CN101454023A

CN101454023A - 干扰缺损病毒

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Publication number: CN101454023A
Application number: CNA2007800189100A
Authority: CN
Inventors: 奈杰尔·迪默克
Original assignee: University of Warwick
Current assignee: University of Warwick
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2027-05-24
Also published as: GB0610342D0; GB2437799A; CN101454023B; GB2437799B

Abstract

使用产生大量DI病毒材料的方法在含胚鸡卵中生产克隆的，即确定的干扰缺损(DI)甲型流感病毒。然后使用克隆的DI病毒对受到野生型甲型流感病毒致死性攻击的小鼠和雪貂进行测试。当克隆的DI甲型流感病毒与致死剂量的毒性甲型流感病毒合用时，与灭活的克隆的DI甲型流感病毒对照相比，小鼠受到保护。在施用克隆的DI甲型流感病毒和感染性攻击的病毒后存活的小鼠三周后仍能抵抗感染性病毒致死性攻击。仅接受克隆的DI甲型流感病毒而未受致死性攻击的对照小鼠三周后不能抵抗感染性病毒致死性攻击。发现当在使用感染性病毒攻击后48小时内施用克隆的DI甲型流感病毒时，所述施用具有治疗效益。发现克隆的DI甲型流感病毒的一个亚型在体内是针对相同或任何其它亚型的甲型流感病毒的有效抗病毒剂。已发现所述抗病毒效应对人、哺乳动物和禽类中的甲型流感感染兼有治疗和预防应用。

Description

干扰缺损病毒

发明领域

本发明涉及病毒学以及动物(包括禽类和人)中病毒感染，特别是甲型流感的预防和/或治疗。本发明还涉及抗病毒治疗领域。本发明进一步涉及生产用作预防和/或治疗病毒感染的活性剂的干扰缺损(DI)病毒，即“DI病毒”的过程。“DI病毒”是确定的，通常是克隆的“干扰缺损”病毒。“干扰病毒”通常是干扰非缺损病毒的正常复制和感染周期的缺损病毒。(DI流感病毒制剂在本领域已为已知，但是存在遗传异质性。)

背景技术

正黏病毒科(Orthomyxoviridae)是感染脊椎动物的RNA病毒。该科包括引起流感的那些病毒。

流感是以发烧、咳嗽和严重的肌肉疼痛为特征的呼吸系统的病毒感染。流感病毒根据其核蛋白和基质蛋白的抗原差异分为三个属：甲型流感病毒(Influenzavirus A)、乙型流感病毒(Influenzavirus B)和丙型流感病毒(Influenzavirus C)。

甲型和乙型流感病毒均含有八段单链RNA(ssRNA)。所述病毒包含主要外病毒粒子蛋白，血凝素(H)和神经氨酸酶(N)，其中有16个H亚型和9个N亚型，它们可能形成所有144种可能的排列。

丙型流感病毒含有七段ssRNA，因为该病毒缺乏单独的神经氨酸酶基因(参见Lamb，R.和Krug，R.M.(1996)第45章；Orthomyxoviridae：Theviruses and their replication(正黏病毒科：病毒及其复制)-Fields Virology(费氏病毒学)，第三版，Raven Publishers，Philadelphia)。

人流感的主要病原体是甲型病毒。该病毒基因组包含八个反义、单链RNA区段。所述RNA编码9个结构蛋白和2个非结构蛋白。已知它们编码下文列出的流感病毒蛋白：

区段1编码聚合酶蛋白PB2

区段2编码聚合酶蛋白PB1

区段3编码聚合酶蛋白PA

区段4编码血凝素蛋白(HA)

区段5编码神经氨酸酶蛋白(NA)

区段6编码核蛋白(NP)

区段7编码两个基质蛋白(M1和M2)

区段8编码两个非结构蛋白(NS1和NS2)

甲型和乙型人流感病毒均是造成人季节病的原因，但是仅有甲型流感病毒引起全球大流行。在人病毒中，已鉴定了三种不同的血凝素(称为H1、H2和H3)和两种不同的神经氨酸酶(称为N1和N2)。病毒根据其组成血凝素和神经氨酸酶蛋白分为亚型。例如，引起1918年的“西班牙”流感大流行的病毒株属于H1N1亚型。H2N2亚型出现于1957年并取代了H1N1；H3N2亚型出现于1968年并取代了H2N2。每次取代事件已知均为抗原性转变，并且由于整个人群缺乏对新病毒的有效免疫性，均造成了大流行。转变之后，主要的病毒H和N表面蛋白经历叫做抗原性漂移的持续和渐进的抗原性变化。漂移病毒引起每年的流感流行。目前H3N2和H1N1(其在1977年重新出现)的漂移后代同时存在。乙型流感病毒不会引起大流行流感但是有助于流行。

不过，大部分甲型流感病毒存在于各种水禽中，引起亚临床肠道感染。例如，2003年10月，鸡流感流行病开始在环太平洋的多个国家(越南、泰国、日本、中国、韩国、柬埔寨)蔓延，最近已到达欧洲。此病毒命名为H5N1。H5分子在禽流感病毒中很常见，但是尚未在发现引起人流行病的流感病毒中发现。不过，H5N1(具有惊人的致死率)的散发性人案例一直存在，并且引起了极大关注。

基因组研究暗示人大流行病毒起源于适应人(1918)，或与现有人病毒的遗传相互作用(1957和1968)的禽病毒。因此，随着禽病毒(如H5N1和H7N7)从其天然宿主转移至家禽和与人密切接触，新兴的新的大流行病毒备受关注。不过，这些病毒目前均不能在人与人之间有效传播。高度感染的新的大流行病毒均造成高发病率和死亡率，估计1918年病毒造成全球5000万人死亡，1957和1968年病毒为100-500万。尽管流感感染引起针对引起其的毒株的强烈的免疫反应，但是通过抗原性漂移产生的新毒株的速度很快使之前感染的个体易受新的感染。流感疫苗可商业获得已有多年，并包括灭活疫苗和活疫苗。一些疫苗含有灭活的病毒粒子，或者更常见地仅纯化的H和N组分。已证明这些疫苗有助于减小流感流行的范围和程度。不过，由于抗原性漂移现象，用作现有疫苗的基础的流感毒株每年都要由WHO重新评价，可能需要更改。而且，新的大流行病毒需要的任何新疫苗都将花费数个月的时间才能获得施用。

防御流感的其它方法包括抗病毒药物。例如，金刚胺和甲金胺抑制使病毒RNA进入胞浆所需的基质蛋白之一的作用。这些药物有效针对所有甲型流感病毒(但是对乙型病毒无效)，但是已观察到快速进化的对所述药物的抗性。

可选地，扎那米韦(Zanamivir)(Relenza

)和奥斯米韦(Oseltamivir)(Tamiflu

)阻止神经氨酸酶，从而用以抑制子代病毒粒子从受感染的细胞的释放和感染的扩散。不过，这些治疗的效力有一些局限。治疗必须在感染后不久开始，每天两次，并且仅能将症状持续时间缩短一至三天。已在流感患者中发现达菲(Tamiflu)抗性病毒。

虽然疫苗学和抗病毒药物已有发展，但是另一次流感大流行不可避免，预期将造成广泛的发病率和全球高达百万的死亡人数。亟需对抗流感的新方法。

DI病毒有长期的历史。它们是作为自体干扰组分由von Magnus在甲型流感病毒制剂中发现，von Magnus在20世纪40年代末和20世纪50年代早期对它们进行了研究(例如von Magnus，P(1947)Ark.Kemi.Mineral.Geol，24b：1)。许多年来，这些干扰组分一直以他的名字命名。后来，当人们认识到这些组分发现于几乎所有病毒中时，将其称为DI病毒(参见例如Huang & Baltimore(1970)Nature 226：325-327)。对DI病毒的兴趣在20世纪70年代达到高峰，但是然后由于对其在体内的抗病毒活性期望过高而减退。

所有甲型流感病毒均显示具有实现在双重感染的细胞中交换基因组区段(重配)的复制装置，赋予这些病毒巨大的遗传可塑性。此事件造成了1957年和1968年的大流行病毒。除了正常的复制过程之外，复制中发生的错误产生缺乏80％左右的模板中央序列的400-500nt的小RNA，它们是由于聚合酶复制所述模板的起始部分、退出所述模板和然后重新加入并复制另一端而造成的。这些小RNA保留末端复制和包壳(encapsidation)信号，而它们的小尺寸暗示，与全长RNA区段相比，单位时间内可以产生更多的拷贝。基因组RNA的包壳表现为有组织的过程，以便一个病毒粒子仅含有一个拷贝的所述8个区段的每个区段。病毒粒子不会辨别缺损和全长RNA，所以当缺损RNA过量时，他们将优选被包壳。含有缺失的基因组区段的粒子无法合成该RNA正常编码的病毒蛋白，因此是非感染性的，尽管当所述细胞被甲型流感病毒感染时所述粒子可以反式复制。缺损RNA掺入病毒粒子造成生产的感染性病毒的数量减少。因此，携带缺失的基因组的病毒粒子被称为干扰或缺损-干扰(DI)病毒。

由于一个或多个基因组区段中的内部缺失(75-80％的核苷酸)，因此正黏病毒科的病毒自发产生缺损RNA区段。因此，DI病毒基因组是产生其的感染性病毒的基因组缺失的形式；它具有多个将其与其它类型的缺损病毒核酸分子相区分的特性(参见Dimmock，N.J.(1996)“Antiviral activity ofdefective interfering influenza virus in vivo”(体内干扰缺损流感病毒的抗病毒活性)-Viral and other infections of the human respiratory tract(人呼吸道的病毒和其它感染)；S.Myint和D.Taylor-Robinson(编)，Chapman & Hall)。

与活性即活或感染性病毒相比，DI病毒是非感染性的，并且仅当其基因组存在于已被具有完全基因组的病毒(有时称为“辅助病毒”)感染的细胞时，其才进行复制。DI流感病毒包壳为病毒粒子，该粒子在大小和蛋白组成上与感染性病毒粒子通常无区别。

从头产生之后，DI基因组按相对所述感染性病毒的基因组的浓度快速扩增，所以在少数感染周期(或世代)内，群体中的DI病毒即多于感染性病毒。

DI病毒具有在细胞内干扰感染性病毒的能力，所以其能够特异性抑制感染性病毒的增殖。

体内动物研究已显示，足量的自发产生的DI甲型流感病毒(A/equine/Newmarket/7339/79(H3N8))可以保护小鼠抵抗甲型流感的致死性攻击(无论是同源病毒(EQV)还是异源亚型A/WSN(H1N1)或A/PR/8/34(H1N1))。在这些研究中，所述DI病毒制剂用UV处理以灭活存在的任何活的辅助病毒。单次施用可提供高达约5天的预防。不过，这些DI病毒制剂是异质的，包含多种来自不同的基因组区段的不明确的缺损RNA序列(参见Noble和Dimmock(1994)J.Gen.Virol.75：3485-3491)。

含胚卵(embryonated eggs)中培养的DI病毒A/WSN(H1N1)保护小鼠抵抗A/WSN(H1N1)致死性攻击。卵培养DI病毒RNA种类与从存活小鼠肺部提取的DI病毒RNA的比较显示，有5个推定RNA与小鼠存活有关。所述的五个DI病毒RNA种类均具有内部缺失(参见Noble & Dimmock(1995)Virology 210：9-19)。这些RNA种类中的四个具有完整的3′和5′末端。

Duhaut & Dimmock(2000，Virology 275：278-285)通过在质粒中将EQV的缺损区段1RNA置于人RNA聚合酶I启动子(POLI)的控制之下而对其进行了改良。所述每种质粒编码约400个核苷酸的RNA，但是由于内部缺失的准确位置，将保留不同长度的5′和3′端序列。使用每种质粒和三种不同的辅助病毒亚型(包括亲本(H3N8)或H2N2或H1N1亚型)之一转染Vero细胞。连续传代在细胞培养物中执行。在每个与使用的特定的辅助病毒一起使用的细胞系中，均发现所述DI病毒RNA 5′端的至少150个核苷酸是体外可靠传代所必需的。

尚无法通过实验阐明非克隆的DI甲型流感病毒降低感染性病毒生产、抑制病毒诱导的细胞病理学和保护动物免受临床疾病的过程，因为大多数DI病毒群体含有许多衍生自不同的基因组区段并具有多种中央缺失的不同的缺损RNA序列。因此，此类非克隆的缺损病毒群体的RNA组成无法有效复制，从而不能分析RNA序列和抗病毒活性之间的关系。

Duhaut & Dimmock(2002，J.Gen.Virol.83：403-411)证明衍生自质粒系统的DI病毒RNA在细胞培养物中显示出真实的行为。一个质粒(POLI-317)产生存在辅助病毒时在体外稳定复制并强烈抑制所述辅助病毒在该系统中的生产的DI病毒RNA。

Duhaut & Dimmock(2003，J.Virol.Methods 108：75-82)描述了完全从用于转染培养的宿主细胞的质粒产生的确定的(即克隆的)DI甲型流感病毒的制备。所用质粒编码DI RNA(H3N8或H7N7)和感染性流感病毒(A/WSN，H1N1)。将用这种方法生产的DI病毒在含胚鸡卵(embryonatedhens eggs)中传代一次，然后在存在辅助病毒(H1N1)的情况下施用至小鼠。所述克隆的DI病毒完整传播至小鼠肺部。还测试了所述克隆的DI病毒(无感染性辅助病毒)对小鼠针对致死(H1N1)的攻击的任何保护效应。观察到一些非常微弱和短暂的预防效应，但是这仅延迟了临床症状的发作和小鼠的死亡。

Noble等(2004，Vaccine 22：3018-3025)报道了使用天然存在的(即异质和不明确的)DI病毒制剂(EQV H3N8)在小鼠中的体内研究。发现为小鼠施用此DI病毒制剂产生一段时期的预防保护，同时将其他致死感染转化为无毒的和免疫性感染。

Dimmock & Marriott(2006，J.Gen.Virol.87：1259-1265)描述了明显的异常，其中异质的和不明确的DI病毒制剂有力地保护小鼠免受由A/PR/8/34(H1N1)和A/WSN/40(H1N1)病毒引起的致死疾病，但是仅勉强预防由A/Japan/305/57(A/Jap H2H2)引起的疾病。发现A/Jap需要比A/PR8多出300倍的感染单位才能在小鼠中引起临床疾病。改变DI病毒和攻击病毒的比例并进行测试。得出的结论是所述DI病毒的效力依赖于攻击病毒的感染剂量而不是其致病剂量。

