CN104478780A

CN104478780A - 酰基吡咯类小分子有机化合物及其衍生物、用途及其制备方法

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Publication number: CN104478780A
Application number: CN201410653320.7A
Authority: CN
Inventors: 陈益华; 刘明耀; 易正芳; 杨飞飞; 代付军
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2014-11-17
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2034-11-17
Also published as: CN104478780B

Abstract

本发明公开了一种由结构式(I)表示的酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，含有本发明化合物或其药物组合物在制备促进血管新生的药物中的用途，及其在制备促进伤口愈合、糖尿病病足及心血管疾病药物中的用途，本发明还公开了此类酰基吡咯类小分子有机化合物及其衍生物的制备方法。

Description

酰基吡咯类小分子有机化合物及其衍生物、用途及其制备方法

技术领域

本发明涉及一类酰基吡咯类小分子有机化合物及其合成方法，以及其或其药物组合物在制备促进血管新生药物中的应用。

背景技术

机体的血管新生受到促进和抑制血管生成因子的调控，维持在稳定状态，促血管生长因子包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，其中VEGF和FGF与血管新生之间关系的研究较为深入。血管新生抑制因子主要有：血管新生抑制素(angiostatin)、内皮细胞抑制素(endostatin)、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPS)、迁移抑制因子(MIG)等。血管新生在正常生理状态下发挥重要作用，如胚胎的生长。许多疾病的发生则伴随着机体对血管新生的调控失衡，血管新生过度的疾病如癌症，反之有些病理过程则伴有新生血管不足，无法满足机体的需要，如伤口愈合，这种情况就需要促进血管新生。

现在研究的比较多的促进血管新生的方法有：(1)基因治疗，但是基因治疗存在诸多问题如基因治疗的安全性，是否特异性长效表达；基因的转染率等。(2)蛋白治疗，主要是VEGF蛋白治疗，存在的问题主要是蛋白的生物半衰期短，因此疗效短暂需反复给药同时给药剂量给药次数差异大；大量全身应用会引起NO介导的血压下降心率加快，因此目前已很少采用。(3)干细胞治疗，费用昂贵。(4)中药治疗，虽然有效，但是由于中药成分复杂，研究深度不够，作用机制不明确，距离实际应用还有很大的距离。毋庸置疑，血管新生相关研究已经成为心血管等重要疾病的治疗策略，然而，目前临床上仍未出现具有明确作用机制的促血管新生类药物，这不仅因为血管新生是一个极为复杂的过程，而且与药物本身的相适性也有密切关系。这些现实问题要求药物化学工作者开发一类新的具有促进血管新生作用并且成药性良好的小分子化合物。

与血管新生不足相关的疾病主要有伤口愈合缓慢、糖尿病病足、缺血性心血管疾病、类风湿性关节炎等，这些疾病的发生严重影响了人们的正常生活，然而目前临床上仍未出现一个具有明确作用机制的促血管新生类药物。

发明内容

本发明创造性地设计和合成了一类酰基吡咯类小分子有机化合物，深入研究后发现本发明化合物具有促进血管新生的作用，可有效应用于促进伤口愈合、糖尿病病足及心血管疾病的治疗，对于伤口愈合、糖尿病病足及心血管疾病等的治疗具有良好促进作用。

本发明第一个目的是提供一类结构新颖的具有促进血管新生效果的酰基吡咯类小分子有机化合物。本发明酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，其结构式如式(I)所示：

其中：n＝0-2；R₁选自下列基团中的一个或多个：磺胺基、甲磺基、酯基、硝基、N，N-二乙基乙酰胺基、N-苄基乙酰胺基、或卤素；NR₂R₃为吡咯烷基、哌啶基、N-甲基哌嗪基、氨乙基吗啉基、吗啉基、二乙胺基、二烯丙基胺基、丙胺基、氨基乙酸甲酯基、氨基乙酸乙酯基、脯氨酸甲酯基、谷氨酸二甲酯基、或苯丙氨酸甲酯基。

本发明的第二个目的是提供任一前述化合物或其药学上可接受的盐，包括但不限定与下列酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乳酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸等。

本发明酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，当R₁为SO₂R₄时，则其结构如式(II)所示：

