CN104479013A - 一种抗Aβ42寡聚体的单链抗体及编码该单链抗体的基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种用于诊断与治疗阿尔茨海默病(老年痴呆症)的单链抗体及编码这种单链抗体的基因。更具体地，本发明提供了一种包括重链可变区、轻链可变区和连接肽序列的人源性抗Aβ42寡聚体的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的单链抗体能特异性识别并结合Aβ42寡聚体，降低Aβ42寡聚体的水平，有效抑制Aβ42寡聚体的细胞毒性，并且能够有效穿透血脑屏障体外模型。本发明还同时提供了编码该单链抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

Description

一种抗Aβ42寡聚体的单链抗体及编码该单链抗体的基因

技术领域

本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种特异性识别并结合β-淀粉样蛋白(Aβ42)寡聚体的单链抗体及编码该单链抗体的基因。

背景技术

阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经退行性疾病，其病理特征是渐进性的Aβ42的聚集与沉积、神经突触丢失和神经纤维缠结，临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍。对于AD的发病机理有多种观点，其中普遍认同的是Aβ42毒性学说。

大量研究已证明，由Aβ42单体聚集形成的Aβ42寡聚体是引起AD的主要致病因子。然而，目前国际上试验的诊断或治疗AD用抗体，大多是针对Aβ42一级序列的，这些抗体与Aβ42单体、寡聚体或纤维均能结合，而非特异地识别并结合Aβ42寡聚体，在病理检测及临床诊断中无法特异地检测出Aβ42聚集体的水平，同时，这类抗体在对AD的治疗中也易引起副作用。

在AD的被动免疫治疗报道中，多数采用的是人源化的多克隆抗体或单克隆抗体，但这些抗体因分子大不易穿过血脑屏障或特异性差易引起副作用而限制了在临床上的应用。为克服这些限制，从构建小分子人源性抗体或抗体片段出发，筛选特异性识别和结合Aβ42寡聚体的单链抗体成为目前诊断或治疗AD的热点。

单链抗体(single chain Fv,scFv)是一种小分子的基因工程抗体，它是在DNA水平上利用基因工程方法将天然抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段人工合成的链接肽(Linker)连接而成的小分子重组抗体。与完整抗体分子相比，它具有以下特点：含有完整的抗体可变区，具有较完整的抗原结合位点；不含有抗体分子的Fc段，因而免疫原性弱，用于人体不易产生免疫反应；分子量小，穿透力强，易穿过血脑屏障，适用于AD的诊断或治疗；体内循环半衰期短，易从血循环中排除；不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子，所以利于进行基因工程操作和可以利于原核表达系统大量生产。因此，单链抗体是目前报道最多、也最有发展前景的抗AD的基因工程抗体。

虽然目前国际上已有抗Aβ42的单链抗体的报道(Fukuchi K，2006，Biochem Bioph Res Co,344，79-86；Yoshihara T等，2008，J Biochem,143，475-486；Zameer A等，J Mol Biol,384，917-928；Robert R等，2009,Protein Eng Des Sel.22，199-208)，但这些单链抗体对 Aβ42寡聚体的特异性不高，亲和性也有限，而且未显示出明显的可诱导Aβ42寡聚体解聚的功效。迄今为止，国内尚未见有特异性结合Aβ42寡聚体、并可有效诱导其解聚的单链抗体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别并结合Aβ42寡聚体的单链抗体以及编码这种单链抗体的基因。

本发明解决了现有抗体无特异性地与包括Aβ42单体在内的所有Aβ42形式均可结合的技术问题，利用基因工程抗体技术成功筛选出特异性与Aβ42寡聚体结合，而不与Aβ42单体及纤维结合的单链抗体。本发明所述的单链抗体与Aβ42寡聚体特异性结合的特性与Aβ42的一级结构无关，而是基于Aβ42寡聚体所特有的空间立体构象，是构象依赖型的单链抗体。

