CN104497214A - 一种基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，将一定比例的苯乙烯类单体、交联剂和致孔剂混合均匀后，注入反应模具中，并升温至一定温度进行原位共聚反应一段时间，得到整体聚合物材料；将整体聚合物材料以索氏提取或连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂，得到整体多孔材料；利用亲水性的乙烯基单体对整体多孔材料的孔道表面进行接枝聚合改性；将表面接枝的聚合物长链上的大量羟基逐步进行衍生，并链接linker基团,得到链接linker的固相合成介质。通过该方法制备的固相合成介质具有微米级通孔，并具有高交联度的非溶胀性，能够应用于大规模的多肽合成生产。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物材料技术领域，尤其涉及一种基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法。
背景技术
目前，固相合成自Merrifield发明此方法以来，在多肽及核酸合成领域得到了广泛的应用。通常合成成败的关键在于对固相合成载体的选择，目前，固相合成所用载体多为低交联度(1-2％)的聚苯乙烯微球，该类微球在非极性有机溶剂中有较高的溶胀度，利于反应物在其中进行充分反应和扩散。但聚苯乙烯基质本身的特点决定了其疏水的本性，导致该类基质在极性溶剂中溶胀度低，同时在应用于合成疏水性比较强的多肽分子时，由于基质的强疏水性容易诱导多肽分子发生β折叠，从而降低合成效率和目标物纯度。
随着生物医药产业的发展，人们对多肽类药物的需求的增加，相应的对高效率合成技术的需要越来越迫切，所以开发一种高效率的固相合成介质以适应连续批量合成操作是当务之急。现有技术方案中有各种亲水性较好的固相介质，但均存在一定缺陷，例如：
1)以亲水性较好的二乙二醇二甲基丙烯酯、二缩三丙二醇二丙烯酸酯和1，6己二醇二丙烯酸酯为交联剂，代替二乙烯基苯(DVB)来交联苯乙烯单体(St)制备改性聚苯乙烯微球介质，在DCM、NMP、DMF、THF、CHCl3中比Merrifield树脂(PSt-DVB)的溶胀度有明显的增加，合成困难序列酰基载体蛋白65-74获得了比Merrifield树脂更高的产率，但在合成过滤操作中，出现了微球破碎，主要由于此类交联剂与DVB相比分子刚性下降，而导致树脂机械强度下降，不利于连续操作。
2)将亲水性大分子与疏水性介质接枝共聚，如聚苯乙烯接枝聚乙二醇树脂，在PSt微球介质上接枝PEG大分子，与多肽反应的位点位于PEG分子链的末端而远离PSt介质本体，这样PEG链隔离了介质本体的疏水性，此外，这些介质所接枝的PEG链，具有良好的溶解性能，能够模拟溶液合成环境，可以促进多肽分子的溶解，有利于减少残缺肽产生；但由于将一定链长的PEG分子接枝于PSt微球介质本体存在着一定位阻作用，导致此类介质的取代度较低(0.2-0.3mmol/g)在规模化制备多肽应用中受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，通过该方法制备的固相合成介质具有微米级通孔，并具有高交联度的非溶胀性，能够应用于大规模的多肽合成生产，满足快速、高效、批次合成多肽的需要。
一种基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，所述制备方法包括：
步骤1、将一定比例的苯乙烯类单体、交联剂和致孔剂混合均匀后，注入反应模具中，并升温至一定温度进行原位共聚反应一段时间，得到整体聚合物材料；
步骤2、将步骤1得到的整体聚合物材料以索氏提取或连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂，得到整体多孔材料；
步骤3、利用亲水性的乙烯基单体对步骤2所得到的整体多孔材料的孔道表面进行接枝聚合改性；
步骤4、将表面接枝的聚合物长链上的大量羟基逐步进行衍生，并链接linker基团,得到链接linker的固相合成介质。
所述苯乙烯类单体包括聚乙烯基苄氯；
所述交联剂包括：二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和二乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种；
所述致孔剂由十二醇和环己醇按照质量比1:1组成。
所述步骤1具体包括：
首先将苯乙烯类单体与交联剂按照质量比1:1～1:2进行混合；
然后加入致孔剂，该致孔剂质量为所述苯乙烯类单体与交联剂质量和的1.5倍；
再加入引发剂偶氮二异丁腈，将上述组分完全混合形成均匀溶液；
将所述溶液装入一定形状的反应模具中，密封后放置于水浴锅中，其中聚合温度范围为60～80℃，反应时间为12～24h，最终制得整体聚合物材料。
在步骤2中以连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂，具体包括：