Mann等(2006，Vaccine 24，4290-4296)测试了雪貂中已被(A/PR8)拯救的异质的和不明确的DI A/EQV RNA。施用两个剂量的DI病毒，然后使用感染性A/Sydney 5/97(H3N2)进行攻击。虽然所述感染性攻击不是致死的，但是与严重患病的对照动物相比，DI病毒处理的雪貂仅显示偶然的、温和的临床症状。

US2006/0057116 A1(Kawaoka和Neumann)描述了在不存在任何辅助病毒的情况下在体外生产重组甲型流感病毒的转染和培养细胞的质粒和方法。特异地，可以在转染细胞系中从其克隆的cDNA完整制备甲型流感病毒。可以向任何基因区段掺入突变。

WO2006/051069(Solvay Pharmaceuticals & Erasmus University)公开了条件缺损流感病毒粒子和其制备方法。以不能生产大量缺损流感病毒粒子用作疫苗的转染细胞为起始点，该说明书教导了可选的方法。所述方法包括用流感病毒的7个RNA区段和缺失了其中的聚合酶编码序列的第八个区段转染的细胞。所述细胞包括携带所述缺失的聚合酶的序列的第二个表达质粒。所述转染细胞表达产生“条件”缺损病毒粒子，该粒子仅在表达所述缺损基因组中不存在的聚合酶的细胞系中复制。所述缺损流感病毒粒子在合适但不互补的宿主动物或细胞中仅能复制一次。所述条件缺损病毒粒子意在用于疫苗用途或基因送递用途，所以有利地，所述病毒粒子制剂不能在正常细胞中复制并且不含有野生型或辅助病毒。

尽管已描述了(参见Duhaut & Dimmock，2003，同上)用于制备克隆的DI甲型流感病毒(已证明其在小鼠中仅有时具微弱保护作用)的原型系统，但是其并未提供制备进一步的实验室研究需要的必需量的克隆的DI病毒，更不用说执行动物和人临床试验或提供日常、流行或大流行状况的预防和/或治疗常规性需要的量的克隆的DI病毒的实践路径。

von Magnus，P.(1951a)Acta Pathol Microbiol Scand 28，250-277；vonMagnus，P.(1951b)Acta Pathol Microbiol Scand 28，278-293；von Magnus，P.(1951c)Acta Pathol Microbiol Scand 29，157-181；和von Magnus，P.(1954)Adv Virus Res 21，59-79均描述了通过用“稀释10^-6的尿囊液”接种含胚鸡卵制备的标准(即感染性)A/PR8(H1N1)病毒。在von Magnus(1951a)的第158页，不完整病毒(即DI病毒)是通过使用“未稀释病毒的第1、2、3等代”进行“未稀释的尿囊液的连续传代”制备的，最多制备了4代。

Fazekas de St Groth，S.& Graham，D.M.(1954).“The production ofincomplete influenza virus particles among influenza strains.Experiments ineggs.”(流感毒株缺损流感病毒粒子的生产。卵中的实验。)Brit J Exp Path35，60-74。还有，von Magnus，P.(1965)“The in ovo production of incompletevirus by B/Lee and A/PR8 influenza viruses”(通过B/Lee和A/PR8流感病毒在卵内生产缺损病毒)，ArchVirol 17，414-423。这些参考文献描述了不完整(DI)B/Lee病毒在含胚鸡卵中的生产。生产通常需要6或更多代的未稀释病毒。

Meier-Ewert，H.& Dimmock，N.J.(1970).“The role of theneuraminidase of the infecting virus in the generation of noninfectious(vonMagnus)interfering virus(感染病毒的神经氨酸酶在生产非感染性(vonMagnus)干扰病毒中的作用).”Virol 42，794-798。此参考文献描述了不完整(DI)A/Jap/305/57(H2N2)病毒的生产。表2显示病毒生产为什么需要3个连续的未稀释代。

Rott，R.& Schafer，W.(1960)“Untersunchungen uber diehamaggluttinierenden-nichtinfektiosen Teilchen der Influenza-Viren.I.DieErzeugung von′inkompletten Formen′beim Virus der klassischen Geflugelpest(v.Magnus Phanomen)”Zeitschrift fur Naturforschung 16b，310-321；和Carter，M.J.& Mahy，B.W.J.(1982).Arch Virol 71，12-25。这些参考文献描述了如何通过高多样性培养液，通常是未稀释病毒的连续传代生产不完整A/鸡瘟病毒(H7)。所述细胞培养液获自鸡胚成纤维细胞。

Huang，A.S.& Baltimore，D.(1970)“Defective viral particles and viraldisease processes(缺损病毒粒子和病毒性疾病过程)”Nature(Lond)226，325-327。此综述文章在第325页描述了裂谷热病毒、水泡性口炎病毒、鸡瘟病毒、猿猴病毒40、多瘤病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒、猿猴病毒5和脊髓灰质炎病毒如何通过具有高多样性感染的细胞或动物组织(或未稀释代病毒)合成DI粒子。

Holland，J.J.(1990a)“Defective viral genomes(缺损病毒基因组)”，Virology(病毒学)，第二版，第151-165页.B.N.Fields & D.M.Knipe编，New York：Raven Press。此综述文章在第155页描述了为什么病毒在细胞培养物(或卵或动物)中的连续未稀释传代仍是选择用来生产任何病毒的DI粒子的方法。

Holland，J.J.(1990b)“Generation and replication of defective viralgenomes(缺损病毒基因组的产生和复制)”，Virology(病毒学)，第二版，第77-99页.B.N.Fields & D.M.Knipe编，New York：Raven Press。参照图2，此章节说明了为什么直到第四(未稀释病毒)代才显示DI粒子条带。

综述文章Nayak，D.P.，Chambers，T.M.& Akkina，R.K.(1985)“Defective-interfering(DI)RNAs of influenza viruses：origin，structure，expression and interference(流感病毒的缺损干扰(DI)RNA：来源、结构、表达和干扰)”Curr Topics Microbiol Immunol 114，103-151证明了通过病毒的连续独立未稀释传代的DI病毒的生产。

在细胞培养物中生产克隆的DI甲型流感病毒不能提供足量的克隆的病毒供实际应用。本发明试图解决的一个问题就是如何为体内研究和药物用途生产足量的病毒。

发明人曾试图通过在含胚鸡卵中传代生产克隆的DI甲型流感病毒，但是得到的DI病毒产量太低。因此，本发明试图解决的一个问题就是如何通过在含胚卵中传代生产足量的克隆的DI甲型流感病毒。

发明内容

因此，本发明提供生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)(i)将一小份(aliquot)低于100μl的转染细胞培养基质导入含胚卵；或(ii)取一小份所述转染细胞培养基质，减少该小份中的病毒粒子的数量或浓度，然后将所述小份的至少一部分导入含胚卵；或(iii)将含有低于4 x 10⁹个拷贝的RNA缺失区段的转染细胞培养基质导入含胚卵；和(d)将所述卵孵育一段时间；和(e)从所述卵中回收病毒材料。

本发明还提供生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)取一小份所述转染细胞培养基质；(d)将所述小份的至少一部分导入含胚卵；(e)将所述卵孵育一段时间；(f)(i)将一小份取自孵育卵的低于100μl的病毒材料导入另一含胚卵；或(ii)从所述孵育卵中回收一小份病毒材料，减少该小份中的病毒粒子的数量或浓度，将所述小份的至少一部分导入另一含胚卵；或(iii)将取自所述孵育卵的含有低于4x 10⁹个拷贝的RNA缺失区段的病毒材料导入另一含胚卵；(g)将另一卵孵育一段时间；和(h)从所述卵中回收病毒材料。

本发明还提供生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)将转染细胞培养基质的至少一部分导入至少10个含胚卵；(d)将至少一部分所述卵孵育一段时间；和(f)从至少一个孵育卵中回收病毒材料。

本发明进一步提供生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)取一小份所述转染细胞培养基质；(d)将所述小份的至少一部分导入含胚卵；(e)将所述卵孵育一段时间；(f)将至少一部分来自孵育卵的病毒材料导入至少10个另外的含胚卵；(g)将另外的卵孵育一段时间；和(h)从至少一个卵中回收病毒材料。

本发明进一步提供将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：(a)将不超过4 x 10⁹个拷贝的克隆的DI甲型流感基因组导入含胚卵；(b)将所述卵孵育一段时间；和(d)从所述卵中回收病毒材料。

对于所有前述的本发明生产克隆的DI甲型流感病毒或将其传代的方法，优选将至少1 x 10⁷个拷贝的克隆的DI甲型流感基因组导入含胚卵。克隆的DI甲型流感粒子、基因组或缺失的RNA区段各自的优选范围是1 x10⁷至4 x 10⁹。在其它优选的方面，使用不超过3 x 10⁹、2 x 10⁹、1 x 10⁹、9 x 10⁸、8 x 10⁸、7 x 10⁸、6 x 10⁸、5 x 10⁸、4 x 10⁸、3 x 10⁸、2 x 10⁸、1 x 10⁸、9 x 10⁷、8 x 10⁷、7 x 10⁷、6 x 10⁷5 x 10⁷、4 x 10⁷、3 x 10⁷或2 x 10⁷个粒子、基因组或缺失的区段。

在进一步优选的方面，使用至少3 x 10⁹、2 x 10⁹、1 x 10⁹、9 x 10⁸、8 x 10⁸、7 x 10⁸、6 x 10⁸、5 x 10⁸、4 x 10⁸、3 x 10⁸、2 x 10⁸、1 x 10⁸、9 x 10⁷、8 x 10⁷、7 x 10⁷、6 x 10⁷5 x 10⁷、4 x 10⁷、3 x 10⁷或2 x 10⁷个粒子、基因组或缺失的区段，遵循上述关于粒子、基因组或缺失的区段的上限的列表。

发明人发现需要向含胚卵接种减少10倍、优选地减少100倍、甚至减少1000倍的病毒材料(与本领域现有的教导相比)以生产实践量的克隆的DI甲型流感病毒。

本发明还提供将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：(a)将已知或疑似含有克隆的DI甲型流感病毒粒子的小份导入含胚卵，其中引入的小份的体积低于100μl；(b)将所述卵孵育一段时间；和(c)从所述卵中回收病毒材料。

本发明进一步提供将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：(a)将已知或疑似含有克隆的DI甲型流感病毒粒子的小份导入至少10个含胚卵；(b)将至少一部分所述卵孵育一段时间；和(c)从至少一个孵育卵中回收病毒材料。

本发明此外还提供将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：(a)减少已知或疑似含有克隆的DI甲型病毒粒子的小份中的病毒数量或浓度；(b)将所述小份的至少一部分导入含胚卵；(c)将所述卵孵育一段时间；和(d)从所述卵中回收病毒材料。

在上文描述的相关实施方案中，可以使用低于100μl的培养基质小份(或从卵中获得的小份)，优选地体积范围为0.1-100μl。

所述小份体积更优选地低于50μl、更优选地低于10μl。甚至可以使用低于1μl或低于0.1μl的更小的小份体积。

本发明包括小份体积在0.05μl-10μl；0.1μl-100μl；10-100μl；0.1μl-10μl；0.1μl-20μl或0.1μl-50μl范围内。

将整个稀释小份或至少一部分稀释小份导入含胚卵之前，所述低于100μl的培养基质小份(或卵小份)，或如上文进一步确定的小份可进行稀释。

总之，使用低于100μl体积(如上文进一步确定的)的培养基质(或卵)小份得到了所述含胚卵的接种物，其中所述接种物中存在减少数量或浓度的病毒粒子。“减少”表示相对于本领域通常遇到的在含胚卵中将病毒传代的接种物的使用体积，例如大于100μl，通常1ml-2ml的病毒粒子的数量和/或浓度减少。

惊人的是，本发明通过使向多个含胚卵中接种转染细胞培养基质成为可能，提供了生产大量克隆的DI病毒的解决方法。

另一方面，本发明所述方法包含生产克隆的DI流感病毒，所述方法包括(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)将转染细胞培养基质的至少一部分导入至少10个含胚卵，(d)将至少一部分所述卵孵育一段时间；和(f)从至少一个孵育卵中回收病毒材料。

所述转染细胞培养基质通常处于0.1μl-100μl范围。依据本发明，这些体积可在多于10个含胚卵中进行分配。

在优选的实施方案中，所述转染细胞培养基质在多于10、优选地多于25、任选地多于50个卵中进行分配。

在一次转染细胞培养中，可以使用培养基质接种最多100、150、200、250、500、1000、2000、5000或更多个卵。因此，本发明开拓了为用于研究和药学/兽医应用生产大量克隆的DI甲型流感病毒的领域。

可能有多代，其中从卵中回收DI病毒材料之后，所述病毒的培养或传代重复一次或多次。为了产生必需量的克隆的DI病毒，卵中的代数可为3、4或5。

在其中将病毒材料导入卵中之前存在减少病毒粒子的数量或浓度的步骤的前述方法中，此步骤可在两个或多个代，任选地在含胚卵的每一代中发生。

除了使用特异性探针和/或引物测量DI甲型流感病毒粒子之外，培养基质中的DI甲型流感病毒材料的量可通过总病毒粒子，即包括存在的任何辅助病毒的数量或浓度反映。

在将病毒在已知含有或疑似含有克隆的DI病毒粒子的小份中进行传代的方法之前，可预先通过将已知或疑似含有所述克隆的病毒的起始材料导入含胚卵，然后将所述卵孵育一段时间获得相关小份。因此，在某些实施方案中并不需要验证样品实际含有克隆的DI甲型流感病毒；可对起始小份盲目执行传代，结果会确定所述接种物中是否存在克隆的DI甲型流感病毒。

上述起始材料优选地获自转染细胞培养物。所述细胞优选地为Vero细胞、更优选地HEK293T细胞+MDCK细胞。

在上文描述的传代方法中，可存在一个或多个进一步的代，其中回收的病毒材料被导入含胚卵，所述卵孵育一段时间，然后从所述卵回收进一步的病毒材料。

可执行一次或多次传代，其中卵的接种和孵育重复一次或多次。

在上文描述的各种方法中，均可通过稀释降低病毒粒子的浓度。所述稀释可为至少1/2，优选地至少1/10、更优选地至少1/100、甚至更优选地至少1/1000。其它优选的稀释可包括，例如，1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/20、1/25、1/30、1/35、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/2000、1/3000、1/4000、1/5000或1/10,000。可执行连续稀释，例如在1/2稀释后进行1/10稀释。任选地，可以取一小份第一次稀释液，然后对该小份进行第二次稀释。