本发明所述的Aβ42寡聚体是由2个到几十个不等的Aβ42单体聚集形成的聚集体，分子间主要以氢键和疏水键相结合，分子量从9kDa至100kDa不等。

本发明提供了一种包括重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的人源性抗Aβ42寡聚体的单链抗体MO6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子量约为28kDa，其中VH具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码前面所述的人源性抗Aβ42寡聚体的单链抗体MO6的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的单链抗体MO6能够有效抑制Aβ42单体的聚集，还能够使Aβ42寡聚体解聚，并能明显降低Aβ42寡聚体对神经细胞的毒性，在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。

进一步，本发明所述的单链抗体MO6能够有效穿透血脑屏障体外模型。

再进一步，本发明所述的编码一种人源性抗Aβ42寡聚体的单链抗体MO6的基因可与pET-28a、pET-41b、pMA5或片pPZW103构建基因工程表达载体，该基因及该基因工程表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。

本发明所述的单链抗体MO6能够特异性识别并结合Aβ42寡聚体，作为检测Aβ42寡聚体的临床诊断制剂和AD治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：pET28a-MO6重组表达载体的测序谱图；

图2：纯化的单链抗体MO6的SDS-PAGE图谱，其中M：蛋白质Marker；A： 阴性对照；B:表达的MO6；C：纯化的MO6；

图3：单链抗体MO6与不同形态Aβ42的识别的Dot-Blot分析谱图；

图4：ELISA检测MO6与Aβ42寡聚体的亲和性曲线图；

图5：单链抗体MO6与不同分子量Aβ42的识别Western blot分析谱图；

图6：ThT-F法分析单链抗体MO6抑制Aβ42聚集的谱图，其中A图为Aβ42单体分析谱图，B图为Aβ42寡聚体分析谱图；

图7：MTT法测定单链抗体MO6抑制Aβ42细胞毒性的柱形图。

图8：单链抗体MO6穿透体外血脑屏障模型的柱形图。

具体实施方式

实施例1 Aβ42寡聚体和Aβ42纤维的制备

Aβ42单体(购自美国sigma公司)用冰预冷的六氟异丙醇(HFIP)溶解至浓度为1mg/mL，冰水浴超声10min，真空干燥，-20℃冻存。使用时，先将Aβ42单体用二甲基亚砜(DMSO)溶解至浓度为1mg/mL，再将Aβ42稀释到浓度为10μM的磷酸盐缓冲液(pH 7.4，50mM)中，终浓度为10μM，在37℃分别孵育12h形成Aβ42寡聚体的聚集状态以及孵育3天形成成熟纤维的聚集状态。所有Aβ42聚集状态均通过电镜确认。由于Aβ42形成聚集体的不可逆性，Aβ42的寡聚体及纤维的使用均为现用现制备，若短期使用则于-80℃储存。

实施例2 阳性克隆的筛选

(1)外周血淋巴细胞RNA提取及反转录合成cDNA

外周血淋巴细胞分离提取：用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)抗凝管采集人外周血血样10mL，用无钙、镁离子的平衡盐缓冲液(D’Hanks)(购自碧云天生物技术研究所)以1:1体积稀释，以稀释血样与淋巴细胞分离液＝2:1(体积比)的比例加入聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液(购自美国sigma公司)。室温下，以2000rpm/min离心20min。离心后，吸取单个核细胞层。用D’Hanks洗涤细胞，1000rpm/min离心10min，获得外周血淋巴细胞。

外周血淋巴细胞RNA提取：在1×10⁷个外周血淋巴细胞中加入1mL苯酚-异硫氰酸胍总RNA抽提试剂(-Reagent)(购自Invitrogen公司)4℃静置5min。加入200μl氯仿，上下颠倒至溶液出现浆白色。置于冰上5min。在4℃条件下，12000rpm/min离心15min。将上层水相移入另一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育10min。以4℃条件下，12000rpm/min，离心10min。弃上清，在沉淀(含RNA) 中加1mL 75％(体积分数)乙醇洗涤。在4℃条件下，12000rpm/min离心5min，得到RNA沉淀。空气干燥后，用适量三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE)或无RNA酶的去离子水溶解备用。