将所述反应模具连接于液相色谱泵，用甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种混合物的溶剂作为流动相，进行冲洗以去除致孔剂；
其中，冲洗流速为0.2～0.5mL/min，流动相所采用的溶剂体积为50～100mL。
在步骤3中，利用亲水性的乙烯基单体对步骤2所得到的整体多孔材料的孔道表面进行接枝聚合改性，具体包括：
向步骤2所得到的整体多孔材料中加入一定比例的亲水性单体、溶剂和原子转移自由基聚合引发剂；
在65～80℃的反应温度下对材料表面进行接枝聚合反应，反应时间为4～12h；
然后对反应后的材料进行清洗，得到表面带有大量羟基的亲水接枝改性材料。
所述亲水性单体包括：甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸聚乙二醇酯、单甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯、丙烯酸聚乙二醇酯和单甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯中的一种或者多种的混合物；
所述溶剂包括：去离子水、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和二氧六环中的一种或多种的混合物；
所述原子转移自由基聚合引发剂具体包括组分：氯化亚铜和催化剂配体；其中，所述催化剂配体包括：2,2-联二吡啶、四甲基乙二胺、N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺和1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺中的一种或多种的混合物。
所述亲水性单体的加入比例为步骤2所得到的整体多孔材料质量的3～6倍；
所述原子转移自由基聚合引发剂中的氯化亚铜的加入比例为所述亲水性单体摩尔数的1～10％，且所述氯化亚铜和催化剂配体的摩尔比为1:1。
在步骤4中，所述将表面接枝的聚合物长链上的大量羟基逐步进行衍生，并链接linker基团,得到链接linker的固相合成介质，具体包括：
将步骤3得到的表面接枝的聚合物长链上的大量羟基分别逐步进行衍生，依次为卤化、胺化和偶联linker基团，得到链接linker的固相合成介质。
所述卤化过程具体包括：
将二氯亚砜按照与步骤3改性后的材料质量比为10:1的比例加入到步骤3改性后所得的材料中；同时加入二氯甲烷作为溶剂，其加入体积为二氯亚砜体积的2倍，其中反应温度为室温，反应时间为12h；在反应完毕后，以二氯甲烷冲洗材料表面，以去除副产物；
所述胺化过程具体包括：
首先将邻苯二甲酰亚胺加入上述卤化后的材料中，同时加入二甲基甲酰胺作为溶剂，在120℃下反应12h；然后将酰肼加入上述反应后所得的材料中，同时加入乙醇作为溶剂，在60℃下反应12h；最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
所述偶联linker基团的过程具体包括：
将linker试剂按照该linker试剂与所述胺化后的整体材料质量比为5:1的质量比加入到所述胺化后的整体材料中，同时加入二甲基甲酰胺作为溶剂；再加入缩合剂1-羟基苯并三氮唑、2-1H-苯并三偶氮L-1-基-N,N,N’,N’,-四甲基异脲六氟化磷、二异丙基乙胺，具体按照与所述linker试剂摩尔比1:1:1:1的比例加入；然后在室温下反应2h。
所述linker试剂包括：对羟甲基苯甲酸、对羟甲基苯氧乙酸和对羟甲基苯乙酸中的一种或多种。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，通过该方法制备的固相合成介质具有微米级通孔，并具有高交联度的非溶胀性，能够应用于大规模的多肽合成生产，满足快速、高效、批次合成多肽的需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例所提供基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法流程示意图；
图2为本发明所举实例合成ACP 65-74粗产品的纯度分析HPLC色谱图；
图3为本发明所举实例中合成ACP 65-74粗产品的纯度分析HPLC另一色谱图；
图4为本发明所举实例中合成ACP 65-74粗产品的纯度分析HPLC的另一色谱图；
图5为本发明所举实例中合成ACP 65-74粗产品的纯度分析HPLC的另一色谱图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
下面将结合附图对本发明实施例作进一步地详细描述，如图1所示为本发明实施例所提供基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法流程示意图，所述制备方法包括：
步骤1、将一定比例的苯乙烯类单体、交联剂和致孔剂混合均匀后，注入反应模具中，并升温至一定温度进行原位共聚反应一段时间，得到整体聚合物材料；
在该步骤中，所述苯乙烯类单体包括聚乙烯基苄氯；