其中：n＝0-2；NR₂R₃为吡咯烷基、哌啶基、N-甲基哌嗪基、氨乙基吗啉基、吗啉基、二乙胺基、二烯丙基胺基、丙胺基、氨基乙酸甲酯基、氨基乙酸乙酯基、脯氨酸甲酯基、谷氨酸二甲酯基、或苯丙氨酸甲酯基；R₄为氨基、胺基或甲基。

本发明酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，当R₁为SO₂NH₂；NR₃R₄ 为含氮五元或者六元杂环时，其结构如式(III)所示：

其中：m＝0或者1；n＝0-2；X为CH₂、O或NCH₃。

本发明式(I)酰基吡咯类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐，包括：

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯甲酸甲酯；

N，N-二乙基-4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯甲酰胺；

N-苄基-4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯甲酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]硝基苯；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]氯苯；

N-{4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯基}乙酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-哌啶基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(4-甲基-1-哌嗪基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-{2，5-二甲基-3-[2-(2-(4-吗啉基乙胺)-乙酰基)-1-吡咯基}苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(4-吗啉基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(3-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(4-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]甲磺酰基苯；

N，N-二乙基-4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-二乙胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-双烯丙基胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-丙胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-胺基乙酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-胺基乙酸乙酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-脯氨酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-谷氨酸二甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-苯丙氨酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺。

本发明第二个目的是提供一种药物组合物，其含有上述的酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。本发明公开了由上述化合物所制备的用于促进血管新生作用的药物组合物及其制药用途。

在一个具体实施方案中，所述药物组合物被配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。在另一具体实施方案中，所述酰基吡咯类小分子有机化合物是包括但不限于用放射性、荧光基团或者生物素(Biotin)标记的。

本发明的另一目的是提供酰基吡咯类小分子化合物的制备方法。所述制备方法包括方法1和方法2。所述制备方法包括以下步骤：

方法1：

由化合物I和相应的酮进行扣环合成化合物II，化合物II在乙醚、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、二氧六环、四氢呋喃等溶剂中，通入干燥的盐酸气体反应然后抽滤产物在水中回流过夜得化合物III，化合物III在适当的溶剂如二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜等与不同取代的氨或醇偶联生成母体化合物IV，反应完毕后一般用冰水淬灭，用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等萃取，依次用水、饱和食盐水洗涤，干燥，低温减压除去溶剂，经柱层析得最终产物，产率视反应物IV和卤代烃的性质而定。从20％-60％，得到的产物用核磁共振、质谱等方法来证明。

方法2：

由化合物I和相应的酮进行扣环合成化合物II，化合物II在二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、二氧六环、四氢呋喃等溶剂中，与不同链长的氯代酰氯反应得化合物III，化合物III在适当的溶剂如二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜等与不同取代的氨或醇偶联生成母体化合物IV，反应完毕后一般用冰水淬灭，用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等萃取，依次用水、饱和食盐水洗涤，干燥，低温减压除去溶剂，经柱层析得最终产物，产率视反应物IV和卤代烃的性质而定。从20％-60％，得到的产物用核磁共振、质谱等方法来证明。

本发明创新及有益效果包括：本发明提供了一类结构新颖的血管新生促进剂酰基吡咯类小分子有机化合物及其药学上可接受的盐、代谢物、异构体以及前药等，可作为促进血管新生药物先导化合物和临床药物候选化合物。本发明化合物在体外和体内均能促进血管新生。在体外血管内皮细胞迁移实验中，本发明化合物对血管内皮细胞的迁移有明显的促进作用。在多个疾病动物模型中，本发明化合物均能有效地促进血管新生。

附图说明

图1-3所示为本发明化合物具有抑制内皮细胞凋亡的作用。其中，图1是本发明化合物处理人脐静脉血管内皮细胞的情况，说明本发明化合物对内皮细胞的增殖无显著影响；图2是本发明化合物处理人脐静脉血管内皮细胞后的凋亡情况；图3是人脐静脉血管内皮细胞在饥饿条件下经本发明化合物处理后的结果。

图4所示为本发明化合物具有促进血管内皮细胞体外迁移的作用。其中，图4A和4B是在划痕试验中本发明化合物对人脐静脉血管内皮细胞的作用及统计结果。表明本发明化合物能够促进人脐静脉血管内皮细胞的迁移。

图5所示为本发明化合物具有促进出芽性血管新生的作用。其中，图5A是人脐静脉血管内皮细胞成团后的出芽情况；图5B是人脐静脉血管内皮细胞出芽后的统计结果。表明本发明化合物能够促进人脐静脉血管内皮细胞的出芽性血管新生。