反转录合成cDNA：在反转录酶的作用下用上述提取的RNA合成cDNA的方法如下，取4μl RNA加入到0.1mL离心管中，加入寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸引物(Oligo dT Primer)1μl和脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP)1μl，最后以无RNA酶去离子水补充至10μl，65℃保温5min后，于冰浴中迅速冷却。在上述离心管中加入反转录缓冲液(5×PrimerScriptⅡ Buffer)4μl、RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)0.5μl、反转录酶(PrimerScriptⅡ RTase)1μl，最后以无RNA酶去离子水补充到20μl，缓慢混匀。以42℃ 30-60min，95℃ 5min的条件进行反转录反应后，冰上冷却。

(2)编码VH与VL的DNA片段扩增

依据VH和VL的保守序列，设计并合成了扩增编码VH和VL的DNA片段的引物，其序列如下：

VHS1 5′ GGAATTCCATATGCAGGTGCAGCTGGTG 3′

5′ CCTGAGCCACCTCCGCCAGAACCGCCTCCACCTGAAGAGACGGT

VHA1

GACCGTTGTCC 3′

5′ TGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGAGGATCGGATATCCAGATGA

VLS1

CTCAGTCTCC 3′

VLA1 5′ ATAAGAATGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACTTTGGTCC 3′

其中VHS1 5’端的CATATG序列是内切酶Nde Ⅰ识别位点，VLA1 3’端的GCGGCCGC序列是内切酶Not Ⅰ识别位点。 

扩增过程如下：

上述步骤(1)中制备的cDNA用无RNA酶的去离子水释50倍后，取1μL分别加入如下扩增编码VH、VL的DNA片段的PCR体系中，编码VH的DNA片段扩增体系：VHS1(25μmol/L)0.4μL，VHA1(25μmol/L)0.4μL；编码VL的DNA片段扩增体系：VLS1(25μmol/L)0.4μL，VLA1(25μmol/L)0.4μL；两体系再各加入DNA聚合酶(r-Taq)0.1μL，dNTPs 0.8μL，10×buffer 1μL，无RNA酶的去离子 水6.3μL，分别进行目的基因的扩增：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min作用30个循环，72℃ 10min。最后各取1μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分凝胶电泳后用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收编码VH、VL的DNA片段。

(3)编码scFv的DNA片段的拼接和扩增

拼接体系如下：编码VH的DNA片段2μL[来自步骤(2)]、编码VL的DNA片段1μL[来自步骤(2)]，dNTPs 0.8μL，10×buffer 1μL，r-Taq DNA聚合酶0.1μL，无RNA酶的去离子水5.1μL，在如下条件下实现编码scFv的DNA片段的拼接：94℃ 5min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，作用30个循环，72℃ 10min，4℃保存。

编码scFv的DNA片段的扩增：将拼接后的编码scFv的DNA片段稀释50倍，取5μL加入如下扩增体系中：VHS1 2.5μL，VLA1 2.5μL，r-Taq DNA聚合酶0.5μL，dNTPs 4μL，10×buffer 5μL，无RNA酶的去离子水30.5μL，扩增条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，作用30个循环，72℃ 10min。取1μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收(购自上海生工生物工程有限公司)。

(4)阳性克隆的筛选

引物中所设计的Nde Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点与本发明所用的原核表达载体pET28a(通用的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、C-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)的Nde Ⅰ和Not Ⅰ相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。利用Nde Ⅰ和Not Ⅰ切割位点将此人源scFv基因片段克隆进表达载体pET28a中Nde Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点之间，连接便得到重组表达载体。