所述交联剂包括：二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和二乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种；具体实现中的典型组合是聚乙烯基苄氯与二乙烯基苯共聚、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚的整体材料，其孔径范围为0.5～10μm。
所述致孔剂由十二醇和环己醇按照质量比1:1组成。
举例来说，首先可以将苯乙烯类单体(例如聚乙烯基苄氯)与交联剂按照质量比为1:1～1:2进行混合；优选1:1.2～1:1.8，例如可以按照1:1.3、1:1.4、1:1.5或1:1.6的质量比混合。
然后加入致孔剂，该致孔剂质量为苯乙烯类单体与交联剂质量和的1.5倍；
再加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，具体可以按照反应单体量的1％(质量比)加入，将上述组分完全混合形成均匀溶液；
将上述溶液装入一定形状的反应模具中，密封后放置于水浴锅中，控制聚合温度范围在60～80℃，反应时间控制在12～24h，最终制得整体聚合物材料。
具体实现中，上述聚合温度范围进一步优选在65～75℃内，例如为62℃、65℃、71℃、75℃或78℃。
另外，具体实现中，该整体聚合物材料的形状取决于所述反应模具的形状，也可以根据后期应用固相合成的装置而任意设计，例如可以为盘状或者其他多边形，本实例优选为柱状。
步骤2、将步骤1得到的整体聚合物材料以索氏提取或连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂，得到整体多孔材料；
在该步骤中，通过连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂的过程具体为：
首先将所述反应模具连接于液相色谱泵，用甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种混合物的溶剂作为流动相，进行冲洗以去除致孔剂，这里溶剂优选为乙醇；
其中，在冲洗过程中，冲洗流速为0.2～0.5mL/min，流动相所采用的溶剂体积为50～100mL，该方法主要是针对在色谱柱管作为模具制备的整体聚合物材料。
步骤3、利用亲水性的乙烯基单体对步骤2所得到的整体多孔材料的孔道表面进行接枝聚合改性；
在该步骤中，具体操作可以为：首先向步骤2所得到的整体多孔材料中加入一定比例的亲水性单体、溶剂和原子转移自由基聚合引发剂；
在65～80℃的反应温度下对材料表面进行接枝聚合反应，反应时间为4～12h；具体实现中，反应温度可以为68℃、70℃、75℃或78℃；反应时间可以为4h、6h、8h、10h和12h，进一步优选为6～10h。
然后对反应后的材料进行清洗，得到表面带有大量羟基的亲水接枝改性材料。
在具体实现中，所述亲水性单体可以包括：甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸聚乙二醇酯(分子量范围为Mn＝370～1600)(PEGMA)、单甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(分子量范围包括Mn＝470～2500)(mPEGMA)、丙烯酸聚乙二醇酯(分子量范围为Mn＝375～1600)(PEGA)和单甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯(分子量范围为Mn＝375～1600)(mPEGA)中的一种或者多种的的混合物。例如可以是HEMA和mPEGMA的混合物，PEGMA和mPEGA的混合物，HEMA和mPEGA的混合物，或HEMA、mPEGA、PEGMA的混合物。本实例中优选为聚乙二醇丙烯酸酯(PEGA)。
所述溶剂可以包括：去离子水、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)和二氧六环中的一种或多种的混合物。
所述原子转移自由基聚合引发剂包括组分：氯化亚铜和催化剂配体；其中，所述催化剂配体可以包括：2,2-联二吡啶(Bpy)、四甲基乙二胺(TMEDA)、N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)和1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)中的一种或多种的混合物。
另外，具体实现中，所述亲水性单体的加入比例为步骤2所得到的整体多孔材料质量的3～6倍；即材料质量：亲水性单体质量＝1:3～6(g/g)，例如该亲水性单体的加入比例可以是整体多孔材料质量的3.5、4、4.5、5、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9倍，本实例优选为3.5～5.5倍，进一步优选为4～5倍；
所述原子转移自由基聚合引发剂中的氯化亚铜的加入比例为所述亲水性单体摩尔数的1～10％，且所述氯化亚铜和催化剂配体的摩尔比为1:1。