可选地，可通过在稀释(如上文描述的)后取出所得稀释体积的至少一部分来减少病毒粒子的数量。然后可将此后一部分或小份扩大至需要的体积。

稀释步骤可用于实现缓冲液的交换或溶液组分的改变。

通过本发明方法生产的病毒粒子制剂的感染性按本领域已知的通过使用噬菌斑测定滴定(MDCK细胞，琼脂，标准程序)确定。本发明DI甲型流感病毒制剂优选地具有低于10⁶噬斑形成单位/HA单位，并可具有低至10⁵、10⁴、10³或10²噬斑形成单位/HA单位。

DI病毒制剂中存在的病毒的总量可附加地或独立地通过使用鸡红细胞(例如获自Serotech或其它商业供应商)进行标准血凝(HA)试验确定。一小份减少浓度或数量的本发明DI病毒粒子可含有不超过约400HA单位、优选地不超过约100HA单位、更优选地不超过约40HA单位。在其它优选的实施方案中，本发明方法中使用的一小份DI甲型流感病毒粒子可具有低于10²HA单位，包括低于99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1HA单位。低于10¹、10²、10³或10⁴HA单位的小份也属于本发明范围。

所述克隆的DI甲型流感病毒可以是制剂形式，其中所述制剂的所有病毒粒子中至少75％、优选地至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％具有遗传同一性。

发明人发现依据本发明制备的克隆的DI甲型流感病毒制剂包含最多99.9％的具有缺失的RNA区段的病毒，剩余的则由天然存在的或野生型(辅助)病毒构成。所述制剂可包含最多99.8％、99.7％、99.6％、99.5％、99.4％、99.3％、99.2％、99.1％、99％、95％、90％、85％或80％的克隆的DI甲型流感病毒(病毒粒子或基因组总计)。

在优选的实施方案中，所述制剂中的几乎所有DI甲型流感病毒粒子都具有遗传同一性、更优选地所有DI病毒粒子都具有遗传同一性。

本发明的克隆的DI流感病毒优选地包含8个RNA区段，其中至少一个所述区段具有缺失。所述缺失可造成所有编码表面抗原的基因全部或部分被缺失。在其它方面，聚合酶基因全部或部分被缺失。

所述病毒制剂的小份可用紫外线照射以灭活至少一部分该小份中存在的感染性甲型流感病毒(即辅助病毒)。需要的照射量预期与该小份中存在的感染性病毒的量成比例。紫外线针对RNA。一般而言，低剂量的紫外照射即足够。可校准紫外灯，以达到每4秒灭活1 log₁₀流感病毒感染性。因此，在约10厘米的距离和2毫米的样品深度，使用8瓦灯执行5秒至3分钟、优选地10秒至2分钟、更优选地30秒至90秒范围内的紫外照射(253.7nm)。紫外照射优选地将通过本发明方法生产的DI甲型流感病毒制剂的感染性降至低于10⁶PFU/HA单位、优选地低于10⁵、10⁴、10³或10²PFU/HA单位的水平。

完全灭活包括DI病毒RNA的所有病毒RNA可通过紫外照射约8分钟、任选地4分钟实现。

本发明还提供用作药物的克隆的DI甲型流感病毒。所述药物优选地为抗病毒剂。发明人发现所述克隆的DI甲型流感病毒具有抗病毒剂作用。而且，所述抗病毒作用是普遍针对甲型流感的所有毒株或亚型。因此，所施用的克隆的DI甲型流感病毒可以是与人员天然采集的甲型流感病毒相同或不同的亚型。因为所述药物的抗病毒效应不是基于免疫学(尽管发明人也发现次级免疫响应)，所以不需要佐剂。所述抗病毒作用是即时的，对其施用的个体是保护性的。此外也不需要施用辅助病毒。施用的本发明克隆的DI甲型流感病毒在其施用的受治疗者体内具有显著的半衰期。再施用可在最多一周、两周、三周或一个月以后进行，以恢复潜在的保护效应(使用相同或不同亚型的天然存在的甲型流感病毒感染个体产生的保护效应)。

不希望受任何特定理论的限制，发明人认为本发明克隆的DI甲型流感病毒中任何亚型的天然存在的或野生型甲型流感病毒的存在，造成缺损区段的互补，所以所述DI流感病毒可以利用所述天然或野生型病毒在宿主细胞中复制。结果是所述天然或野生型病毒的毒力降低，允许机体有时间发动针对所述天然或野生型病毒的有效免疫反应。因此，本发明克隆的DI甲型流感病毒不是疫苗，而是针对甲型流感各亚型的通用的干扰性抗病毒剂。

在另一方面，本发明包括可通过本发明所述的任何方法获得的克隆的DI甲型流感病毒的用途。

克隆的DI甲型流感病毒用于生产预防或治疗个体内相同或不同亚型的甲型流感的抗病毒药物。

在进一步的方面，本发明包括克隆的DI甲型流感病毒用于生产将个体内的毒性甲型流感病毒感染转化为无毒感染的药物的用途。甲型流感的毒性毒株可以是任何类型，无论是人、动物或禽类毒株。

本发明有利地提供克隆的DI甲型流感病毒用于生产在感染或疑似感染甲型流感的个体内提供即时和非免疫保护效应的药物的用途。

因此，发明人提供基于能够在任何宿主内抵抗任何甲型流感病毒的天然存在的干扰缺损流感RNA的抗病毒剂。此已知序列的所谓的“保护性RNA”优选地包壳为病毒粒子，并且优选地通过鼻内施用至呼吸道的细胞，感染性流感病毒天然靶向所述细胞。小剂量的发明人所谓的“保护性病毒”(即克隆的DI病毒)在小鼠内表现出针对致死的流感感染的强烈预防保护，并产生治疗效益。保护性病毒将为对抗人流感，特别是当病毒毒株未知或对抗病毒药物具有抗性时，提供重要选择。

发明人已制备了含有单个显性缺损RNA的病毒制剂。这些克隆的DI病毒制剂，也称为“保护性病毒”制剂以区分其和培养细胞中的‘干扰性病毒’活性，具有保护动物，包括人，免受甲型流感病毒严重感染的能力。在一些实施方案中，发明人制备了在小鼠内针对甲型流感病毒的预防活性比非克隆的DI病毒多约50倍的“保护性病毒”。所述“保护性病毒”制剂提供治疗效益。

“保护性病毒”RNA序列有利地允许检查批真实性、测量比活性和确定具体保护性RNA的作用机制。

保护性病毒的一个主要优势是其预期可以作用于甲型流感病毒的任何亚型或毒株。由于活性成分，即保护性RNA，与基因组RNA使用相同的复制机器这一作用机制，因此不可能产生对保护性病毒具有抗性的病毒。

因此，优点是可以治疗已知或疑似感染甲型流感病毒的个体的感染，即使尚未观察到感染症状，或诊断到感染。怀疑感染时即可尽快向个体施用克隆的DI甲型流感药物。个体还可以在与已知或疑似感染甲型流感的相同或不同物种的其它个体接触后很快被感染。有利地，保护被认为不涉及免疫反应，是通过单独施用所述克隆的DI病毒药物实现的，而无需施用辅助病毒。因此，所述克隆的DI病毒无需像常规疫苗(其依赖于免疫反应以产生保护效应)那样在感染之前施用。

本发明药物可作为预防施用至个体。例如，医务人员和工作中接触动物或禽类(死亡或存活)的人员和有接触甲型流感病毒危险的人员。

在进一步的方面，本发明包括克隆的DI甲型流感病毒用于生产对个体进行针对甲型流感的免疫的药物的用途，其中所述药物进一步包含至少一个甲型流感的活毒株并且所述药物适合将所述DI甲型流感病毒与所述活(辅助)毒株单独、同时或顺序施用。所述辅助毒株可以是任何类型的甲型流感病毒，无论是来自人、动物或禽类。

发明人公开克隆的DI甲型流感病毒能够与辅助病毒一起充当针对甲型流感病毒特定毒株的疫苗。同时，施用克隆的DI甲型流感病毒还具有抗病毒效应。

因此，本发明提供对个体进行针对甲型流感病毒毒株的免疫并同时治疗所述个体由甲型流感病毒的任何毒株引起的感染的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI病毒和活的甲型流感病毒。

而且，本发明提供克隆的DI甲型流感病毒生产进一步包含活的甲型流感病毒毒株的药物的用途，其中所述药物是针对所述流感病毒毒株的疫苗和针对流感病毒的任何毒株的抗病毒剂。

在优选的实施方案中，所述药物鼻内施用。其它施用路径可包括粘膜、肺和口腔。其它路径包括经过口服的胃肠施用。

可为其施用所述药物的个体可以是动物或人，优选地其中所述动物选自猪、马、狗、猫或禽类(野生或驯化的)。

对于禽类(无论是野生或驯化)，所述药物可经过口服(oral tract)方便地施用，例如将所述药物掺入饮用水中或食物中。对于禽类物种，优选的驯化物种包括，例如，鸭、鹅、火鸡或鸡，例如肉鸡。

所述药物抵抗任何异源甲型流感病毒，而不仅是与所述克隆的DI病毒同源的类型。

剂量方案可由单次剂量的药物组成。有利地，可以安排所述剂量的施用时间，以在可能感染甲型流感病毒之前允许最多约8周的时间。本发明提供的预防期可在0-6周、0-5周、0-4周、0-3周、0-2周或0-1周范围内。可延长至高达12周或更长。

在其需要同时、单独或顺序施用至少一个甲型流感的活毒株的药物中，所述毒株可以是任何天然存在的甲型流感毒株。例如，甲型流感的活毒株可选自H1N1、H2N2、H3N2、H3N8或H5N1。

所述药物中克隆的DI甲型流感病毒的量在每剂量0.05-500 HAU范围内，优选地选自0.1-100、0.5-50或1-10 HAU的范围内。其它可能的范围包括0.05-10 HAU、0.1-50 HAU和1-100 HAU。不过，因为存在辅助病毒，所以测量的HAU值表示辅助和克隆的DI病毒二者HA单位的和。

所述药物中克隆的DI甲型流感病毒的量可通过定量RT-PCR测量。使用对所述缺失的RNA区段特异的探针和/或引物。

所述药物中克隆的DI甲型流感病毒的量可大约是(每剂量)1ng-1μg病毒(根据总病毒蛋白测量)数量级。DI病毒的量可在0.05μg-0.5μg、任选地0.1μg-0.5μg范围内。优选的实施方案包括0.01-0.1μg或0.01-1μg病毒蛋白、更优选地10ng、100ng或1μg病毒蛋白。病毒蛋白的量同时包括辅助病毒和克隆的DI病毒。

克隆的DI甲型流感病毒的量(无论是根据HAU或每剂量的μg病毒蛋白测量)可根据受治疗者而变化。例如，马可能需要4x人剂量，而禽可能需要1/10的人剂量。

与其衍生自的基因组区段相比，克隆的DI甲型流感病毒中的缺损RNA具有至少一个缺失，尽管区段1可缺失多个部分。所述缺失可被多个连续的核苷酸分开。

包括所述缺失的基因组区段的5′和3′端优选地是完整的。在更优选的实施方案中，所述区段是区段1。

缺失的影响是所述病毒粒子RNA区段的5′端具有至少150、200或220个核苷酸。优选地所述区段的5′端具有的核苷酸的数量在150-500、更优选地150-250或150-220范围内。

至于3′端，剩余(未缺失)部分包含至少20、50、100、200、300、400或500个核苷酸。区段1的3′端可具有的(未缺失)核苷酸的数量在20-600、30-550、40-500、50-450、60-400或75-250范围内。

所述区段缺失可以是至少50％的核苷酸、优选地至少75％、更优选地至少80％的核苷酸。为了实现所述RNA区段的有效缺失，可缺失至少一个核苷酸。在更优选的实施方案中，所述缺失可由至少3、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、3000或5000个核苷酸、优选地连续核苷酸组成。同一RNA区段内可具有多个缺失。

本发明克隆的DI甲型流感病毒的基因组区段1的核苷酸序列可包含：

(a)选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列，或：(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少75％同一性的核酸序列；

(c)在严格条件下与上文(a)或(b)杂交的序列的互补序列。

优选地所述克隆的DI甲型流感病毒基因组区段1的序列与SEQ IDNO：1具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地99％同一性。

在另一优选的实施方案中，所述序列与SEQ ID NO：1具有大于96％的同一性。

基因组区段1的核苷酸序列可包含在所述核苷酸序列的一个或多个位置处的一个或多个核苷酸插入。

在优选的实施方案中，基因组区段1的核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

因此，本发明提供包含如前文所述的克隆的DI甲型流感病毒的药物组合物。

适合施用的本发明药物组合物包含无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液形式的DI甲型流感病毒，任选地辅助病毒。所述组合物可进一步包含本领域已知的助剂或赋形剂，参见，例如Berkow等，The Merck Manual(默克手册)，第16版，Merck & Co.，Rahman，NJ(1992)，Avery′s DrugTreatment：Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics(艾氏药物治疗：临床药理学和治疗原理和实践)，第三版，ADIS Press，Ltd.，Williams和Wilkins，Baltimore，MD(1987)& Osol(编)，Remington′sPharmaceutical Sciences(雷氏药物科学)，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1324-1341(1980)。本发明组合物优选地呈现为个体剂量(单位剂量)。

一般而言，口服施用的液体剂量形式可包含含有所述液体剂量形式的脂质体溶液。悬浮脂质体的合适形式包括含有本领域常用惰性稀释剂，例如纯净水的乳液、悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。除了惰性稀释剂以外，示例性组合物还可包括佐剂、湿润剂、乳化和悬浮剂，或增甜、调味或增香剂。

当本发明组合物或药物用于施用至个体时，其可进一步包含盐、缓冲液或增强所述组合物效力所需的其它物质。

优选的组合物或药物是用于粘膜递送。在可用的各种粘膜递送选择中，鼻内路径是最实用的，因为其使用已批量生产的相对简单的设备提供轻松的用药。因此，本发明组合物优选地适合和/或包装为鼻内施用，如鼻腔喷雾剂、滴鼻剂、凝胶或粉末(参见Almeida & Alpar(1996)J.DrugTargeting & Agarwal & Mishra(1999)Indian J.Exp.Biol.37：6-16.)。