图6所示为本发明化合物具有促进血管内皮细胞体外成管的作用。其中，图6A是在collagen为基质条件下，人脐静脉血管内皮细胞经DMSO、本发明所列化合物及VEGF处理后的成管情况；图6B和6C是对成管数目和成管长度的统计结果。表明本发明化合物能够促进人脐静脉血管内皮细胞在体外成管。

图7所示为本发明物具有促进动脉环微血管出芽的作用。其中，图7A是本发明物对小鼠胸主动脉环微血管的形成影响；图7B是小鼠胸主动脉环微血管形成的统计结果。表明本发明所列化合物能够促进小鼠胸主动脉形成微血管。

图8所示为本发明化合物在角膜微囊带实验中具有促进血管生成的作用。其中，图8A为小鼠角膜微囊袋经DMSO、本发明所列化合物以及VEGF处理后的血管生成情况；图8B为生成血管钟点数、血管长度、血管面积的统计结果。表明本发明化合物能够促进小鼠角膜微囊袋血管的形成。

图9所示为本发明物具有改善STZ诱导糖尿病小鼠后肢缺血的作用。其中，图9A为本发明化合物对小鼠股动脉结扎后血流灌注的影响；图9B为本发明化合物对小鼠股动脉结扎后血流灌注的统计结果；图9C为本发明化合物对小鼠后肢的影响；

图10为本发明化合物在治疗STZ诱导糖尿病小鼠后肢缺血的效果。表明本发明化合物可以有效改善小鼠后肢缺血状况，也能够消除结扎后后肢肌肉的炎症反应，促进后肢肌肉的完整性。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的阐释，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

¹H-NMR用Varian MercuryAMX300型仪测定；MS用VG ZAB-HS或VG-7070型仪测定，除注明外均为EI源(70ev)；所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得；除说明外，所有反应均是在氩气保护下进行并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥过程；产品的纯化除说明外均使用硅胶(200-300目)的柱色谱法；所使用的硅胶，包括200-300目和GF₂₅₄为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。

实施例1-1

实施例1-1、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF001)的制备

取磺胺(3.5g，20mmol)于醋酸(25ml)中，加入2，5-己二酮(3.15ml，20mmol)，在120℃下反应3h。减压除去大部分溶剂，常规处理后过硅胶柱，得中间体I(4.3g，86％)。

取中间体I(4.3g，17.2mmol)于乙醚(10ml)中，加入氯乙腈(1.04ml，26mmol)，通盐酸气体3小时左右，产物不溶于乙醚抽滤后于水中加热回流12h，抽滤得中间体II。

取吡咯烷0.2ml溶于DMF(5ml)中，在0℃滴加三乙胺(0.63ml)，将中间体II(500mg)加入反应体系，常温反应3h，水灭活EA萃取，常规后处理后过硅胶柱，得产物YF001(145mg，45％)。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.97(d，J＝6.9Hz，2H)，7.57-7.54(m，4H)，6.48(s，1H)，3.65(s，2H)，2.55-2.50(m，4H)，2.23(s，3H)，1.95(s，3H)，1.70-1.68(m，4H).

实施例1-2到1-16、表1所示YF系列化合物的制备(具体过程见后文参考)

实施例二、本发明化合物能抑制饥饿诱导的血管内皮细胞的凋亡

(一)MTS法测定细胞增殖

细胞增殖实验采用MTS法。MTS实验是运用比色法确测定活细胞增殖的测量方法。NADPH脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于组织培养液的一种有色物质，其颜色深浅与细胞株的活细胞数目在一定范围内高度相关。通过该模型可评价活性化合物对细胞增殖能力的影响。

人脐静脉血管内皮细胞以2x10³个/孔密度接至0.1％明胶包被的96孔板，待细胞贴壁培养12小时后，培养基血清浓度减半，加入不同浓度的本发明所列化合物，使其终浓度为5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升，对照组加入等量的DMSO，每组设6个复孔。继续培养2到5天。在指定的时间段，每孔加入20微升显色剂，孵育1～4小时，酶标仪上490nm处读出每个孔中的光吸收值。代表性结果如图1所示，跟对照组相比，在相应时间段内(2-5天)，本发明化合物YF001-YF023在5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升和50微摩尔/升浓度下均不影响内皮细胞的增殖。