步骤4、将表面接枝的聚合物长链上的大量羟基逐步进行衍生，并链接linker基团,得到链接linker的固相合成介质。
在该步骤中，具体是将步骤3所得的表面接枝的聚合物长链上的大量羟基分别逐步进行衍生，分别依次为卤化、胺化、偶联linker，最后得到连接linker的固相合成介质。
其中，所述卤化过程具体包括：
将二氯亚砜(SOCl2)按照与步骤3改性后的材料质量比为10:1的比例加入到步骤3改性后所得的材料中；同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为二氯亚砜SOCl2体积的2倍，其中反应温度为室温，反应时间为12h；在反应完毕后，以二氯甲烷DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
所述胺化过程具体包括：
首先将邻苯二甲酰亚胺加入上述卤化后的材料中，同时加入二甲基甲酰胺DMF作为溶剂，在120℃下反应12h；然后将酰肼加入上述反应后所得的材料中，同时加入乙醇作为溶剂，在60℃下反应12h；最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
所述偶联linker基团的过程具体包括：
将linker试剂按照该linker试剂与所述胺化后的整体材料质量比为5:1的质量比加入到所述胺化后的整体材料中，同时加入二甲基甲酰胺DMF作为溶剂；再加入缩合剂1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基-N,N,N’,N’,-四甲基异脲六氟化磷(HBTU)、二异丙基乙胺(DIEA)，具体按照与所述linker试剂摩尔比1:1:1:1的比例加入；然后再室温下反应2h。
具体实现中，所述linker试剂可以包括：对羟甲基苯甲酸(HMBA)、对羟甲基苯氧乙酸(HMPA)和对羟甲基苯乙酸(HMPAM)中的一种或多种。但此方法中不限于以上列举的几种，包括凡是可以和氨基发生偶联反应的linker试剂。
按照上述制备方法制得的固相合成介质，由于聚苯乙烯类共聚物微球材料在高度交联后，具有较好的机械强度和耐溶剂溶胀性，因此适合应用于连续流体操作装置中；且由于在该介质表面接枝具有多功能团的聚合物长链，达到了降低材料表面疏水性及增加功能基团的作用，在固相合成多肽应用领域有很高的价值。例如聚乙烯基苄氯与乙二醇二甲基丙烯酸酯(PCMS-EDMA)整体柱(交联度为50％质量比，孔径为0.5～10μm)经过接枝聚合物长链改性后，能够继续保持原有的大孔结构，可以耐受较高的压力操作，同时接枝的聚合物长链能够进一步的衍生，连接固相合成用的linker，用作固相合成介质，从而能够应用于大规模的多肽合成生产，满足快速、高效、批次合成多肽的需要。
下面以具体实例对上述制备方法进行详细说明：
实例一、1)PCMS-EDMA整体柱基质的制备
准确称取乙烯基苄氯(CMS)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)各0.5g，偶氮二异丁腈(AIBN)0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各0.75g；
将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中密封后，放于65℃水浴锅中进行反应12h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用甲醇作为流动相，用50mL以0.2mL/min的流速冲洗至其中的致孔剂完全去除。
3)PCMS-EDMA整体柱表面介质聚合HEMA
按照质量比4：1(HEMA:PCMS-EDMA)的比例加入HEMA单体，以及溶剂DMF 20mL,同时加入占HEMA单体摩尔数1％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的催化剂配体Bpy；
混合均匀后利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度65℃下，反应6h；结束反应，再用20mL DMF冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3所得材料质量之比)加入亲水改性整体材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，在60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯甲酸和HMBA)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质的表面形貌用扫描电镜进行观察，可以看到接枝修饰后的柱体表面仍然保持微米级的通孔，证明该固相合成介质能较好的使用于流体连续合成装置中。
实施例二、
1)PCMS-DVB整体柱基质的制备