粘膜递送的其它可能路径包括口腔、胃内、肺和肠内。本发明组合物可适合和/或包装为粘膜施用(例如参见Walker(1994)Vaccine 12：387-400，Clements(1997)Nature Biotech.15：622-623 & McGhee等(1992)Vaccine10：75-88)。对于口服施用，可提供片剂或胶囊(任选地肠溶包衣的)。任选地，液体、转基因植物材料、滴剂、吸器、气雾剂、肠溶剂、栓剂、阴道栓剂等(参见Michetti(1998)J.Gastroenterol.[Suppl X]：66-68和Vaccinedesign：the subunit and adjuvant approach(疫苗设计：组分和佐剂方法)的第17章，Powell &Newman编，Plenum Press 1995)。

无论递送路径如何，本发明组合物或药物优选地是单位剂量形式。可常规建立有效剂量。例如，所述组合物用于注射或鼻内使用的典型的人剂量的体积为0.1-0.5ml，例如两次100μl喷雾，每个鼻孔一次。

本发明组合物优选地是无菌的和优选地不是热原性的。在较高浓度下，DI甲型流感病毒组合物可是热原性的或显示出残留热原活性。其优选地缓冲为，例如在pH 6.5和pH 8之间，一般而言，pH 7左右。

WO2006/041819(Medimmune)描述了鼻部施用的有利形式。

因此，本发明包括在受治疗者中预防或治疗甲型流感的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子。

所述克隆的DI甲型流感病毒粒子优选地在所述受治疗者中具有抗病毒效应。在其它方面，克隆的DI甲型流感病毒的施用优选地提供获得性甲型流感感染的即时保护效应。

附加地或可选地，感染所述受治疗者的甲型流感病毒与施用的DI甲型流感病毒粒子是相同或不同的亚型。

本发明还包括将感染受治疗者的毒性甲型流感病毒转化为无毒的病毒感染的方法，所述方法包括为所述受治疗者施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒。

本发明进一步提供对受治疗者进行针对甲型流感病毒的免疫的方法，所述方法包括为所述受治疗者施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒和感染量的至少一个甲型流感毒株的活病毒。所述活病毒充当辅助病毒。

所述克隆的DI甲型流感病毒粒子和所述活病毒可以单独、同时或顺序施用。

本发明进一步提供将感染受治疗者的毒性甲型流感病毒转化为无毒的病毒感染并对所述受治疗者进行针对所述感染病毒的免疫的方法，所述方法包括为所述受治疗者施用克隆的DI甲型流感病毒。

所述受治疗者可感染或可疑似感染甲型流感病毒。在实际或甚至疑似感染的情况下，可在所述个体感染或疑似感染后48小时内，优选地24小时内尽快施用克隆的DI病毒。相似地，如果个体很快要接触甲型流感病毒，无论是感染的人、动物或禽类，他们可施用所述克隆的DI病毒作为预防措施。需要与已知或疑似感染甲型流感的动物或禽类屠体或人尸体接触的人可施用本发明克隆的DI病毒。此类人员可在接触甲型流感病毒风险之前，临时施用本发明药物作为预防。

在上文描述的本发明的每种方法中，施用的克隆的DI病毒是足量的。所述辅助病毒可以是任何甲型流感毒株，无论是来自人或其它动物，包括禽类。

在另一方面，本发明提供包含如下序列的核酸分子：

(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；或

(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有大于96％的同一性的核苷酸序列；或

(c)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2在严格条件下杂交的核苷酸序列；或

(d)与序列(a)、(b)或(c)中的任一个互补的核苷酸序列。

所述核苷酸序列可与SEQ ID NO：1具有大于96.5、97、97.5、98、98.5、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9％的同一性。

本发明还包括包含上文所述核酸分子的组合物。

所述核酸优选地是RNA，尽管在遗传操作程序中可能会使用DNA。

本发明还提供包含本文所述核酸的载体或质粒。载体可包括可操作连接至本发明核酸，任选地转录终止序列的启动子。本发明核酸可位于所述启动子的正义或反义方向。

发现掺入甲型流感病毒粒子的本发明核酸有利地显示出比其它克隆的DI病毒，例如317/Vic或220/PR8，更强的针对甲型流感的保护效应。(参见Duhaut & Dimmock，2003，J.Virol.Methods 108：7582)。本发明优选的克隆的DI病毒显示出至少10倍、更优选地至少100倍更强的针对甲型流感的保护活性。在其它优选的实施方案中，所述保护在8至500倍范围内，更优选地50至250倍保护。

可使用任何感染性甲型流感病毒致死性攻击在合适的动物，例如小鼠、雪貂体内建立保护效应。

当单独施用(无感染性辅助病毒)或其可包括与辅助病毒(其可以是同源/异源)，也可以是与攻击病毒相同的毒株合用时，所述保护效应可以是本发明克隆的DI病毒的预防效应。

本发明进一步包括包含至少一部分本文所述核酸序列的引物或探针核酸分子。

已知的针对流感的免疫方法依赖于刺激机体的免疫系统，以便白细胞产生连接至微生物表面的抗体和启动杀伤所述微生物的过程。这对许多疾病，如天花、脊髓灰质炎和麻疹作用良好，但是对流感的效果就差很多，这是因为流感病毒的外壳在持续变化。针对一个流感毒株，例如H3N2的免疫对另一毒株，如H5N1完全无效。这在出现新的大流行毒株时尤其成为问题，因为所有现有疫苗可能都完全无效。

在公共卫生和医学环境中，本发明DI病毒也被称为“保护性病毒”。所述保护性病毒保护动物抵抗各种流感毒株，并提供针对所有甲型流感感染，包括H5N1和感染人的任何新的大流行或流行毒株的保护作用。所述保护性病毒通过将流感感染速率降低至把有害感染变为针对该流感形式的疫苗的程度，提供即时的保护和完全阻止流感症状的发展。它还可以对抗实际的感染，和如果在首次感染后达24小时和更长时间内提供时，提供保护作用。

在本发明优选的实施方案中，当施用至人、动物或禽类时，所述病毒的8个RNA链之一的RNA的约80％的特异性缺失提供针对所述病毒的保护作用。“保护性病毒”提供即时的流感保护和将流感感染转化为它们自身的疫苗。

缺失使所述保护性病毒变得无害，并阻止其在细胞内通过自身进行复制，以便它不能像正常流感病毒一样传播。不过，如果其是由另一流感病毒引入细胞，其保留其无害性质，但是将开始复制，并且其速度远远大于所述新的流感病毒。此由所述新的流感感染刺激的快速复制意味着新的侵入流感病毒被所述“保护性病毒”有效包围。这极大地降低了所述新感染的进程，阻止了流感症状，并使机体有时间形成针对所述新的有害入侵者的免疫反应。所述保护性病毒有效地将所述毒性病毒转化为无害的活疫苗。

无论何种流感毒株感染个体，所述“保护性病毒”均具有相同的有益效应。实验结果证实了这一优点。这是因为病毒的外壳与所述保护过程无关，所述效应作用于细胞内部的病毒基因。因此，所述保护性病毒代表了对抗任何新的病毒毒株以及现有毒株传播时高度有效的工具。可将其作为预防措施而无需根据特定流感毒株或突变进行改变。这在处理大流行的突然爆发时具有显而易见的效益，因为在部署所述保护性病毒时人们无需知道所述新毒株的精确组成，使其比仅对特定的现有病毒毒株有效的疫苗有效得多。

此外，其保护是即时的，而由常规的流感疫苗接种产生的保护需要2-3周才能完全有效。实验显示单一剂量的保护性病毒可在感染流感病毒前6周给予而有效。相对于抗病毒药物仅给予低于24小时的保护，这具有明显的优点。另一个优点是流感病毒未显示出对“保护性病毒”产生抗性。

在感染后达24小时和更长时给予“保护性病毒”，其也具有保护作用。因此，其能对抗实际的感染。因此，其也可用作对感染个体的家属或其它直接接触者的治疗。

“保护性病毒”易于施用，因为其与任何其它流感病毒靶向相同的细胞和使用相同的方法进入所述细胞。含有所述保护性病毒的生理盐水滴可简单地喷入鼻中。已用于一些疫苗的气雾剂施用提供了另一种简单的施用路径。

所述保护性病毒为驯化动物提供有用的治疗。鸭具有肠道感染，鸡有联合的肠道和呼吸感染。可通过将所述保护性病毒加入它们的饮用水中而简单地递送至它们。一次剂量可为鸡提供，例如，至少一周的保护。

流感是赛马产业和家马的大问题。其最近也已成为美国家犬的问题，家猫易感染H5N1病毒。

在小鼠和雪貂模型中，鼻内施用克隆的DI流感病毒(即“保护性病毒”)具有针对强烈的感染性病毒攻击的优良的预防活性，雪貂模型接近地模拟人疾病。目前为止，最佳的DI病毒(244/PR8)的活性是任何非克隆的DI病毒的约50倍(Noble等，2004 Vacane 22：3018-3025)，并且其保护小鼠的时间远远长于非克隆的DI病毒。此外，仅有克隆的和因此的DI病毒具有治疗活性，很可能是其具有较高的总体活性作用的结果。

当归一化为总HAU时，不同的克隆的DI病毒的抗病毒活性强度有很大差异。

天然不复制的或紫外照射的感染性病毒中存在的缺损RNA或HA基因持续存在于培养细胞中(Cane等1987，Virology 159：259-264；Cane &Dimmock，1990 Virology 175：385-390)，但是克隆的DI“保护”RNA在体内的持续是未预料到的。一般而言，不认为甲型流感病毒RNA持续存在于免疫活性动物中。

因为非克隆的DI病毒群体含有各种各样的缺损RNA，所以尚无法确定作用的分子模式。不希望受任何特定理论的束缚，发明人认为一个可能是RNA基因组的复制与其大小成比例，所以小5倍的保护性RNA的复制速度快5倍。因此，从细胞中有相等数量的缺损和感染性基因组开始，经4和6轮复制之后，将分别有90和99％的基因组是缺损的。在这些情况下，假定流感RNA包装是有组织的过程，并且所述缺损RNA和其全长对等物以相同的效率包装，大部分子代粒子将含有缺损RNA和是非感染性的。除了此感染性子代的减少之外，缺损病毒粒子将把保护性RNA传播至相邻细胞和使它们抗感染。缺损RNA还可与其非缺损对等物竞争有限量的病毒或细胞组分，诱导α/β干扰素，或从缺损RNA形成siRNA-尽管已知后者仅在植物系统中发生。所述机制确实可能具有一致作用。

保护浓度的克隆的和非克隆的保护性病毒在小鼠和雪貂中削弱毒性病毒感染。不会产生临床疾病，但是产生足量的毒性病毒抗原以刺激获得性免疫应答，获得性免疫应答使这些动物对同源病毒的再感染免疫。与直觉相反，使用最高浓度的保护性病毒治疗后的免疫性最弱，推测是因为抗原形成被抑制到近似亚免疫原水平。

克隆的DI“保护性”病毒潜在地在对抗大流行流感方面提供多个相对于疫苗或现有药物的优点。流感疫苗的问题在于其对流行的病毒毒株精细的特异性。当出现新病毒时，选择新毒株、生产和测试疫苗和将其分配和施用至大量人群可耗费数个月至一年的时间。完全的疫苗诱导的免疫性需要约3周的成熟时间，而老年人可能无法启动有效的免疫反应。与此相反，保护性病毒即时发挥其完全效应，而且应对甲型流感的任何毒株都有活性。其活性存在于病毒基因组而不是宿主的基因组中，所以对老年人也有有效的保护。

抗病毒药物的一个主要限制是抗性产生的速度，已分离到对达菲抗性的人流感。不过，保护性RNA依赖于正常病毒的高度保守的复制机器，所以不可能产生抗性。

可使用抗原不同的辅助病毒给予后续剂量的保护性RNA。还必须选择大多数人群体没有免疫性和无毒的辅助病毒，如发明人使用的A/PR8(H1N1)病毒。

下面将参考具体实施例和附图对本发明进行详细描述，其中：

附图说明

图1显示本发明DI甲型流感病毒实例244/151PR8的核苷酸序列(SEQID NO：1)。所述序列是所述病毒粒子正义RNA的序列。

图2显示本发明优选的DI甲型流感病毒实例244/151PR8的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。所述序列是所述病毒粒子正义RNA的序列。

图3显示使用244保护性流感RNA表达质粒和表达感染性A/WSN的多个质粒转染293T细胞是如何抑制A/WSN病毒生产的。

图4显示保护性病毒244/PR8在小鼠中介导的针对感染性A/WSN的预防活性，通过临床疾病和体重变化监控。

图5显示244/PR8保护性病毒的预防活性的持续时间。

图6显示不存在感染性病毒时，保护性RNA244(395nt)在小鼠肺部的寿命，如使用引物RNA1F和RNA1R的RT-PCR所示。

具体实施方式

大多数DI甲型流感病毒具有一个内部缺失。关于命名，本文描述的克隆的DI病毒RNA的实例是：

RNA1_244/151/395_A/PR/8/34(H1N1)x A/PR/8/34(H1N1)。

因此：

(a)首个术语指其衍生自A/PR8/34(H1N1)病毒的RNA区段1的事实。

(b)下一个术语表示其包含来自在所述病毒粒子中发现的RNA 1的5′端的244nt和3′端的151nt，它们连接在一起形成395nt的连续的新RNA分子。

(c)末端术语指辅助病毒，A/PR8/34病毒。

(d)其缩写名称为244/151PR8。

对于对具有本领域平均水平的读者不明显的地方，下文描述的实验的具体实施例采用下列方法和程序：

克隆的DI病毒的制备

具体实施例中使用的方法在下文描述并接受变化，还参见上述Duhaut& Dimmock(2003)中描述的材料和方法。

用制备感染性A/PR8/34病毒(H1N1)必需的质粒组通过已知方法转染HEK293T细胞。

然后将所述转染细胞与MDCK细胞共培养以扩增感染性病毒。收集含有所述感染性病毒和存在的任何DI病毒的组织培养液，低速离心除去碎片，然后储存于-70℃。病毒的存在通过鸡红细胞的凝集显示(参见下文)。病毒的滴度记录为每毫升病毒的血凝单位(HAU)。

然后将组织培养液(500μl)注射入10日龄含胚鸡卵的尿囊腔，以加强感染性病毒的浓度并推断存在的DI病毒。卵在33℃孵育一天，然后在4℃冷藏过夜以杀死胚。然后通过标准方法从卵中收集尿囊液。