上述表达载体的构建步骤具体如下：

双酶切反应：将1.0μg pET28a载体和上述获得的scFv基因片段分别与适量去离子水混匀，使其总体积分别为18μL，各加入2-3单位的限制性内切酶Nde Ⅰ和2-3单位的Not Ⅰ及2μL相应的10×H缓冲液，混匀，置37℃水浴保温2-3小时后，分别采用凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的DNA(购自上海生工生物工程有限公司)。

编码scFv的DNA片段与pET28a载体的连接：取0.5μg上述步骤回收的pET28a载体DNA，加入2-10倍摩尔量的上述步骤得到的编码scFv基因片段、2μL10×T4 DNA连接酶缓冲液，加入去离子水定容置20μL，最后加入1单位的T4 DNA连接酶，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置16℃水浴过夜，得到连接好的重 组表达载体pET28a-scFv。

重组表达载体pET28a-scFv转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞【E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备方法参照“分子克隆实验指南”(第二版，科学出版社)49页】中，冰浴30分钟后置入42℃水浴保温1分钟，立即取出并置冰浴中冷却2分钟。加入200μL 37℃预热的LB液体培养基，37℃ 150rpm振摇培养60分钟后，取出100μL培养液涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂培养平板上，37℃培养12h后，出现转化菌落。

挑取单克隆到96孔细菌培养板上(购自美国Corning公司)，每孔加入LB液体培养基200μL，培养基中含有100μg/mL卡那霉素(Kan)。37℃ 200rpm振摇培养过夜。每孔吸取2μL菌液，加入到另外一块新的96孔细菌培养板中，每孔添加LB培养基200μL，培养基含有100μg/mL Kan，37℃200rpm振摇培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0。再向第一块板加入一定体积的甘油，甘油终浓度为15％，-80℃保存。向第二块96孔板中每孔加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(购自美国sigma公司)至终浓度为0.05mM，20℃，160rpm振荡诱导12h后，用96孔板离心机以4000rpm离心10分钟，弃去培养基收集菌体。再向96孔板中加入菌体裂解液冰浴裂解1小时，4000rpm离心10分钟，收集裂解后的总蛋白。

用10μg/mL的Aβ42寡聚体(来自实施例1)以100μL/孔包被96孔酶标板(购自美国Corning公司)，4℃，16-18h。弃抗原液，每孔加入100μL 1％(体积比)的牛血清白蛋白(BSA)，于37℃封闭1h。磷酸盐缓冲液(PBS)[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗板三次，每孔加入100μL上述收集到的总蛋白，37℃孵育2h。阳性对照孔加商品化Aβ抗体B4(购自美国Santa cruz公司)，阴性对照孔加BSA。PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗板六次。加入100μL 1:2000(体积比)稀释的anti-His单抗(购自美国Santa cruz公司)，37℃孵育1h。PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗板六次。加入100μL 1:4000(体积比)稀释HRP羊抗兔IgG抗体(购自中国博士德公司)，37℃孵育1h。PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗板六次。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB(购自美国Amresco公司)50μL/孔，室温避光反应15min，每孔加30μL 2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪测OD值(波长为450nm)。结果判定：以OD值超过阴性对照3倍为阳性，空白对照的OD值应小于0.2。经结果鉴定，筛选出一株与抗原结合力较强的单克隆菌株MO6进行后续实验。

实施例3 单链抗体MO6基因的DNA序列测定

提取质粒pET28a-MO6，交由上海生工测序部进行序列测定，结果如图1 (pET28a-MO6载体测序谱图，其中编码MO6的基因为核苷酸38～808号)所示。将所测得的有效的MO6基因序列与GeneBank中的免疫球蛋白基因序列进行比对分析，结果证明：所获得的MO6克隆为一编码scFv的DNA序列，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA(其有效核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，它包含了编码抗体重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的DNA序列，推导得到的氨基酸序列(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)具有典型的抗体可变区结构。