准确称取CMS和DVB各0.5g，AIBN 0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各0.75g，将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中；密封后，放于68℃水浴锅中进行反应14h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用乙醇作为流动相，50mL以0.3mL/min的流速冲洗至致孔剂去除完全。
3)PCMS-DVB整体柱表面介质聚合HEMA与mPEGA
按照质量比4:4:1(HEMA:mPEGA:PCMS-DVB)比例加入HEMA、mPEGMA(Mn＝470)单体，溶剂DMF 20mL,同时加入占单体HEMA摩尔数的2％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的配体Bpy；
混合均匀后，利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度70℃下，反应8h；结束反应，再用20mL DMF冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3)所得材料质量之比)加入步骤3)所得的材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3)所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯氧乙酸，HMPA)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质的表面形貌用扫描电镜进行观察，可以看到接枝修饰后的柱体表面仍然保持微米级的通孔，证明该固相合成介质能较好的使用于流体连续合成装置中。
实施例三、
1)PCMS-EDMA整体柱基质的制备
准确称取CMS和EDMA分别为0.5g和1g，AIBN 0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各1.13g，将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中；密封后，放于70℃水浴锅中进行反应20h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用乙腈作为流动相，50mL以0.5mL/min的流速冲洗至致孔剂去除完全。
3)PCMS-EDMA整体柱表面介质聚合PEGA
按照质量比4.5：1(PEGA:PCMS-EDMA)比例加入PEGA(Mn＝1600)单体，溶剂DMF 20mL,同时加入占单体PEGA摩尔数的5％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的配体PMDETA；
混合均匀后，利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度80℃下，反应10h；结束反应，再用20mL DMF冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3)所得材料质量之比)加入步骤3)所得的材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3)所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯乙酸，HMPAM)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质的表面形貌用扫描电镜进行观察，可以看到接枝修饰后的柱体表面仍然保持微米级的通孔，证明该固相合成介质能较好的使用于流体连续合成装置中。
实施例四、
1)PCMS-DVB整体柱基质的制备
准确称取CMS和EDMA分别为0.5g和1.0g，AIBN 0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各1.12g，将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中；密封后，放于75℃水浴锅中进行反应24h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用乙醇作为流动相，50mL以0.4mL/min的流速冲洗至致孔剂去除完全。
3)PCMS-DVB整体柱表面介质聚合PEGA和mPEGA
按照质量比5:5:1(PEGA:mPEGA:PCMS-DVB)比例加入PEGA(Mn＝375)、mPEGA(Mn＝1600)单体，溶剂DMF 20mL,同时加入占单体PEGA摩尔数的10％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的配体TMEDA；