通过血凝确定病毒的量。含有病毒的尿囊液通过低速离心进行澄清和纯化(参见下文)。将病毒分成小份，按2 x 10⁵ HAU/ml的浓度储存于液氮中或-70℃。

初步测试(参见下文)显示此制剂保护小鼠免受A/WSN流感病毒的致死的鼻内攻击，从而产生DI RNA。

使用区段1特异性引物(参见下文)的RT-PCR显示A/PR8/34的RNA 1产生截短的RNA。随后的测序显示存在395核苷酸的主要的截短的RNA种类，并且其与A/PR8/34的RNA 1同源。此RNA命名为244/151PR8。

通过使用病毒和缺损RNA质粒共转染293T细胞并与MDCK细胞培育，生成了含有克隆的区段1缺损的RNA 220(H3N8)和317(H7N7)的病毒(Duhaut，S.D.& Dimmock，N.J.1998，Virology 248：241-253)。区段1的第三个确定的缺损RNA(244)是在A/PR8病毒质粒转染后自发形成的(参见下面的表1a)。

下面的表1a显示保护性流感RNA和其辅助病毒的衍生和命名。

表1a

缩写^a	缺损RNA^b	辅助病毒
缩写^a	缺损RNA^b	辅助病毒	220/PR8	RNA1_220/445_A/equine/Newmarket/7339/79(H3N8)	A/PR/8/34(H1N1)
220/Vic	同上	A/Victoria/3/75(H3N2)	220/PR8	RNA1_220/445_A/equine/Newmarket/7339/79(H3N8)	A/PR/8/34(H1N1)
220/Vic	同上	A/Victoria/3/75(H3N2)	317/Vic	RNA1_317/585_A/chicken/Dobson/27(H7N7)	A/Victoria/3/75(H3N2)
244/PR8	RNA1_244/395_A/PR/8/34(H1N1)	A/PR/8/34(H1N1)	317/Vic	RNA1_317/585_A/chicken/Dobson/27(H7N7)	A/Victoria/3/75(H3N2)
244/PR8	RNA1_244/395_A/PR/8/34(H1N1)	A/PR/8/34(H1N1)	244/WSN	同上	A/WS/33(N)(H1N1)

^a220，保护性RNA；PR8，辅助病毒。

^b从左至右表示：缺损病毒RNA的来源区段、反义RNA中的断点残基、核苷酸总数、病毒的来源。

所述DI病毒制剂中辅助病毒感染性的去除

通过定义，DI病毒贮液含有感染性辅助病毒。在接种要保护的动物之前，必须除去所述感染性。因此，将病毒置于塑料皿中，使其形成约1-2mm的层，在室温下用临界剂量(20秒)的紫外线照射。紫外照射靶向核酸(与大小成比例)，快速灭活辅助病毒的感染性。DI病毒RNA(395nt)及其活性未受到显著影响，因为其紫外靶向大小比所述感染性基因组(13,600nt)的小34倍。需要的紫外剂量通过在相同条件下测量A/PR8/34病毒的感染性的灭活速率确定。

紫外灭活辅助病毒之后，接种MDCK细胞，含胚卵和小鼠(鼻内，然后在含胚卵中培养肺部匀浆)显示无残留感染性(数据未显示)。延长紫外照射破坏缺损病毒的小鼠保护活性(参见下文)。

DI病毒的纯化

通过低速离心除去尿囊液中存在的碎片。然后将上清液置于约25毫米10％蔗糖分隔层之上进行高速离心。低密度杂质富集于蔗糖上，而病毒沉淀至离心管底部。将所述沉淀软化过夜后，将病毒按2 x 10⁵ HAU/ml重悬于PBS或含有0.1％ w/v牛血清白蛋白的PBS。然后将其分成小份，冻存于液氮中或-70℃。所有程序均在4℃执行。

传代的缺损病毒的真实性

预期的缺损RNA在最终的纯化病毒贮液(经过1次细胞和2次卵传代)中的存在通过使用末端引物和发生中央缺失后形成的独特连接序列的特异性引物的RT-PCR确定。最后通过测序鉴定RNA。使用区段特异性引物对244/PR8缺损病毒进行进一步分析，显示244是存在的主要RNA。

流感病毒的血凝分析

此分析基于如下事实：病毒表面存在的主要蛋白血凝素与鸡红细胞的病毒受体结合，而许多病毒可以将所述细胞连接在一起，造成它们的凝集。此分析与感染性无关，同时测量感染性和非感染性流感病毒。在塑料检测盘的孔中用生理盐水稀释剂对病毒进行连续2倍稀释，然后加入第10次稀释的鸡红细胞。完全混合后让红细胞沉淀。如果不存在病毒，红细胞沉淀在孔的底部形成小点；当存在病毒时，红细胞凝集并在孔的底部形成一薄层。病毒的滴度通过产生50％凝集的稀释液的内插确定。该分析的优点是其速度，红细胞在约45分钟内沉淀。该分析通常在室温下执行。

使用DI RNA保护小鼠免受流感

小鼠(C3H/He-mg：H-2^k株系)鼻内接种DI病毒，所述DI病毒已用紫外照射20秒以除去感染性辅助病毒的感染性。当所述DI病毒制剂单独接种于含胚鸡卵时，其不具感染性，并且对小鼠无可观察到的效应。小鼠为4至5周龄，体重16-20g。两种性别均使用，但是分开居住。对照组的性别相应匹配。使用醚轻度麻醉小鼠，和40μl DI病毒分用至两个鼻孔。

使用接受8分钟的延长紫外照射的DI病毒作为对照，研究所述DI病毒的任何刺激免疫系统或阻断受体的效应。这会灭活DI活性，但是不影响病毒表面存在的血凝素或神经氨酸酶蛋白的活性。

使用了两种感染性攻击病毒。将它们滴定至小鼠以确定引起相当的疾病的各自剂量。

小鼠接种物通常包含：

(a)活性、非感染性DI病毒，有时含有确定剂量的感染性攻击流感病毒。

(b)含有相同剂量感染性流感病毒的紫外杀伤的DI病毒。

(c)单独的活性DI病毒

(d)稀释剂。

发病率根据体重的减轻和通过临床标准评估。体重减轻可以是严重的，超过初始体重的25％。疾病进程定义为：

(a)健康小鼠

(b)不适，包括轻微竖毛、步态轻微改变和走动增加的临床迹象

(c)强烈竖毛、腹部收缩、步态改变、周期性静止、呼吸频率增加和有时罗音的临床迹象

(d)上述临床迹象，但是加强；同时显示几乎不活动，呈垂死状。当此类小鼠明确不能存活时，将其处死

(e)死亡。

测试的所有病毒引起相似的临床疾病。此外，尸体解剖显示，所有病毒引起相似的肺实变。

虽然任何一项所述临床迹象的检测是客观的观察，但是其表达的程度是主观的。不过根据经验，即使是轻微患病的小鼠也容易认出。流感致死的时间范围依赖于病毒剂量，但是典型的临床迹象在3-5天内开始，在另外2-4天内发展至死亡。非致死疾病的临床过程将更长。流感病毒毒株之间的毒力(即引起疾病需要的感染性病毒的量)存在差异，但是它们均产生相似的临床表现。自交小鼠毒株的易感性(即引起疾病需要的感染性病毒的量)存在差异，但是根据有限的数据，其疾病模式是相似的。C3H/He-mg小鼠是优选的易感毒株，其在大多数接种的动物中产生可重复的疾病。

作为疾病的客观测量，也对小鼠进行称重。使用体重仍在增加的4-5周龄(16-20g)的小鼠。小鼠体重增加约500mg/天。随着感染的发展，小鼠体重停止增加，然后开始减轻。这发生于它们显示疾病迹象(如上文的1b)之前约一天。小鼠成组称重，所述组通常包含5只小鼠或更多。因此，减轻2g(400mg/小鼠)左右很容易检测。小鼠在死亡/淘汰之前可失去总重量的最多25％，即20g小鼠将失去5g。

RT-PCR方案

使用Trizol试剂(Invitrogen)从病毒中提取RNA并溶解于100μl水。可选地，RNA是通过将一只小鼠的两个肺与无菌沙在4ml Trizol中研磨提取的。小份5μl总RNA(或200μl病毒的RNA)在20μl反应中42℃反转录1小时，使用与所述vRNA的3′末端互补的通用的甲型流感RNA 1特异性引物(RNA1F：5′AGCGAAAGCAGGTCAAATATA3′)。RNA1编码病毒复制酶的PB2蛋白组分。然后通过PCR扩增所述反转录反应小份(1.5μl)，所述PCR使用Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas或New England Biolabs)和与所述cRNA的3′末端互补的通用的特异性针对甲型流感病毒的RNA1，RNA1F和RNA1R的引物(5′AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTA3′，或特异性针对244 iRNA中的连接序列的引物244J(5′ATCCCCTCAGTCTTCTCCTG3′)在25μl反应体积进行。RNA1F与公布的PR8序列存在一个错配，而RNA1R与公布的PR8序列相同。PCR由30个循环(94℃，20s；50℃，30s和72℃，30s)组成。10μl小份通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

验证小鼠保护活性存在于RNA 244中

因为存在痕量其它缺损RNA，所以验证244/PR8在小鼠中的抗病毒活性存在于RNA 244，而不是244和另一缺损RNA联合作用非常重要。为此目的，将克隆的244 RNA转染至表达质粒和编码感染性A/WSN的质粒。在平行滴定中，得到的缺损244/WSN病毒具有与244/PR8相同的保护活性(完全的保护为每只小鼠100ng，比其它缺损病毒高至少10倍，参见下文的表15)，证实RNA 244负责预防(数据未显示)。这也证明了缺损RNA可以很容易地转移到辅助病毒。

确定的缺损病毒对小鼠具有针对感染性流感病毒的预防保护

小鼠鼻内接种缺损病毒或已用紫外照射毁坏其潜在保护活性的缺损病毒。后者保留完全的H和N活性，并充当免疫原性和细胞受体阻断的对照。在第一组实验中，小鼠同时接种了单一剂量的保护性病毒(400 HAU)和小鼠致病性感染性A/WSN。

图4显示小鼠中由保护性病毒244/PR8介导的针对感染性A/WSN的预防活性，如通过临床疾病和体重变化所监控。小鼠同时接受400(a、b、c)、40(d、e、f)和4 HAU(g、h、i)的244/PR8保护性病毒和10 LD₅₀A/WSN。该图显示临床评分(a、d、g)和体重变化(b、e、h)。括号内为存活百分比。符号指示窗格a、d、g中给出的接种物：■，灭活的保护性病毒+10 LD₅₀A/WSN；▲，保护性病毒+10 LD₅₀A/WSN；●，稀释剂。窗格c、f、i显示使用10,000 LD₅₀A/WSN，在所述第一次感染3周后进行攻击的存活者。因为最高剂量的保护性病毒针对此高剂量A/WSN不产生保护作用(未显示)，这测试了获得性免疫的形成。

接受紫外灭活的保护性病毒加A/WSN的小鼠经受体重减轻和临床疾病，并全部死亡(图4a、b)。这与单独接受感染性病毒的小鼠中的疾病一致(数据未显示)。相比之下，接受保护性病毒加A/WSN的小鼠像模拟感染的对照动物一样体重继续增加，并且未显示疾病迹象(图4a、b)。10倍稀释的保护性病毒(至40 HAU/小鼠)保持主要的临床疾病和死亡困境，尽管存在轻微的、短暂的体重减轻和一些不适，其在第10天得到解决(图4d、e)。最终，每只小鼠4 HAU的保护性病毒减缓了临床迹象和体重减轻的发作，将存活率从0增加至60％(图4g、h)。

相同最小剂量(40 HAU/小鼠)的244/PR8对4个独立制剂的感染性病毒攻击产生实质性保护，证明了保护性病毒生产和作用的可重复性。这相当于每只小鼠100ng病毒蛋白或400 x 10⁶个病毒粒子。所有制剂还对10ng保护性病毒产生显著的保护。按完全相同的方法生产、HAU归一化和测试含有2个不同的确定的区段1保护性RNA中的一个或另一个的三种其它的保护性病毒，其活性比244/PR8低10至100倍(参见下文的表15)。它们具有相对一致的抵抗A/PR8的能力，表明所述差异不是攻击病毒特异性的(数据未显示)。需要对每个制剂中的保护性RNA分子的数量进行RT-PCR定量，以确定保护性RNA的内在活性是否确实存在差异或其被特定辅助病毒复制或包装的效率。对于A/PR8或A/Vic辅助病毒，RNA 220的保护活性存在10倍差异可能指示此相互作用的重要性(参见下文的表15)。最后，最高剂量的244/PR8完全预防了10倍A/WSN攻击剂量(100 LD₅₀)引起的临床疾病，并将1000 LD₅₀A/WSN转化为具有温和临床迹象的短暂疾病(数据未显示)。

保护性病毒发挥的预防保护的持续时间

图5显示244/PR8保护性病毒预防活性的持续时间。在感染前42天(6周)鼻内施用单一剂量的保护性病毒(a、b)或灭活的保护性病毒(c、d)(4000 HAU/10μg)：■，灭活的保护性病毒；▲，保护性病毒。使用10 LD₅₀A/WSN在第0天(箭头)攻击小鼠。监控小鼠的体重变化(a、c)和总的临床评分(b、d)。

单一剂量的保护性病毒或灭活的保护性病毒(4000 HAU)不具有害效应，动物保持完全健康，体重增加与模拟接种的对照非常相象(图5a、c)。接受保护性病毒后1至42天(6周)，使用感染性病毒通过鼻内攻击小鼠。图5显示6周组的数据。接受保护性病毒的小鼠得到完全保护(图5c、d)，而接受灭活的保护性病毒的小鼠则感染而死(图5a、b)。

所述灭活的保护性病毒未能预防疾病，显示小鼠未启动针对流感病毒抗原的获得性免疫应答，并暗示所述保护性RNA续存于鼠呼吸道中。使用从仅接种了保护性病毒的小鼠肺部提取的RNA通过RT-PCR对此进行了测试。

图6显示不存在感染性病毒时，保护性RNA 244(395nt)在小鼠肺部的寿命，如使用引物RNA1F和RNA1R的RT-PCR所示。泳道1，DNA大小标志物(bp)；泳道2-6，小鼠肺部的扩增子。泳道2-5的RNA分别是在接种4000 HAU保护性病毒后1天、9天、21天和42天提取的；泳道6，模拟接种。

RT-PCR显示保护性RNA不能持续，并随时间而显示出下降(图6)。检测了接种后达21天，暗示保护性RNA是使小鼠抗临床流感的原因。接受10倍稀释的保护性病毒(400 HAU)的小鼠在受攻击7天后受到完全保护，但是14天后则不行(数据未显示)。