实施例4 单链抗体MO6的表达和制备 

将含有pET28a-MO6质粒的E.coli BL21(DE3)37℃振摇培养过夜。以1:100的比例接种，37℃振荡培养OD₆₀₀＝0.8～1.0后加入IPTG诱导MO6的表达，20℃，160rpm振荡诱导12h后，4℃ 5000rpm离心5min收集菌体。以PBS(pH7.4)重悬菌体，经超声破碎后离心收集上清。对收集的上清使用Ni²⁺-NTA柱纯化本发明的人源性单链抗体MO6：将上清液缓慢流过Ni²⁺-NTA柱，然后用8倍柱体积缓冲液(20mM磷酸缓冲液，500mM氯化钠，20mM咪唑)洗柱，最后用洗脱缓冲液(20mM磷酸缓冲液，500mM氯化钠，250mM咪唑)洗脱本发明的人源性单链抗体MO6。图2示出了所制备的人源性单链抗体MO6的SDS-PAGE鉴定结果，纯化得到的人源性单链抗体MO6分子量约为28kDa。

实施例5 Dot-blot检测单链抗体MO6与Aβ42寡聚体的结合特异性

将Aβ42单体、寡聚体及纤维置于硝酸纤维素膜上，以5％(体积比)脱脂奶粉封闭膜，置室温1h。加入单链抗体MO6孵育1h后，用PBS洗膜3次，每次10min。再加入His-tag抗体[1：1000(体积比)]，37℃孵育1h，用PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗涤膜3次，每次10min。将膜加入到HRP标记的rabbit IgG[1:5000(体积比)]中，37℃孵育1h。PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗涤膜3次，每次10min。PBS洗膜1次，10min。将膜经底物发光显色试剂盒(ECL)(购自碧云天生物技术研究所)显影，结果如图3所示，只在Aβ42寡聚体处显示出斑点，而在Aβ42单体和纤维形态中不显示斑点。

实施例6 单链抗体MO6亲和力的测定 

用间接ELISA方法测定单链抗体MO6的亲和力，并以抗原抗体复合物的平衡解离常数(KD)表示。用1μg/mL浓度的Aβ42寡聚体包被酶标板4℃过夜，用1％的BSA于37℃封闭1h，在另外一个酶标板中将单链抗体MO6与10^-10～10^-4mol/L浓度的Aβ42寡聚体混合，加入等体积的封闭液室温孵育1h，再将混合液加入抗原包被孔 内，37℃孵育2h，PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗涤后，每孔加入100μL 1：2000(体积比)稀释的anti His-Tag抗体，37℃孵育1h，PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗涤后加入TMB显色，测定450nm光密度值(OD₄₅₀)如图4所示。K_D为达到最大OD₄₅₀值的50％时Aβ42寡聚体浓度，由实验数据得知，K_D为5.19×10^-6M。

实施例7 Western blot检测单链抗体MO6对Aβ42寡聚体的识别

Aβ42混合物(单体、寡聚体、纤维体积比为1：1：1)经非变性凝胶电泳分离后，转移到聚偏二氟乙烯PVDF膜上，以5％(体积比)脱脂牛奶封闭1h。用PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗膜3次，每次10min。将膜置于杂交袋中，加入单链抗体MO6，对照组加入B4抗体[1:1000(体积比)]，室温杂交2h后，PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗膜3次，每次10min。将膜置于杂交袋中，实验组加入anti His-Tag[1:1000(体积比)]抗体，室温杂交1h后，PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗膜3次，每次10min。各组分别加入相应的HRP标记的IgG[1:15000(体积比)]，室温杂交1h。PBS[含有0.1％(体积比)Tween-20]洗膜3次，每次10min。加入ECL显色，结果如图5所示：MO6能够特异性识别分子量为18KDa～35KDa的区域，即Aβ42寡聚体区域，而对Aβ42单体、Aβ42纤维形式没有明显结合。