混合均匀后，利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度75℃下，反应10h；结束反应，再用20mL DMF冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3)所得材料质量之比)加入步骤3)所得的材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3)所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯氧乙酸，HMPA)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质在连续流体连续装置上进行ACP 65-74合成测试，其ACP 65-74粗产品的纯度用高效液相色谱(HPLC)分析，如图2所示为本发明所举实例合成ACP65-74粗产品的纯度分析HPLC色谱图，从图2中可知：该实例中多肽纯度为91％。
实施例五、
1)PCMS-DEDMA整体柱基质的制备
准确称取CMS和DEDMA分别为0.5g和0.9g，AIBN 0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各1.05g，将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中；密封后，放于75℃水浴锅中进行反应20h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用乙醇作为流动相，50mL以0.5mL/min的流速冲洗至致孔剂去除完全。
3)PCMS-DEDMA整体柱表面介质聚合PEGMA
按照质量比6：1(PEGMA:PCMS-DEDMA)比例加入PEGMA(Mn＝370)单体，溶剂DMF 20mL,同时加入占单体PEGMA摩尔数的8％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的配体Bpy；
混合均匀后，利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度65℃下，反应10h；结束反应，再用20mL DMF冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3)所得材料质量之比)加入步骤3)所得的材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3)所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯氧乙酸，HMPA)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质在连续流体连续装置上进行ACP 65-74合成测试，其ACP 65-74粗产品的纯度用高效液相色谱(HPLC)分析，如图3所示为本发明所举实例中合成ACP65-74粗产品的纯度分析HPLC另一色谱图，从图3可知：该实例中多肽纯度为81％。
实施例六、
1)PCMS-DEDMA整体柱基质的制备
准确称取CMS和DEDMA分别为0.5g和0.9g，AIBN 0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各0.9g，将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中；密封后，放于75℃水浴锅中进行反应20h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用乙醇作为流动相，50mL以0.5mL/min的流速冲洗至致孔剂去除完全。
3)PCMS-DEDMA整体柱表面介质聚合PEGMA和mPEGA
按照质量比3:3:1(PEGMA:mPEGMA:PCMS-DEDMA)比例加入PEGMA(Mn＝1600)、mPEGA(Mn＝1600)单体，溶剂去离子水20mL,同时加入占单体PEGMA摩尔数的3％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的配体Bpy；
混合均匀后，利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度65℃下，反应7h；结束反应，再用20mL去离子水冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3)所得材料质量之比)加入步骤3)所得的材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3)所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯氧乙酸，HMPA)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质在连续流体连续装置上进行ACP 65-74合成测试，其ACP 65-74粗产品的纯度用高效液相色谱(HPLC)分析，如图4为本发明所举实例中合成ACP 65-74粗产品的纯度分析HPLC的另一色谱图，从图4可看出：该实例中多肽纯度为72％。
实施例七、
1)PCMS-EDMA整体柱基质的制备