(二)本发明化合物抑制饥饿诱导的人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。

细胞流式仪检测细胞凋亡实验：将人脐静脉血管内皮细胞接种至明胶包被的直径为6cm的培养皿，待细胞培养至密度约为80左右时，将10％FBS的培养基更换为无血清培养基，加入不同浓度的本发明化合物，使其终浓度为5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升和50微摩尔/升，对照组加入等量的DMSO，继续培养24小时。胰酶消化离心后，加PI和Annexin V室温孵育30分钟，通过细胞流式仪测定凋亡细胞的比例，实验重复三次。代表性结果如图2所示，在10％FBS培养基培养条件下，本发明化合物对细胞的凋亡没有明显影响；而在无血清培养基培养的条件下，本发明化合物明显地抑制饥饿诱导的内皮细胞凋亡。

TUNEL法检测细胞凋亡实验：将人脐静脉血管内皮细胞接种至明胶包被的96孔板，待细胞培养至密度约为80左右时，将5％FBS的培养基更换为无血清培养基，加入不同浓度的本发明化合物，使其终浓度为5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升，对照组加入等量的DMSO，继续培养24小时。加入荧光素标记的12-dUTP和细胞核染料DAPI，孵育30分钟后，荧光显微镜下检测凋亡细胞的数目和总细胞数，两者的比值即为凋亡细胞所占比例。代表性结果如图3所示，可见本发明化合物YF001-YF023明显地抑制饥饿诱导的细胞凋亡。

实施例三：本发明化合物促进人脐静脉血管内皮细胞体外迁移实验

细胞迁移实验又称体外划痕实验，通过在培养皿中长满的单层内皮细胞上制造划痕，在普通显微镜下拍照，记下划痕处新迁入的内皮细胞的数量来评价化合物对人脐静脉血管内皮细胞迁移能力的影响。

将细胞接种于明胶包被的6孔板中，待细胞长至90％左右，用移液器枪头在每个孔中划十字划痕。用PBS洗去漂浮的细胞，加入含不同浓度本发明化合物的培养基(1％FBS)。在37℃，5％CO₂培养箱中培养12小时后，在显微镜下观察拍照统计。代表性结果如图4A和4B所示，与DMSO组相比，本发明化合物可以促进人脐静脉血管内皮细胞的迁移。

实施例四：本发明化合物促进人脐静脉血管内皮细胞出芽性血管新生实验

将内皮细胞悬浮于含有1％FBS和0.2％甲基纤维素的内皮细胞培养基中，按1000细胞/25微升的浓度接种至没有粘附性的培养皿中，然后将培养皿倒置安放，培养皿底部放置少量水。在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，单个的细胞聚集形成细胞球体，每个球体大约含有1000个细胞。将细胞球体沉降后重新悬浮于0.8％甲基纤维素中，然后与pH 7.4的胶原混匀，接种至24孔板中。向24孔板中加入不同浓度的本发明化合物，使其终浓度为5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升，对照组加入等量的DMSO。在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，随机选择10个细胞球体，统计细胞球体出芽的长度。代表性如图5A所示，本发明化合物促进人脐静脉血管内皮细胞出芽性血管新生，其中VEGF作为阳性对照组。图5B为出芽性血管长度的统计结果。

实施例五：本发明化合物促进人脐静脉血管内皮细胞体外成管实验

Matrigel是一种可容性基底膜抽提物，富含细胞外基质蛋白，其主要成份是胶原IV、层粘连蛋白、TGF-β、硫酸肝素糖蛋白等。人脐静脉血管内皮细胞在Matrigel上可以贴附成管，可以利用这一特性来研究化合物对内皮细胞成管的影响。将Matrigel铺到24孔板上，于37℃，5％CO₂培养箱中放置30min待其多聚化。每孔加入混合有不同浓度本发明物的内皮细胞，在37℃，5％培养箱中培养3-7h后，使用显微镜下拍摄微管形成情况并进行统计。如图6所示，与DMSO组对比，本发明物能够促进人脐静脉血管内皮细胞体外成管，其中VEGF作为阳性对照组。