实施例8 单链抗体MO6对Aβ42聚集的抑制作用

分别将Aβ42单体(购自美国sigma公司)、Aβ42寡聚体(来自实施例1)与等摩尔的单链抗体MO6混合，37℃孵育，分别在0h，3h，12h，24h和48h用硫磺素T荧光染色(ThT-F)法测定Aβ42的聚集程度，结果如图6所示。存在单链抗体MO6时，Aβ42单体孵育至48h时聚合程度始终明显低于单独Aβ42的聚合度，而Aβ42寡聚体孵育至12h时，其聚集程度始终低于初始状态，由此证明单链抗体MO6不仅可以抑制Aβ42的聚集，还可诱导Aβ42寡聚体解聚。

实施例9 单链抗体抑制Aβ42寡聚体对细胞的毒性作用

将SH-SY5Y细胞以每孔5000个细胞接种多孔细胞培养板，每孔体积100μL。细胞于37℃培养24h后，进行以下13组实验：

以上13组分别在37℃孵育20h后，每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(购自美国sigma公司)溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，MTT法检测细胞的存活率，结果如图7所示，Aβ42寡聚体使细胞存活率显著性降低，而经单链抗体MO6作用能够明显升高细胞存活率，并且MO6抑制Aβ42寡聚体对细胞的毒性作用呈浓度依赖性。然而，单链抗体MO6对Aβ42单体及纤维抑制作用不显著。这些结果也说明了，单链抗体MO6与Aβ42寡聚体形态的亲和能力较强，能够有效的结合Aβ42寡聚体并抑制其对细胞的毒性作用。

实施例10 体外血脑屏障模型建立及单链抗体穿透血脑屏障的检测

应用人脐静脉血管内皮细胞HUVEC及胶质瘤细胞C6进行共培养的方法，建立体外血脑屏障模型。

共培养方法如下：人脐静脉血管内皮细胞HUVEC培养条件：在Ham's F12K培养基中加入终浓度为2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，0.03mg/mL内皮细胞生长因子支持物(ECGS)，及10％胎牛血清。

胶质瘤细胞C6培养条件：在DMEM-F12培养基中加入终浓度为10％胎牛血清。 

先将C6细胞以45,000个/孔接种于PET膜的底面，贴壁后将transwell小室正置，受池加入适量培养基，2～3天后在PET正面以30,000个/孔接种HUVEC细胞，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下共培养5～7天。

鉴定：

a.光学显微镜下观察

b.试漏实验：使transwell小室内外液面差达0.5cm以上，培养4h后观察液面差的变化。

c.检测跨内皮电阻值(transendothelial electrical resistance,TEER)：使用MilliCell-ERS Voltohmmeter测量HUVEC与C6细胞共培养双侧电阻值。每天更换新 鲜培养基同时测量TEER值，直至显微镜下确认细胞已完全融合且TEER值达到稳定。

单链抗体穿透血脑屏障的检测：当HUVEC/C6细胞共培养5～7天，检测TEER值达到630ohm/cm²并稳定后，进行单链抗体跨血脑屏障转运检测实验。在小室内加入5μg单链抗体MO6。当5min，15min，30min，60min，90min，及120min时，在小室外侧吸取60μl样品，加入到酶标板中，4℃包被过夜。ELISA方法检测单链抗体MO6穿透血脑屏障。结果如图8所示，单链抗体MO6穿透血脑屏障随时间增长而增加，并且在60min后穿透率达到峰值并呈现稳定。结果证明，单链抗体MO6能够有效穿透血脑屏障。

Claims (10)

1.一种单链抗体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：是人源化抗体。

3.权利要求1或2所述的单链抗体在检测Aβ42寡聚体方面的应用。

4.权利要求1或2所述的单链抗体在抑制Aβ42单体聚集方面的应用。

5.权利要求1或2所述的单链抗体在促使Aβ42寡聚体解聚方面的应用。

6.权利要求1或2所述的单链抗体在制备抗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。

7.一种单链抗体基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

8.权利要求7所述的单链抗体基因在制备抗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。

9.一种基因工程重组表达载体，其特征在于：是由权利要求7所述的单链抗体基因与pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103载体重组构建得到。

10.权利要求9所述的基因工程重组表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。