准确称取CMS和EDMA分别为0.5g和0.7g，AIBN 0.005g，致孔剂十二醇与环己醇各0.9g，将上组分在10mL锥形瓶中混合均匀，然后将该溶液注入不锈钢色谱柱管中；密封后，放于70℃水浴锅中进行反应20h，降温结束反应。
2)去除致孔剂
将步骤1)得到的整体柱连接于液相色谱泵上，用乙醇作为流动相，50mL以0.3mL/min的流速冲洗至致孔剂去除完全。
3)PCMS-EDMA整体柱表面介质聚合PEGMA和mPEGA
按照质量比6:6:1(PEGMA:mPEGMA:PCMS-EDMA)比例加入PEGMA(Mn＝1600)、mPEGA(Mn＝375)单体，溶剂DMSO 20mL,同时加入占单体PEGMA摩尔数的5％的氯化亚铜(CuCl)和与CuCl相同摩尔数的配体HMETETA；
混合均匀后，利用连续流体合成装置将上述反应通过整体柱材料，在温度65℃下，反应7h；结束反应，再用20mL DMSO冲洗柱体以去除其他可溶性杂质，制得亲水单体改性的整体材料。
4)衍生步骤3)所得亲水改性整体材料，偶联linker
a，将二氯亚砜(SOCl2)按照10:1质量比(SOCl2与步骤3)所得材料质量之比)加入步骤3)所得的材料中，同时加入二氯甲烷(DCM)作为溶剂，其加入体积为SOCl2体积的2倍，将该反应液利用流体连续装置通过步骤3)所得的柱体，反应温度为室温，反应时间为12h，反应完毕后，以DCM冲洗材料表面，以去除副产物；
b，将邻苯二甲酰亚胺按照与上述氯化后的材料相同质量的比例加入DMF中配制成均匀溶液，同样采用连续流体装置将该溶液通过上述步骤a得到的柱体中，120℃下反应12h，反应完毕后，用DMF冲洗柱体；
c，将等质量的酰肼(与上述步骤3)所得材料的质量相等)加入20mL乙醇中，配制成均匀溶液，同样利用流体连续装置将上述溶液通过上述步骤b所得的材料中，60℃下反应12h,最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
d，将linker试剂(对羟甲基苯乙酸，HMPAM)按照5:1质量比加入到胺化后的整体材料中，并加入20mL DMF；另外，加入与HMPA等摩尔比的HOBt、HBTU、DIEA，室温下反应2h，反应完毕后，以20mL DMF冲洗柱体以去除其他杂质，制得偶联linker的固相合成介质。
最后所得固相合成介质在连续流体连续装置上进行ACP 65-74合成测试，其ACP 65-74粗产品的纯度用高效液相色谱(HPLC)分析，如图5所示为本发明所举实例中合成ACP65-74粗产品的纯度分析HPLC的另一色谱图，从图5中可知：该实例中多肽纯度为59％。
进一步的，为检验改性聚乙烯基苄氯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚(PCMS-EDMA)整体材料的固相合成效率，测定了该介质的在多肽合成中的合成效率，将改性后的PCMS-EDMA整体柱(规格为φ4.6×50mm)连接于自行设计的连续流体固相合成装置中，进行酰基载体蛋白片段65-74(ACP 65-74)的合成测试，结果表明该改性PCMS-EDMA整体柱的合成效率大大提升，提高了多肽粗产品的纯度，最高纯度甚至可达90％以上。
综上所述，通过本发明所述方法制备的固相合成介质具有微米级通孔，并具有高交联度的非溶胀性。由于聚苯乙烯类共聚整体材料具有0.5～10μm的微米级的通孔，具有高交联度，机械性能好的特点，适合在连续流体操作技术中进行固相合成；另外，用亲水性单体进行接枝聚合改性表面后，赋予材料表面大量的羟基，大大提高了载量，同时由于聚合物长链在材料孔道表面呈伸展状态，能够增强反应位点与反应试剂之间的接触几率，所以可以显著提高合成效率，能够应用于大规模的多肽合成生产，满足快速、高效、批次合成多肽的需要。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤1、将一定比例的苯乙烯类单体、交联剂和致孔剂混合均匀后，注入反应模具中，并升温至一定温度进行原位共聚反应一段时间，得到整体聚合物材料；
步骤2、将步骤1得到的整体聚合物材料以索氏提取或连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂，得到整体多孔材料；
步骤3、利用亲水性的乙烯基单体对步骤2所得到的整体多孔材料的孔道表面进行接枝聚合改性；
步骤4、将表面接枝的聚合物长链上的大量羟基逐步进行衍生，并链接linker基团,得到链接linker的固相合成介质。
2.根据权利要求1所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，
所述苯乙烯类单体包括聚乙烯基苄氯；
所述交联剂包括：二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和二乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种；
所述致孔剂由十二醇和环己醇按照质量比1:1组成。
3.根据权利要求1所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：