实施例六：本发明化合物促进小鼠胸主动脉环体外微血管形成实验

从6-7周龄的C57BL/6J小鼠体内剥离胸主动脉，用剪刀和镊子除去包裹主动脉脂肪等组织以及侧支，然后将动脉切成1-1.5mm的环状。将动脉环置于基质胶包被的48孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养30min，再用基质胶将动脉环包埋。于37℃、5％CO₂培养箱中培养30min后，向孔中加入含有加入不同浓度的本发明化合物，使其终浓度为5微摩尔/升、10微摩尔/升和20微摩尔/升，对照组加入等量的DMSO，所用培养基为无血清MCDB131培养基。24小时后换液，之后隔天换液。第七天，观察微管样结构，并用普通显微镜进行拍照进行统计分析。代表性结果如图7所示，本发明化合物YF001-YF023在10微摩尔/升和20微摩尔/升浓度下明显促进动脉环微血管结构的形成。

实施例七：本发明化合物促进小鼠角膜微囊袋血管生成实验

用注射器针头在6周龄的C57BL/6J雄性小鼠角膜处制造微囊袋。将含本发明物或VEGF的由Poly HEMA和硫糖铝混合做成的缓释颗粒植入小鼠角膜微囊袋中。7天后体式显微镜下观察小鼠角膜处血管生成情况，并进行拍照和数据统计。测量血管的长度和新生血管的钟点数，根据面积公式＝0.2×3.14×VL(mm)×CN(mm)计算新生血管的面积。其中CN是血管新生的钟点数，1钟点数等于30度的弧，VL是角膜边缘血管延伸的最大长度。代表性结果如图8所示，与DMSO组对比，本发明化合物YF001-YF023能够促进小鼠角膜微囊袋血管生成，其中VEGF作为阳性对照组。

实施例八：本发明化合物改善小鼠后肢血液灌流实验

(一)二型糖尿病小鼠模型的建立

购买4周龄ICR雄性小鼠，在动物中心观察一周后于SPF级环境饲养，用高脂饲料(Research Diets公司，60％脂肪)喂养三周，第一周和三周称量小鼠体重，除去体重未发生明显变化的小鼠。构建糖尿病模型时，按85mg/kg的剂量给肥胖小鼠一次性腹腔注射2％STZ(链脲菌素)的柠檬酸溶液，继续高脂喂养，三周后测定小鼠血糖，血糖测量前，小鼠饥饿过夜(18:00-8:00)，断尾取血并用血糖仪检测小鼠血糖。血糖值高于11.1mM的认为是二型糖尿病小鼠，取血糖值为20mM左右的小鼠进行下一步实验。

(二)糖尿病小鼠后肢缺血模型的建立

动物缺血模型是研究缺血性疾病发病机理和治疗、血管再生等许多研究的一个基础模型。其中，后肢缺血模型因与下肢动脉硬化等许多血管性常见病的治疗研究有关。近年来，通过建立动物后肢缺血模型进行血管再生的研究已成为一种趋势。取糖尿病小鼠，异氟烷麻醉，麻醉后，将小鼠仰卧固定，右后肢用剃毛器进行剃毛并消毒。在显微镜下，纵行切开右下肢正中的皮肤，于腹股沟下分离出股动脉，范围从腹股沟韧带直至膝关节。用丝线结扎股部的股动脉近端，随后在股动脉远端处进行结扎。术毕，缝合切口。常规饮食，继续饲养。

(三)本发明化合物改善小鼠后肢血液灌流情况

后肢缺血模型建立后，利用多普勒血流灌注仪检测后肢缺血的情况。小鼠分为两组后，本发明化合物用DMSO溶解，按20mg/kg每天腹腔给药，对照组注射同样量的DMSO。每周两次用多普勒血流灌注仪检测小鼠后肢缺血情况，连续两周给药。代表性结果如图9A所示，注射本发明化合物后小鼠后肢的血流灌注情况得到明显改善，而对照组小鼠的血流灌注与刚结扎时的情况近似。图9B是对血流灌注的统计结果。图9C表明，注射本发明化合物后小鼠后肢恢复状况与正常后肢类似，而对照组的小鼠后肢有明显的坏死和截肢现象。

实施例九：本发明物改善缺血后肢的肌肉

(一)石蜡组织材料的准备及染色

本发明化合物治疗2型糖尿病ICR小鼠两周后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，用4％多聚甲醛进行预固定，取下结扎近端和远端中间的肌肉，4％多聚甲醛固定24小时后，流水冲洗，按如下程序进行脱水与浸蜡：50％酒精40min-75％酒精40min-85％酒精40min-95％酒精40min-100％酒精40min-酒精1∶1二甲苯30min-二甲苯30min-二甲苯30min-1号蜡1h-2号蜡过夜-3号蜡1h。浸蜡后的材料进行包埋、修片后切片(5μm厚)，62℃烘片两小时，室温保存切片。

