去病毒感染液，用PBS(-)洗细胞两次，加入含不同浓度(1.56μg/ml、12.5μg/ml，2倍稀释)PGG的含体积百分比浓度为1％(v/v)的维生素的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)，继续培养48小时后回收培养细胞。

从细胞中提取总RNA，用流感病毒(A/WSN/33)NP基因mRNA特异性引物进行反转录PCR，检测流感病毒NP基因m RNA的表达；流感病毒的NP mRNA特异性引物序列为：

正义链：5’-CGGTCTGCACTCATATTGAGAGG-3’，

反义链：5’-GAAAGCTTCCCTCTTGGG-3’；

同时以18SrRNA基因作为内参基因18Sr RNA基因引物：

正义链：5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’，

反义链：5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’；

逆转录PCR条件为：94℃预变性2分钟，94℃30秒，60℃延伸30秒，24个循环，72℃退火1分钟。

此外，回收的细胞经由细胞裂解液处理(95℃加热5分钟)，经质量百分数为10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至二氟化树脂(PVDF)膜，最后用特异性抗体进行免疫反应检测actin蛋白和流感病毒NP蛋白的表达。0.5％(质量百分比数)脱脂牛奶封闭过夜后，加入一次抗体(抗actin兔血清和抗NP兔血清)，室温孵育2小时，加入二抗(抗兔血清IgG)室温孵育1小时，加入DAB显色剂至能够观察到条带。

实验结果如图6所示：经过6.25μg/ml和12.50μg/ml PGG处理48小时的细胞内病毒NP mRNA和蛋白的表达受到明显的抑制。

实施例5：不同时间点加药实验(加药的步骤如图7所示)

实验方法：将8×10⁵MDCK细胞/孔接种于12孔板，在含10％牛胎血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养24小时。实验分三组，实验组一为预防组(pre-culture)，实验组二为灭活组(pre-mix)，实验组三为治疗组(感染后3，6，9，12小时后加药)。

预防组：细胞中加入浓度为12.50μg/ml PGG的含体积百分比浓度为1％(v/v)的维他命的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)，在37℃培养2小时后，用PBS(-)洗细胞三次；每孔加入用无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/m)稀释的流感病毒A/WSN/33(H1N1)200μl(病毒感染剂量为MOI＝0.001)。在37℃培养1小时后，吸取弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次后，加入2ml无血清MEM培养基(含体积百分比浓度为1％(v/v)的维他命，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)继续培养24小时，回收培养上清液，用空斑试验测定其病毒滴度(PFU/ml)。

灭活组：流感病毒(5×10³PFU/ml)分别于含25μg/ml PGG的无血清培养基(含体积百分比浓度为1％(v/v)的维他命，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)和含0.2％DMSO(V/V)的无血清培养基(含1％维生素，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)等体积混合，冰上放置1小时；MDCK细胞经PBS(-)洗细胞两次后，每孔加入用上述流感病毒混合液200μl(病毒感染剂量为MOI＝0.001)；在37℃培养1小时后，吸取弃去病毒感染液，加入无血清培养基继续培养24小时后吸取弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次后，加入2ml无血清MEM培养基(含1％维生素，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)继续培养24小时，回收培养上清液，用空斑试验测定其病毒滴度(PFU/ml)。

治疗组：MDCK细胞经PBS(-)洗细胞两次后，每孔加入用无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)稀释的流感病毒A/WSN/33(H1N1)200μl(病毒感染剂量为MOI＝0.001)。在37℃培养1小时后，吸取弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次，于感染后不同的时间点(0，3，6，9，12小时)加入含浓度为12.5μg/ml PGG的培养基接续培养，直至感染24小时后，回收培养上清液，用空斑试验测定其病毒滴度(PFU/ml)。

实验结果如图8所示：预防组结果表明PGG没有预防作用；灭活组的结果显示PGG具有灭活或降低病毒感染能力的作用；治疗组的结果显示PGG具有显著的治疗效果，在感染病毒12小时后加PGG仍然有效。

实施例6：PGG灭活流感病毒活性的实验

实验方法：为了进一步确认PGG对病毒的灭活活性(virucidal activity)，将流感病毒A/WSN/33(H1N1)液稀释为10³PFU/ml、10⁴PFU/ml、10⁵PFU/100μl，分别与不同浓度(6.25，12.5μg/ml)的PGG液100μl混合，冰上放置1小时，然后通过空斑实验测定混合后的病毒的滴度。空斑实验方法如前述。

实验结果如图9所示：其中(A)和(B)分别为6.25μg/ml和12.5μg/mlPGG对10⁵PFU/ml的流感病毒滴度的抑制率达到96.4％和98.4％，对10⁴PFU/ml的流感病毒灭活率达到98％和100％，而对10³PFU/ml的流感病毒灭活率均达到100％。

图(C)和(D)为10⁵PFU/ml的流感病毒液100μl分别与不同浓度(3.13μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml)的PGG稀释液100μl混合，冰上放置1小时后，感染MDCK细胞，通过空斑实验测定混合后的病毒液中病毒的滴度。结果表明，各个浓度的PGG对流感病毒灭活率均达到98％以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖在制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品中的用途，其特征在于：所述流感病毒为H1N1流感病毒。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗流感病毒的药物含有治疗有效量的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述食品为饮料、保健食品或食品添加剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗流感病毒的药物制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、乳膏剂、口服液、喷雾剂或针剂。