首先将苯乙烯类单体与交联剂按照质量比1:1～1:2进行混合；
然后加入致孔剂，该致孔剂质量为所述苯乙烯类单体与交联剂质量和的1.5倍；
再加入引发剂偶氮二异丁腈，将上述组分完全混合形成均匀溶液；
将所述溶液装入一定形状的反应模具中，密封后放置于水浴锅中，其中聚合温度范围为60～80℃，反应时间为12～24h，最终制得整体聚合物材料。
4.根据权利要求1所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，在步骤2中以连接至液相色谱泵冲洗的方法去除内部的致孔剂，具体包括：
将所述反应模具连接于液相色谱泵，用甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种混合物的溶剂作为流动相，进行冲洗以去除致孔剂；
其中，冲洗流速为0.2～0.5mL/min，流动相所采用的溶剂体积为50～100mL。
5.根据权利要求1所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，在步骤3中，利用亲水性的乙烯基单体对步骤2所得到的整体多孔材料的孔道表面进行接枝聚合改性，具体包括：
向步骤2所得到的整体多孔材料中加入一定比例的亲水性单体、溶剂和原子转移自由基聚合引发剂；
在65～80℃的反应温度下对材料表面进行接枝聚合反应，反应时间为4～12h；
然后对反应后的材料进行清洗，得到表面带有大量羟基的亲水接枝改性材料。
6.根据权利要求5所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，
所述亲水性单体包括：甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸聚乙二醇酯、单甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯、丙烯酸聚乙二醇酯和单甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯中的一种或者多种的混合物；
所述溶剂包括：去离子水、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和二氧六环中的一种或多种的混合物；
所述原子转移自由基聚合引发剂具体包括组分：氯化亚铜和催化剂配体；其中，所述催化剂配体包括：2,2-联二吡啶、四甲基乙二胺、N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺和1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺中的一种或多种的混合物。
7.根据权利要求6所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，
所述亲水性单体的加入比例为步骤2所得到的整体多孔材料质量的3～6倍；
所述原子转移自由基聚合引发剂中的氯化亚铜的加入比例为所述亲水性单体摩尔数的1～10％，且所述氯化亚铜和催化剂配体的摩尔比为1:1。
8.根据权利要求1所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，在步骤4中，所述将表面接枝的聚合物长链上的大量羟基逐步进行衍生，并链接linker基团,得到链接linker的固相合成介质，具体包括：
将步骤3得到的表面接枝的聚合物长链上的大量羟基分别逐步进行衍生，依次为卤化、胺化和偶联linker基团，得到链接linker的固相合成介质。
9.根据权利要求8所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，所述卤化过程具体包括：
将二氯亚砜按照与步骤3改性后的材料质量比为10:1的比例加入到步骤3改性后所得的材料中；同时加入二氯甲烷作为溶剂，其加入体积为二氯亚砜体积的2倍，其中反应温度为室温，反应时间为12h；在反应完毕后，以二氯甲烷冲洗材料表面，以去除副产物；
所述胺化过程具体包括：
首先将邻苯二甲酰亚胺加入上述卤化后的材料中，同时加入二甲基甲酰胺作为溶剂，在120℃下反应12h；然后将酰肼加入上述反应后所得的材料中，同时加入乙醇作为溶剂，在60℃下反应12h；最后用乙醇进行清洗，清洗完毕后得到胺化后的整体材料；
所述偶联linker基团的过程具体包括：
将linker试剂按照该linker试剂与所述胺化后的整体材料质量比为5:1的质量比加入到所述胺化后的整体材料中，同时加入二甲基甲酰胺作为溶剂；再加入缩合剂1-羟基苯并三氮唑、2-1H-苯并三偶氮L-1-基-N,N,N’,N’,-四甲基异脲六氟化磷、二异丙基乙胺，具体按照与所述linker试剂摩尔比1:1:1:1的比例加入；然后在室温下反应2h。
10.根据权利要求9所述基于整体聚合物材料的固相合成介质的制备方法，其特征在于，
所述linker试剂包括：对羟甲基苯甲酸、对羟甲基苯氧乙酸和对羟甲基苯乙酸中的一种或多种。
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