预防扩展至甲型流感病毒的不同亚型

对抗流感中的问题之一就是可存在144种不同的甲型病毒亚型，以及它们全部在人中经历的渐进性漂移变异，每种亚型和显著的漂移变异体都需要其自身的疫苗。不过，鼻内施用的244/PR8保护性病毒保护小鼠免受由人毒株H3N2(A/England/939/69 x A/PR/8/34)、H2N2(A/Jap/305/57)和抗原不同的H1N1病毒(A/PR/8/34和A/WS/33(N))和马毒株H3N8(A/Newmarket/7339/79)引起的临床疾病(数据未显示)。因此，保护性病毒提供不受H和N表面抗原限制的广泛的保护作用。

保护性病毒具有治疗效益

关于非克隆的干扰性病毒的先前工作未显示出治疗效应，但是由于确定的保护性病毒强烈的预防作用，对此实验进行了修正。和从前一样，用10 LD₅₀的A/WSN感染小鼠，然后在24和48小时后使用单一剂量的保护性病毒或灭活的保护性病毒(4000 HAU)对照进行鼻内治疗。所有对照小鼠均死亡，在24小时使用保护性病毒治疗完全防止了临床疾病、体重减轻和死亡；在48小时的所有小鼠均患病，但是疾病被延迟，并且33％得到恢复(下文的表1b)。增加感染剂量降低了治疗效力。

表1b显示保护性病毒在小鼠中的治疗效益a

表1b

^a使用10 LD₅₀A/WSN进行感染，并在所示时间使用灭活的保护性病毒或保护性病毒(4000 HAU/10μg病毒蛋白)进行感染后治疗(p.i.)。所有接种均是浅麻醉在鼻内进行。使用每组5-7只小鼠；此实验代表3次独立的实验。

下面的实施例提供了包括本发明克隆的DI病毒的更具体的实验细节。

实施例1-克隆的DI病毒220/PR8的生产

本领域已知的先前工作教导DI病毒的生产在用大量接种物(例如高达每卵2ml)接种含胚鸡卵时是最佳的。给出的解释是非感染性DI病毒居留的细胞也需要接受感染性(辅助)病毒，以便前者可以复制。此外，当传代重复两次或三次时，存在的DI病毒正常地增加。最终，产生的DI病毒的量超过存在的感染性病毒的量，由于缺乏辅助病毒功能，总的病毒生产下降。

出乎意料的是，发明人发现使用日常、即标准量的克隆的DI甲型流感病毒接种含胚鸡卵未能产生预期量的DI病毒材料；差距之大，以致影响进一步的实验室研究，包括体内动物研究；更不用说临床试验或生产用于生产药学可接受组合物或疫苗的DI病毒制剂。

惊人的是，发明人发现100μl克隆的DI病毒的接种物在含胚鸡卵中33℃即使单次传代48小时却得到了相当高的DI病毒产量。特别地，DI病毒244/151PR8在使用仅100μl接种物时得到了非常高的病毒产量(如血凝所示)。

发明人还发现，通过将所述接种物稀释1/10，仅将100μl此接种物在10日龄含胚鸡卵尿囊腔中传代一次即使总病毒增加了约10倍(如血凝所示)。通过在含胚鸡卵中传代之前稀释所述病毒制剂实现的保护性病毒产量的增加是完全出乎意料的。

此外，当对从稀释接种物中高产量获得的传代病毒进行纯化和浓缩后，发现此病毒制剂保护小鼠免受A/WSN流感病毒的致死的鼻内攻击。这证明所述传代的病毒制剂含有DI RNA。

因此，发明人确定的一个问题就是如何增加潜在的克隆的DI病毒而保持高(充足的)病毒产量。

使用的程序如下：

1.将生产感染性辅助流感病毒所需的质粒和编码RNA 220(62.5ng)的质粒转染至HEK293T细胞。而HEK293T细胞虽然在转染中有用，但是它们在扩大克隆的病毒的量方面并不那么有用。

2.然后将转染的293T细胞与Madin-Derby犬肾(MDCK)细胞共培养。孵育2天后取组织培养液，测试其病毒血凝活性，然后于-70℃冷冻。虽然MDCK细胞难以转染，但是它们是非常适合培养流感病毒。

3.将来自MDCK细胞(500μl/卵)的组织培养液注射入可育鸡卵的尿囊腔以增强病毒滴度(0代(P))。将卵在33℃孵育24小时，然后4℃冷藏以杀死胚。然后从所述卵中取出尿囊液(其含有病毒)和测试HA活性。

4.将病毒在卵中连续传代(P 1-3)，使用200μl接种物，孵育24小时。下文表1c将克隆的DI病毒220/PR8的产量表示为传代次数的函数：

表1c

实验编号	宿主和代(P)编号	接种物(实验编号)	接种物体积(μl)	病毒产量(HAU/ml)
实验编号	宿主和代(P)编号	接种物(实验编号)	接种物体积(μl)	病毒产量(HAU/ml)	774H(i)	293T细胞(转染)	质粒	不适用	32
774H(ii)	卵-P0	774H(i)	500	9600^*	774H(i)	293T细胞(转染)	质粒	不适用	32
774H(ii)	卵-P0	774H(i)	500	9600^*	778	卵-P1	774H(ii)	200	8000
779	卵-P2	778	200	800	778	卵-P1	774H(ii)	200	8000
779	卵-P2	778	200	800	788	卵-P2	778	200	1600
780	卵-P3	779	200	400	788	卵-P2	778	200	1600

HAU，血凝单位。

^*野生型PR8产量≥19 200HAU/ml。

注意，HA滴度不是同时测量的，可以根据红细胞的年龄而产生滴度的小变化。

在卵中使用高病毒滴度/大体积接种物进行了约3次传代。(参见表1a的P1至P3)在P1获得的滴度与野生型病毒相当(实际约低2.4倍)。在P2(两次实验)和P3获得的滴度比野生型病毒低12至50倍，即没有足量的可用的病毒。

下文表2显示作为接种物体积的函数的克隆的DI病毒220/PR8的产量。

表2

实验编号	宿主和代(P)编号	接种物(实验编号)	接种物体积(μl)	病毒产量(HAU/ml)	D1活性^*
实验编号	宿主和代(P)编号	接种物(实验编号)	接种物体积(μl)	病毒产量(HAU/ml)	D1活性^*	778	卵-P1	774H(ii)	200	8000	未执行
794	卵-P1	774H(ii)	10	4800	++++	778	卵-P1	774H(ii)	200	8000	未执行
794	卵-P1	774H(ii)	10	4800	++++	802	卵-P1	774H(ii)	1	4800	未执行
800	卵-P1	774H(ii)	0.1	5000	未执行	802	卵-P1	774H(ii)	1	4800	未执行

^*在使用A/WSN进行致死攻击的小鼠中。

减少接种物体积对总病毒产量几乎没有影响，但是10μl接种物经济可行。

图3显示其中各种量的244质粒与恒量的编码感染性A/WSN的质粒一起转染293T细胞的实验结果。一天后，将它们与MDCK细胞共培养7天。测量培养液中的病毒产量(HAU)。已证明病毒产量对转染的表达缺损RNA的质粒的量和在含胚鸡卵中进行传代的病毒的量敏感(数据未显示)。通过接种更少缺损RNA质粒或在含胚卵中传递更少量的病毒获得了更好的病毒产量。

连续的卵代分别产生种子病毒和最终的病毒贮液。经差速离心纯化后，缺损病毒归一化为2 x 10⁵血凝单位(HAU)/ml。

实施例2-保护性病毒244/PR8的生产

使用的主要保护性RNA(区段1；RNA244)是在编码感染性A/PR/8/34的质粒的转染/共培养过程中自发产生的(Subbarao，K.等2003 Virology305：192-200)。转染293T细胞的DNA混合物含有0.5μg各种的8个A/PR8基因区段(在PolI启动子控制下)、0.5μg各种PB1和PB2表达质粒、0.1μgPA表达质粒和1μg NP表达质粒和Fugene(Roche)。

为了优化所述244 iRNA质粒的转染，将244 RNA克隆至PolI表达质粒pPOLI-SapIT(Subbarao(2003)同上)，以便表达vRNA正义转录本。将不同量的244质粒(0-0.5μg)转染293T细胞，如上文所述。24小时之后，293T细胞用胰酶消化，与MDCK细胞混合并重新涂板。7天后收集培养上清液，病毒产量通过HA分析确定。

在另一实验中，使用了编码A/WSN的质粒(Neumann，G.等1999 Proc.Natl.Acad.Sci.96：9345-9350)。24小时之后，293T细胞用胰酶消化，与MDCK细胞混合，重新涂板，7天后收集培养上清液。病毒的生长通过HA分析确定。其在含胚鸡卵中进行两次传代，以制备种子贮液和用于小鼠研究的工作贮液。通过蔗糖差速离心纯化病毒。贮液重悬于含有0.1％w/v牛血清白蛋白的PBS中、通过HA滴定进行归一化，储存于液氮中。对从纯化的病毒中提取的RNA的RT-PCR和测序显示244 RNA是通过区段1的单个约80％的中央缺失产生的。该RNA具有395nt，包含nt 1-244和1891-2041(反义RNA)。因此，其保留了精确末端和含有复制和包壳信号的末端序列。使用每个基因组区段特异性的引物的分析显示，所述244RNA是存在的唯一的主要缺损RNA。244 RNA在传代时保留其序列，并且不会被大量的其它缺损RNA替换或增加。

含有RNA 220或317的保护性病毒A/PR8或A/Victoria/3/75(A/Vic；H3N2)(Duhaut，S.D.& Dimmock，N.J.2003，Journal of Virological Methods108:75-82)是用相同方法生产的。需要优化转染过程中缺损RNA质粒的量(参见下文)和卵接种物的量，以避免保护性病毒产量低。其它甲型流感病毒的感染性病毒贮液是通过低多样性感染(约10⁴EID₅₀)生产的。

实施例3-克隆的DI病毒244/151PR8的生产

将尿囊液(10μl/卵)注入可育鸡卵的尿囊腔以制备DI病毒的贮液。将卵在33℃孵育48小时，然后在4℃冷藏以杀死胚。然后取出尿囊液并测试HA活性。病毒通过在4℃差速离心进行纯化。通过“低速”离心(3000rpm，10min，Beckman GS-6R离心机，水平转头)除去大的碎片。然后在Beckman SW28转头中5ml蔗糖垫层(10％ w/v Tris缓冲生理盐水，pH7.4)，26000rpmg离心2小时沉淀病毒，以将病毒与较小的污染物分开。含有低密度脂的材料(例如卵黄)保留在蔗糖上。然后滴定病毒的HA，并调节至2 x 10⁵ HAU/ml。以小份储存于液氮中或-70℃。

下面的表3显示克隆的DI病毒244/151PR8的生产结果

表3

实验编号	宿主	接种物	接种物体积(μl)	病毒产量(HAU/ml)	DI活性^*
实验编号	宿主	接种物	接种物体积(μl)	病毒产量(HAU/ml)	DI活性^*	781	293T细胞(转染)	质粒	不适用	512	未执行
783	P0-卵	781	200	？	未执行	781	293T细胞(转染)	质粒	不适用	512	未执行
783	P0-卵	781	200	？	未执行	793	P1-卵	783	10	3200	++++
797	P1-卵	783	10	3800	++++	793	P1-卵	783	10	3200	++++

P0，零代。

^*在A/WSN致死攻击的小鼠中；二者在1/100时均具有+++保护性。因此，在卵代中生产的DI活性是可重复的。

实施例4-小鼠244/151PR8 DI活性的滴定

在细胞培养物、卵和小鼠中的滴定需要确定传染性滴度。通过标准程序在琼脂下对MDCK细胞中的病毒进行噬菌斑测定。使用限制稀释的病毒接种卵，然后孵育3天。通过尿囊液HA鉴定病毒阳性卵。按下文所述接种小鼠，3天后处死小鼠，将研磨的个体小鼠的肺接种至卵，然后通过HA确定病毒的存在。可选地，使用同源病毒在3周后鼻内攻击小鼠，以确定亚临床感染是否刺激保护性免疫。卵和小鼠终点感染性滴度根据

(Karber，G.，Textbook of Virology(病毒学教科书)(Rhodes，A.J.& van Rooyen，C.E.编)118(Williams和Wilkins Co.，Baltimore，1968))计算。

按先前描述的方法(Noble等，2004 Vaccine 22：3018-3025)将40μl接种物在轻度醚麻醉的情况下鼻内接种至成年C3H/He-mg(H-2^k)小鼠(4周龄；16-20g)，所述40μl接种物在两个鼻孔之间进行分配。由于紫外靶标大小的差异-13,600nt的感染性RNA和395nt的保护性RNA，可通过短暂的(20s)253.7nm下突然紫外照射消除辅助病毒感染性而不降低保护。通过灭活A/PR8感染性对灯进行校准。更长的紫外照射(8分钟)灭活保护，而提供用作任何刺激免疫系统或阻断受体效应的对照的制剂。照射不影响H或N活性。小鼠接受非感染性保护性病毒、灭活的保护性病毒、感染性攻击病毒或稀释剂的各种组合。在小鼠中滴定感染性攻击病毒以确定引起相当的呼吸疾病的各自剂量。使用免疫确定的10 LD₅₀(100 ID₅₀)A/WSN通过鼻内路径感染小鼠。小鼠的健康状况通过体重损失和先前描述的临床标准(Noble，S.& Dimmock，N.J.，1994Journal of General Virology 75：3485-3491)评估。小鼠成组进行体重测量。临床标准的评分如下：每个健康小鼠1分；显示不适迹象，包括一些竖毛、轻微的步态改变和走动增加的小鼠2分；显示强烈竖毛、腹部收缩、步态改变、周期性静止、呼吸频率增加和有时罗音的小鼠3分；显示增强的上述组特性，但是几乎不活动，呈垂死状的小鼠4分；当此类小鼠明确不能存活时，将其处死；和死亡小鼠5分。为了进行比较，用总临床评分除以实验组中的小鼠数量。所有病毒引起相似的临床疾病，包括肺实变。实验遵循英国癌症研究协调委员会(UK Coordinating Committee for Cancer Research)的原则。