取出切好的片子，按如下程序脱水：1号二甲苯8min-2号二甲苯8min-二甲苯1∶1酒精5min-100％酒精5min-95％酒精3min-85％酒精3min-75％酒精3min。

进行H&E(苏木精-伊红)染色时，入水后的切片在苏木精中染色15min-蒸馏水冲洗-酒精盐酸溶液分色10秒-自来水返蓝(冲洗30min)-蒸馏水冲洗-伊红溶液染10秒-蒸馏水冲洗-75％酒精3min-85％酒精3min-95％酒精1min-100％酒精3min-二甲苯1∶1酒精5min-1号二甲苯10min-2号二甲苯10min-吸去多余的二甲苯后用中性树脂封片，显微镜观察拍照，苏木精能把细胞核染成蓝色，而伊红能把细胞质染成红色，每一个核对应一个细胞。

(二)本发明物减少小鼠肌肉的坏死和炎症反应

对切好的肌肉组织切片进行HE染色，如图10所示，小鼠后肢在结扎缺血后，同未结扎的小鼠肌肉相比，结扎近端和远端中间的肌肉出现明显的肌肉坏死和炎症反应。在连续注射本发明化合物2周后，跟DMSO组相比，由于缺血所引起的肌肉坏死发生的现象较少，同时发现肌肉组织中炎症细胞的数目也明显减少。给药组肌肉组织结构与形态接近于未结扎组。

实施例1-2、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯甲酸甲酯(YF002)的制备

将磺胺置换成对氨基苯甲酸甲酯，按制备化合物YF001的方法制备。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ8.10(d，J＝8.4Hz，2H)，7.49(d，J＝8.4Hz，2H)，6.48(s，1H)，3.89(s，3H)，3.63(s，2H)，2.54-2.50(m，4H)，2.23(s，3H)，1.95(s，3H)，1.70-1.67(m，4H).

实施例1-3、化合物N，N-二乙基-4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯甲酰胺(YF003)的制备

将磺胺置换成4-氨基-N，N-二乙基苯甲酰胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF003。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ7.52(d，J＝8.1Hz，2H)，7.22(d，J＝8.1Hz，2H)，6.37(s，1H)，3.61(s，2H)，3.60-3.58(m，2H)，3.33-3.31(m，2H)，2.74-2.70(m，4H)，3.34(s，3H)，1.99(s，3H)，1.86-1.82(m，4H)，1.26(t，J＝7.2Hz，6H).

实施例1-4、化合物N-苄基-4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯甲酰胺(YF004)的制备

将磺胺置换成4-氨基-N-苄基苯甲酰胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF004。 ¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ7.94(d，J＝8.1Hz，2H)，7.39-7.34(m，5H)，7.26(d，J＝8.1Hz，2H)，6.55(t，J＝5.4Hz，1H)，6.38(s，1H)，4.69(d，J＝5.4Hz，2H)，3.78(s，2H)，2.74-2.71(m，4H)，2.32(s，3H)，1.98(s，3H)，1.86-1.83(m，4H).

实施例1-5、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]硝基苯(YF005)的制备

将磺胺置换成对硝基苯胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF005。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ8.38(d，J＝9.0Hz，2H)，7.38(d，J＝9.0Hz，2H)，6.40(s，1H)，3.76(s，2H)，2.71-2.67(m，4H)，2.34(s，3H)，2.01(s，3H)，1.85-1.82(m，4H).

实施例1-6、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]氯苯(YF006)的制备

将磺胺置换成对氯苯胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF006。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ7.46(d，J＝8.7Hz，2H)，7.11(d，J＝8.4Hz，2H)，6.34(s，1H)，3.76(s，2H)，2.71-2.68(m，4H)，2.31(s，3H)，1.97(s，3H)，1.84-1.81(m，4H).

实施例1-7、化合物N-{4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯基}乙酰胺(YF007)的制备

将磺胺置换成N-(4-氨基苯基)乙酰胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF007。 ¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ8.24(br s，1H)，7.71(d，J＝8.4Hz，2H)，7.08(d，J＝8.4Hz，2H)，6.33(s，1H)，3.80(s，2H)，2.74-2.70(m，4H)，2.28(s，3H)，2.23(s，3H)，1.96(s，3H)，1.85-1.82(m，4H).