实验1-400 HAU的DI病毒保护小鼠抵抗致死的A/WSN

下面的表4显示小鼠鼻内接种400 HAU(约1μg病毒蛋白)紫外灭活的DI病毒与攻击性A/WSN病毒的混合物或DI病毒与攻击性A/WSN病毒的混合物的结果。小鼠还接种了单独的DI病毒。小鼠在轻度醚麻醉后接种。

表4

iDIV＝紫外灭活的DI病毒；

DIV＝DI病毒。

^a5只小鼠/组；^b2只小鼠/组

接受灭活的DI病毒加攻击病毒的所有小鼠体重减轻并患病；80％死亡。接受DI病毒加攻击病毒的所有小鼠保持临床正常。除第7天外，它们体重每天均增加。

实验2-接种后3周时使用高剂量A/WSN(约1000LD ₅₀ )攻击所有存活小鼠

下面的表5显示取上文实验1的3周存活小鼠并使用高剂量A/WSN攻击它们的结果。

表5

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒

^a5只小鼠/组；^b2只小鼠/组

先前接受单独的DI病毒的小鼠体重减轻，在第6天死亡。这暗示DI病毒已不再存在或不能抵挡高剂量的攻击病毒。

先前接受DI病毒加攻击病毒的小鼠体重增加，保持良好，暗示它们具有对A/WSN的获得性免疫。

实验3-40 HAU DI病毒保护小鼠抵抗致死的A/WSN

表6显示鼠鼻内接种40 HAU(约100ng病毒蛋白)紫外灭活的DI病毒与攻击性A/WSN病毒的混合物或DI病毒与攻击性A/WSN病毒的混合物的结果。小鼠也接受单独的DI病毒(2只/组)。小鼠在轻度醚麻醉后接种。

表6

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒。

^a4只小鼠/组；^b5只小鼠/组；^c2只小鼠/组

接受灭活的DI病毒加攻击病毒的所有小鼠都体重减轻，患病和死亡。接受DI病毒加攻击病毒的小鼠发展了延迟和轻度的临床疾病(第7-9天)，所述临床疾病快速消退。它们有轻微的临时性体重损失(第6和7天)。

实验4-4 HAU DI病毒保护小鼠抵抗致死的A/WSN

下面的表7显示小鼠鼻内接种4 HAU(约10ng病毒蛋白)紫外灭活的DI病毒与攻击性A/WSN病毒的混合物或DI病毒与攻击性A/WSN病毒的混合物的结果。小鼠接受单独的DI病毒(2只/组)。小鼠在轻度醚麻醉后接种。

表7

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒

^a40 HAU/小鼠；5只小鼠/组

^b4 HAU/小鼠；5只小鼠/组

接受灭活的DI病毒加攻击病毒的所有小鼠都体重减轻，患病和死亡。接受4 HAU DI病毒加攻击病毒的所有小鼠发展临床疾病，并有体重损失。3/5的小鼠(60％)在11天后存活，表明此低剂量的DI病毒具有微弱的保护作用。但是1只小鼠患病，并在第16天死亡。

实验5-使用高剂量A/WSN攻击接种后3周存活的所有小鼠

下面的表8显示使用上文实验3和4的存活小鼠的实验的结果。使用约1000LD₅₀A/WSN攻击这些存活小鼠。

表8

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒。

^a40 HAU/小鼠；5只小鼠/组。

^b4 HAU/小鼠；2只小鼠/组。

^c40 HAU/小鼠；2只小鼠/组。

接受单独DI病毒的小鼠体重减轻，并在第6天死亡。这暗示DI病毒已不再存在或不能抵挡高剂量的攻击病毒。

接受40 HAU DI病毒加攻击病毒的所有小鼠体重增加，保持良好，暗示它们具有对A/WSN的获得性免疫。

接受4 HAU DI病毒加攻击病毒并且存活的2只小鼠体重增加，保持良好，暗示它们具有对A/WSN的获得性免疫。

实施例5-244/151PR8介导的保护作用在小鼠中的持续时间

下面的表9显示4000 HAU 244/151 PR8单独如何保护小鼠至少6周。

小鼠的接种时间线如下所示：

第0天：DI病毒

第6周：感染性A/WSN攻击以确定保护

第9周：高剂量感染性A/WSN攻击以确定免疫状态

第0天之后，监控小鼠的体重8天。

表9

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒

^a6只小鼠/组

^b3只小鼠/组

DI病毒单独对体重增加或临床状态没有有害影响。

下面的表10显示单独的感染性A/WSN或施用所述DI病毒(上文)6周后的稀释物的初次攻击效应。从第6周开始，对小鼠进行10天的监控。

表10

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒。

^a5只小鼠/组

^b2只小鼠/组

在接受灭活的DI病毒6周后攻击的小鼠体重减轻、患病和死亡。在接受DI病毒6周后攻击的小鼠体重继续增加(除了第4和第5天轻微减轻之外)，并且未显示临床疾病。

下面的表11显示使用高剂量(约1000 LD₅₀)A/WSN单独攻击未患临床疾病(并且其总体上体重增加)的小鼠(上文)的结果。从第9周开始，监控小鼠的免疫状态10天。

表11

iDIV＝紫外灭活的DI病毒；

DIV＝DI病毒。

^a5只小鼠/组。

^b2只小鼠/组；攻击病毒的对照；之前未接种

与对照(未进行DIV治疗)相比，之前进行DIV处理的小鼠抵抗住了高剂量的致死攻击，表明它们已具有对A/WSN的获得性免疫。

实施例6-在感染21小时后给予244/151PR8具有微弱的治疗效果

下面的表12显示使用A/WSN感染小鼠后再在21小时或48小时(未显示)后施用244/151PR8的结果。

表12

iDIV＝紫外灭活的DI病毒

DIV＝DI病毒。

^a7只小鼠/组。

^b2只小鼠/组。

在A/WSN感染21小时后使用DI病毒进行治疗将小鼠的体重减轻和临床疾病延迟了2天。2/7的小鼠(29％)得到恢复，对比接受灭活的DI病毒的小鼠为0/7。不过，这是异常强烈的攻击，至第3天100％小鼠患病。在感染48小时后给予DI病毒无保护作用。

实施例7-高剂量244/151PR8阻止A/WSN引起的原发感染、疾病和死亡。

下文的表13显示其中高剂量244/151PR8阻止了A/WSN引起的原发感染、疾病和死亡，但是与施用更加稀释的DI病毒得到的免疫性相比，针对高剂量A/WSN攻击产生较差的常规免疫性的结果。

接种时间线：

第0天：使用DI病毒+A/WSN(原发感染)的混合物接种小鼠。除一些(3/5)接受4HAU(第3列)的小鼠外，所有小鼠均得到保护。

第21天：使用高剂量(约1000 LD₅₀)A/WSN攻击病毒攻击小鼠。数据显示于下面的表13(第5-7列)。

表13

^*平均值＝87％(患病)和60％(死亡)。

最高浓度的DI病毒(4000 HAU/小鼠或1/1稀释)保护动物抵抗A/WSN，但是并不赋予它们对后续攻击的免疫性；但是较低量的DI病毒(1/10和1/100)可同时保护和允许形成对A/WSN的免疫性。1/1000DI病毒对原发感染产生约50％的保护，存活小鼠对攻击具有免疫性。

不希望受任何特定理论的束缚，可能是最高浓度的DI病毒降低了原发感染中A/WSN的增殖，以致其不能进行免疫。

所述实验证明了DI病毒的效力，并表明需要调节DI病毒的剂量以允许形成免疫性。过多的DI病毒可能对在个体中形成免疫性具有相反的效果。

实施例8-DI病毒在小鼠中针对A/WSN攻击病毒的相对活性

纯化DI病毒并根据其血凝活性(所述血凝活性与存在的病毒粒子的数量直接成比例)进行归一化。使用攻击性A/WSN病毒，在小鼠中执行了1000倍剂量范围的DI病毒活性的滴定。小鼠同时接种分级剂量的DI病毒+A/WSN或UV-灭活的DI病毒+A/WSN(数据未显示)，并监控其体重和临床状态。接受灭活的DI病毒+A/WSN的大多数小鼠具有≥20％的体重损失、严重的临床疾病并死亡。下面的表14显示保护的小鼠(++++)与模拟接种的对照无实质区别。

表14

^aDI病毒，下面是其批号；注意793和797是从同一来源制备的独立制剂。

^b保护范围从无体重损失或临床疾病(++++)，经不同程度的体重损失和临床疾病(+++至+)，至与接受灭活的DI病毒+A/WSN的对照小鼠无差别的体重损失和临床疾病(-)。‘3477’等是实验编号。PR8(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))和Vic(A/Victoria/3/75(H3N2))是辅助病毒。

活性最高的DI病毒是244/151PR8，其在低至每只小鼠40 HAU(100ng病毒蛋白)时几乎完全保护小鼠。244/151PR8的2个独立制剂重复了此结果。

所述DI病毒的活性从小于220/Vic的10倍至小于220/PR8的100倍不等。保护作用的顺序如下：

244/151PR8>220/Vic>317/Vic>220/PR8。

虽然并不影响结果和得出的结论，但是HAU仅给出大致测量的DI病毒的量，例如其同时测量DI和辅助病毒。

下面的表15显示2-4个独立实验的总结，其比较了小鼠中由各种确定的保护性病毒介导的针对感染性流感病毒的预防活性。

表15

每只小鼠的总保护病毒(HAU)^a	244/PR8	244/WSN	220/PR8	220/Vic	317/Vic
每只小鼠的总保护病毒(HAU)^a	244/PR8	244/WSN	220/PR8	220/Vic	317/Vic	4000	++++^b	++++	++++	++++	++++
400	++++	++++	+	+++	+++	4000	++++^b	++++	++++	++++	++++
400	++++	++++	+	+++	+++	40	++++	++++	+	-	-
4	++	++	nd	nd	nd	40	++++	++++	+	-	-
4	++	++	nd	nd	nd	0^c	-	-	-	-	-
实质保护所需的最小剂量^d	0.1μg^e	0.1μg^e	10μg	1μg	1μg	0^c	-	-	-	-	-

^a在轻度麻醉下与10 LD₅₀A/WSN攻击病毒同时作为单一鼻内剂量施用。

^b度量范围从完全防止体重损失和临床疾病(++++)至与接受灭活的保护性病毒加攻击病毒的对照无差异(-)。

^c小鼠接受4000 HAU灭活的保护性病毒。

^d定义为产生+++或更好保护的保护性病毒的最低剂量。

^e每只小鼠接种的总病毒蛋白。

Nd，未执行；每组使用5-7只小鼠；此实验代表2-4次独立的实验。

实施例9-在感染24小时后使用244/PR8保护性病毒治疗小鼠

使用不确定的保护性病毒在较早时间内治疗感染小鼠不具有治疗效益。使用感染性A/WSN病毒(约2.5 MLD₅₀(50％小鼠致死剂量)通过鼻内灌输(如先前的实施例所述)接种小鼠，约24小时后使用单剂量的对照紫外灭活的DI病毒或使用活性DI病毒(二者均为4000 HAU，约合10μg病毒蛋白)治疗所述接种小鼠。同时对未感染小鼠接种DI病毒。所有接种均在轻度醚麻醉下进行(如先前的实施例所述)。

下面的表16显示接受低剂量感染性病毒、然后在24小时后施用DI病毒(对照施用灭活的DI病毒)的小鼠的结果。使用了进一步的未感染小鼠的对照，其中施用单独的DI病毒。

表16

ipV，紫外灭活的保护性病毒；DI，干扰缺损病毒；体重单位为克；显示了每组每天发生的患病/死亡小鼠数。(？)指小鼠可能已患病，但是并未确定患病。

^a6只小鼠/组；^b2只小鼠/组)。

使用对照灭活的DI病毒治疗的所有感染小鼠均体重减轻，并在感染3天后患病。至第7天，所有小鼠均死亡。

使用DI病毒治疗的感染小鼠体重略有减轻和/或体重停止增加，但是在对照组逐渐死亡的时间内仍保持临床正常。可能在第8、9、11和12天出现轻度疾病，但这是短暂的。所有小鼠(100％)在实验终止时均处于健康状态。

感染3周后，使用强致死剂量的A/WSN鼻内攻击已受DI病毒保护的小鼠(上文表16第2列)。体重和临床迹象表明小鼠完全不受影响，而之前未经历任何流感病毒的对照小鼠全部死亡。使用的病毒剂量过大，以致DI病毒不能提供保护作用，因此这些数据暗示尽管在第一次感染过程中小鼠并未明确患病，但是它们已形成了对A/WSN的获得性免疫。

下面的表17显示接受中间剂量(约5 MLD₅₀)感染性A/WSN病毒、然后在24小时后施用DI病毒(对照施用灭活的DI病毒，二者均为4000 HAU，约合10μg病毒蛋白)的小鼠的结果。使用了进一步的未感染小鼠的对照，其中施用单独的DI病毒。

表17

iDI，紫外灭活的干扰缺损病毒；DI，干扰缺损。

^a6只小鼠/组；^b2只小鼠/组。

使用对照灭活的DI病毒治疗的所有感染小鼠均体重减轻，并在至第5天时患病。至第6天，大多数(83％)小鼠死亡(或被淘汰)。至第8天，所有小鼠均死亡。

使用DI病毒治疗的感染小鼠体重减轻，并与对照感染组同时患有一些临床疾病。不过所述临床疾病程度更轻、在时间更长内发生，并且有两个发作期，峰值在第4和第8天。两只小鼠死亡(在第9和10天)，其余(4/6或67％)则恢复。

接种单独的PV的小鼠中有一只患病并死亡。这是非常罕见的事情-数年工作中发生的唯一的一次。

下面的表18显示接受更高剂量(约10 MLD₅₀)感染性A/WSN病毒、然后在24小时后施用DI病毒(对照施用灭活的DI病毒，二者均为4000HAU，约合10μg病毒蛋白)的小鼠的结果。使用了进一步的未感染小鼠的对照，其中施用单独的DI病毒。

表18

iDI，紫外灭活的干扰缺损病毒；DI病毒，干扰缺损病毒。

^a6只小鼠/组；^b2只小鼠/组。

使用对照DI病毒治疗的所有感染小鼠均体重减轻，大多数至第4天患病。所有小鼠均死亡或在至第7天淘汰。

使用DI病毒治疗的感染小鼠体重减轻，并患有一些延迟的临床疾病，所述临床疾病在更长的时间内发生。两只小鼠死亡(第7和第10天)，其余(67％)恢复/正在恢复。

实施例10-在感染48小时后使用244/PR8 DI病毒治疗小鼠

如实施例8所述，但是感染小鼠在感染48小时后接受一个剂量的DI病毒。

下面的表19显示接受中间剂量(约5 MLD₅₀)感染性A/WSN病毒然后在48小时后施用DI病毒(对照施用灭活的DI病毒，二者均为4000 HAU，约合10μg病毒蛋白)的小鼠的结果。

表19

iDI病毒，紫外灭活的干扰缺损病毒；DI病毒，干扰缺损病毒；g，以克计的体重；显示了每组每天发生的患病/死亡小鼠数。(？)指小鼠可能已患病，但是并未明确患病。

^a5只小鼠/组；^b6只小鼠/组；^c2只小鼠/组。

使用对照灭活的DI病毒治疗的所有感染小鼠均体重减轻，并在至感染后第5天时患病。至第7天，所有小鼠均死亡。

感染48小时后使用DI病毒治疗的感染小鼠体重减轻，但是患病被延迟，至第6天才见患病。至第7、9和10天才发生死亡(4/6)。6只小鼠中有两只(33％)完全恢复。

实施例11-244 iRNA降低病毒产量

将244 iRNA克隆至PolI表达质粒pPOLI-SapIT，以便该载体表达vRNA的正义转录本。将其与产生感染性WSN病毒所需的12个质粒一起转染293T细胞。所述DNA混合物含有不同量的244质粒(0-0.5μg)、和0.5μg的各个WSN基因区段(在PolI启动子控制下)、各0.5μg的PB1和PB2表达质粒、0.1μgPA表达质粒和1μg NP表达质粒。24小时之后，所述293T细胞用胰酶消化，与MDCK细胞混合并重新涂板。再过7天后，收集培养物上清液，通过HA分析确定病毒产量。

表20

244 iRNA质粒(μg)	病毒产量(HAU/ml)	病毒产量(％对照)
244 iRNA质粒(μg)	病毒产量(HAU/ml)	病毒产量(％对照)	0	19200	100
0.1	9600	50	0	19200	100
0.1	9600	50	0.25	1600	8
0.5	300	1.6	0.25	1600	8

表20显示随着244质粒的量的增加，通过HA确定的病毒总产量下降了98.4％。接种物中过多的iRNA将病毒产量降低至无法使用的程度。

实施例12-保护性病毒阻止临床疾病，但是允许形成适合针对攻击病毒的免疫性

小鼠具有10 LD50 A/WSN保护三周之后，使用显著更高剂量的A/WSN(10,000 LD₅₀)对其进行再次攻击。使用此剂量是因为其能击溃甚至极佳的保护性病毒(数据未显示)，因而允许评估A/WSN特异性B和T细胞免疫反应。图3(c、f、i)显示所有存活小鼠组均对所述再次攻击完全免疫。由于接受400或40 HAU保护性病毒的动物在初次攻击中未显示疾病迹象，其在第二次高病毒攻击中存活显示所述小鼠形成了保护性免疫，因此保护性病毒将初始致死剂量的毒性病毒有效转化为亚临床活疫苗。下面的表21显示保护性病毒仅提供微弱疫苗作用的最高剂量。与直觉相反，接受最高剂量的保护性病毒(4000 HAU)的小鼠对第二次攻击的保护作用较差，暗示此情形下病毒复制和抗原生产受到严重抑制，以致于所得感染仅具微弱免疫原性。

表21

^a小鼠鼻内接种保护性病毒+10 LD₅₀攻击病毒A/WSN的混合物(第一次攻击：第1和第2列)；然后在3周后接种单独的10,000 LD₅₀ A/WSN(第二次攻击)。后一实验测试获得性免疫，而不是残留的保护性病毒活性，因为当同时给与(未显示)时，此更高剂量的A/WSN完全战胜了保护性病毒。显示了3个单独实验的数据。

^b平均值＝87％患病。

^c平均值＝60％死亡。

^d给与4000 HAU灭活的保护性病毒。

Na，不适用。

Claims

1.一种生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：

(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；

(b)将所述转染细胞培养一段时间；

(c)(i)将一小份低于100μl的所述转染细胞培养基质导入含胚卵；或

(ii)取一小份所述转染细胞培养基质，减少该小份中的病毒粒子的数量或浓度，然后将所述小份的至少一部分导入含胚卵；或

(iii)将含有低于4 x 10⁹个拷贝的RNA缺失区段的转染细胞培养基质导入含胚卵；和

(d)将所述卵孵育一段时间；和

(e)从所述卵中回收病毒材料。

2.一种生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：

(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；

(b)将所述转染细胞培养一段时间；

(c)取一小份所述转染细胞培养基质；

(d)将所述小份的至少一部分导入含胚卵；

(e)将所述卵孵育一段时间；

(f)(i)将一小份取自孵育卵的低于100μl的病毒材料导入另一含胚卵；或

(ii)从所述孵育卵中回收一小份病毒材料，减少该小份中的病毒粒子的数量或浓度，并将所述小份的至少一部分导入另一含胚卵；或

(iii)将取自所述孵育卵的含有低于4 x 10⁹个拷贝的RNA缺失区段的病毒材料导入另一含胚卵；

(g)将另一卵孵育一段时间；和

(h)从所述卵中回收病毒材料。

3.一种生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)将转染细胞培养基质的至少一部分导入至少10个含胚卵；(d)将至少一部分所述卵孵育一段时间；和(f)从至少一个孵育卵中回收病毒材料。

4.一种生产克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括：(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA区段的质粒和(ii)联合提供感染性甲型流感病毒的RNA区段1至8的多个质粒转染细胞；(b)将所述转染细胞培养一段时间；(c)取一小份所述转染细胞培养基质；(d)将所述小份的至少一部分导入含胚卵；(e)将所述卵孵育一段时间；(f)将至少一部分来自孵育卵的病毒材料导入至少10个另外的含胚卵；(g)将另外的卵孵育一段时间；和(h)从至少一个卵中回收病毒材料。

5.一种将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：

(a)将已知或疑似含有克隆的DI甲型流感病毒粒子的小份导入含胚卵，其中导入的小份的体积低于100μl；

(b)将所述卵孵育一段时间；和

(c)从所述卵中回收病毒材料。

6.一种将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：

(a)将已知或疑似含有克隆的DI甲型流感病毒粒子的小份导入至少10个含胚卵；

(b)将至少一部分所述卵孵育一段时间；和

(c)从至少一个孵育卵中回收病毒材料。

7.一种将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：(a)减少已知或疑似含有克隆的DI甲型病毒粒子的小份中的病毒数量或浓度；(b)将所述小份的至少一部分导入含胚卵；(c)将所述卵孵育一段时间；和(d)从所述卵中回收病毒材料。

8.一种将克隆的DI甲型流感病毒传代的方法，所述方法包括：

(a)将不超过4 x 10⁹个拷贝的克隆的DI甲型流感基因组导入含胚卵；(b)将所述卵孵育一段时间；和(d)从所述卵中回收病毒材料。

9.如权利要求8所述的方法，其中将至少1 x 10⁷个拷贝的克隆的DI甲型流感基因组导入所述含胚卵。

10.如权利要求5至7的任一项所述的方法，其中所述已知或疑似含有克隆的DI病毒粒子的小份是预先通过将已知或疑似含有所述克隆的病毒的起始材料导入含胚卵，然后将所述卵孵育一段时间获得的。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述起始材料获自转染细胞培养物。

12.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其中将回收的病毒材料导入另一含胚卵，将所述卵孵育一段时间，然后从所述卵中回收进一步的病毒材料。

13.如权利要求12所述的方法，其中权利要求12中确定的步骤被重复一次或多次。

14.如权利要求1至7或10至13的任一项所述的方法，其中(a)病毒粒子的浓度是通过稀释降低的，或(b)病毒粒子的数量是通过稀释然后取所得稀释体积的至少一部分减少的。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述稀释是至少1/2，优选地至少1/10，更优选地至少1/100，甚至更优选地至少1/1000。

16.如前述权利要求任一项所述的方法，其中要导入含胚卵的包含克隆的DI甲型流感病毒的小份含有不超过约10⁶噬斑形成单位每HA单位，优选地低至10⁵、10⁴、10³或10²噬斑形成单位每HA单位，更优选地不超过约10⁴噬斑形成单位每HA单位。

17.如前述权利要求任一项所述的方法，其中要导入含胚卵的包含克隆的DI甲型流感病毒的小份含有不超过约400HA单位，优选地不超过约40HA单位，更优选地不超过约4HA单位。

18.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒是制剂形式，其中所述制剂中所有病毒粒子的至少75％，优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％具有遗传同一性。

19.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述制剂中几乎所有粒子具有遗传同一性，优选地所有粒子具有遗传同一性。

20.如前述权利要求任一项所述的方法，所述方法进一步包括用紫外线照射小份以灭活小份中存在的至少一部分感染性甲型流感病毒的步骤。

21.克隆的DI甲型流感病毒用作药物。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述药物是抗病毒剂。

23.克隆的DI甲型流感病毒用于生产在个体中预防或治疗相同或不同亚型的甲型流感的抗病毒药物的用途。

24.克隆的DI甲型流感病毒用于生产将个体内的毒性甲型流感病毒感染转化为无毒感染的药物的用途。

25.克隆的DI甲型流感病毒用于生产在感染或疑似感染甲型流感的个体内提供即时和非免疫保护效应的药物的用途。

26.克隆的DI甲型流感病毒用于生产对个体进行针对甲型流感的免疫的药物的用途，其中所述药物进一步包含至少一个甲型流感的活毒株，并且所述药物适合将DI甲型流感病毒与所述活毒株单独、同时或顺序施用。

27.如权利要求21至26的任一项所述的用途，其中所述药物通过鼻内施用。

28.如权利要求23至26的任一项所述的用途，其中所述个体是动物或人，优选地其中所述动物选自猪、马、狗、猫或禽类。

29.如权利要求21至26的任一项所述的用途，其中所述药物经口施用。

30.如权利要求29所述的用途，其中所述个体是禽类物种，优选地驯化物种例如鸭、鹅、火鸡或鸡，例如肉鸡。

31.如权利要求21至31的任一项所述的用途，其中施用单一剂量的药物。

32.如权利要求26至31的任一项所述的用途，其中所述至少一个甲型流感的活毒株是天然存在的甲型流感毒株。

33.如权利要求32所述的用途，其中所述甲型流感的活毒株选自H1N1、H2N2、H3N2、H3N8或H5N1。

34.如权利要求21至33的任一项所述的用途，其中所述药物中克隆的DI甲型流感病毒的量在0.1-100HA单位，优选地0.5-50HA单位范围内。

35.如权利要求21至33的任一项所述的用途，其中所述药物中克隆的DI甲型流感病毒的量在0.01μg-0.1μg，优选地0.01μg-1μg病毒蛋白范围内。

36.如权利要求21至35的任一项所述的用途，其中所述克隆的DI甲型流感病毒在RNA区段中具有至少一个缺失。

37.如权利要求36所述的用途，其中缺失的区段的5′和3′端是完整的。

38.如权利要求36或权利要求37所述的用途，其中区段缺失至少50％的核苷酸，优选地至少75％的核苷酸，更优选地至少80％的核苷酸。

39.如权利要求36至38的任一项所述的用途，其中所述至少一个缺失位于RNA区段1。

40.如权利要求21至39的任一项所述的用途，其中所述克隆的DI甲型流感病毒的RNA区段1的核苷酸序列包含：

(a)选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列；或

(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少75％同一性的核酸序列；或

(c)在严格条件下与上文(a)或(b)杂交的序列的互补序列。

41.如权利要求40所述的用途，其中所述克隆的DI甲型流感病毒的基因组区段1的核酸序列与SEQ ID NO：1具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，甚至更优选地99％同一性。

42.如权利要求40或权利要求41所述的用途，其中基因组区段1的核苷酸序列包含在所述核苷酸序列的一个或多个位置处的一个或多个核苷酸插入。

43.如权利要求40或权利要求41所述的用途，其中基因组区段1的核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

44.一种药物组合物，其包含克隆的DI甲型流感病毒。

45.一种预防或治疗受治疗者的甲型流感的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒粒子在所述受治疗者中具有抗病毒效应。

47.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其中克隆的DI甲型流感病毒的施用提供针对获得性甲型流感感染的即时保护效应。

48.如权利要求45至47的任一项所述的方法，其中所述受治疗者中的甲型流感与所施用的DI甲型流感病毒粒子是相同或不同的亚型。

49.如权利要求45至48的任一项所述的方法，其中个体感染或疑似感染甲型流感病毒。

50.如权利要求45或权利要求49所述的方法，其中克隆的DI病毒在所述个体感染或疑似感染48小时内，优选地24小时内施用。

51.一种将感染受治疗者的毒性甲型流感病毒转化为无毒的病毒感染的方法，所述方法包括为所述受治疗者施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒粒子与所述毒性甲型流感病毒是不同的亚型。

53.一种对受治疗者进行针对甲型流感病毒的免疫的方法，所述方法包括为所述受治疗者施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子和感染量的至少一个甲型流感毒株的活病毒。

54.如权利要求49所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒粒子和所述活病毒是单独、同时或顺序施用。

55.一种将感染受治疗者的毒性甲型流感病毒转化为无毒的病毒感染并对所述受治疗者进行针对感染病毒的免疫的方法，所述方法包括为所述受治疗者施用克隆的DI甲型流感病毒。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述克隆的DI流感病毒与所述毒性甲型流感病毒是不同的亚型。

57.一种分离的核酸分子，其包含：

(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；

(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有大于96％同一性的核苷酸序列；

(c)在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2杂交的核苷酸序列；

(d)与序列(a)、(b)或(c)中的任一个互补的核苷酸序列。

58.一种组合物，其包含权利要求57所述的分离的核酸分子。

59.如权利要求57所述的核酸分子，其为RNA。

60.一种载体或质粒，其包含权利要求57或权利要求58所述核酸。

61.一种引物或探针核酸分子，其包含权利要求57至59任一项所述的核酸序列的至少一部分。

62.一种克隆的DI甲型流感病毒，其通过权利要求1至20任一项所述的方法获得或可通过所述方法获得。

63.一种对个体进行针对甲型流感病毒毒株免疫并同时治疗所述个体由甲型流感病毒的任何毒株或亚型引起的感染的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI病毒和活的甲型流感病毒。

64.克隆的DI甲型流感病毒用于生产进一步包含活的甲型流感病毒毒株的药物的用途，其中所述药物是针对所述流感病毒毒株的疫苗和针对甲型流感病毒的任何毒株或亚型的抗病毒剂。