实施例1-8、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-哌啶基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF008)的制备

将吡咯烷置换成哌啶，按制备化合物YF001的方法相应制备YF008。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.58-7.53(m，4H)，6.52(s，1H)，3.50(s，2H)，2.50-2.45(m，4H)，2.23(s，3H)，1.96(s，3H)，1.26-1.23(m，6H).

实施例1-9、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(4-甲基-1-哌嗪基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF009)的制备

将吡咯烷置换成N-甲基哌嗪，按制备化合物YF001的方法相应制备YF009。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57-7.53(m，4H)，6.51(s，1H)，3.51(d，J＝7.5Hz，4H)，3.16(s，2H)，2.51-2.48(m，4H)，2.26(s，3H)，2.23(s，3H)，1.96(s，3H).

实施例1-10、化合物4-{2，5-二甲基-3-[2-(2-(4-吗啉基乙胺)-乙酰基)-1-吡咯基}苯磺酰胺(YF010)的制备

将吡咯烷置换氨乙基吗啉，按制备化合物YF001的方法相应制备YF010。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ8.08(d，J＝8.4Hz，2H)，7.27(d，J＝8.4Hz，2H)，6.33(s，1H)，3.93(s，2H)，3.75-3.71(m，4H)，2.81(t，J＝5.7Hz，2H)，2.57(t，J＝6.0Hz，2H)，2.51-2.48(m，4H)，2.27(s，3H)，1.99(s，3H).

实施例1-11、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(4-吗啉基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF011)的制备

将吡咯烷置换吗啉，按制备化合物YF001的方法相应制备YF011。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.58-7.54(m，4H)，6.51(s，1H)，3.61-3.58(m，4H)，3.31(s，2H)，2.53-2.49(m，4H)，2.23(s，3H)，1.96(s，3H).

实施例1-12、化合物4-[2，5-二甲基-3-(3-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF012)的制备

取中间体I(200mg，0.8mmol)三氯化铝(128mg，0.96mmol)于1，2-二氯乙烷中，在0℃下加入氯丙酰氯(84ul，0.88mmol)，10分钟后中间体I(200mg，0.8mmol)加入反应液中，常温反应5小时，减压除去大部分溶剂，过柱纯化得中间体同上方法与吡咯烷反应得化合物YF012。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ8.14(d，J＝8.4Hz，2H)，8.01(s，2H)，7.33(d，J＝8.4Hz，2H)，5.91(s，1H)，3.74-3.71(m，4H)，3.45-3.41(m，4H)，2.95(s，3H)，2.88(s，3H)，2.05-2.01(m，4H).

实施例1-13、化合物4-[2，5-二甲基-3-(4-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF013)的制备

将氯丙酰氯置换成氯丁酰氯，按制备化合物YF012的方法相应制备YF013。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.29(d，J＝8.4Hz，2H)，6.37(s，1H)，3.72(t，J＝6.0Hz，2H)，2.93(t，J＝6.0Hz，2H)，2.50-2.45(m，4H)，2.31(s，3H)，1.93(s，3H)，1.88-1.84(m，4H)，1.27-1.23(m，2H).

实施例1-14、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]甲磺酰基苯(YF014) 的制备

将磺胺置换成对甲磺基苯胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF014。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ8.10(d，J＝8.4Hz，2H)，7.40(d，J＝8.4Hz，2H)，6.39(s，1H)，3.83(s，2H)，3.15(s，3H)，3.29-3.26(m，4H)，2.33(s，3H)，1.99(s，3H)，1.88-1.84(m，4H).

实施例1-15、化合物N，N-二乙基-4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF015)的制备

将磺胺置换成4-氨基-N，N-二乙基苯磺酰胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF015。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.94(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57(d，J＝8.4Hz，2H)，6.49(s，1H)，3.68(s，2H)，3.23(q，J＝6.9Hz，4H)，2.59-2.53(m，4H)，2.23(s，3H)，1.95(s，3H)，1.73-1.69(m，4H)，1.05(t，J＝6.9Hz，6H).

实施例1-16、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-二乙胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF016)的制备

将吡咯烷置换成二乙胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF016。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.56(d，J＝8.4Hz，4H)，6.55(s，1H)，3.58(s，2H)，2.59(q，J＝7.2Hz，4H)，2.23(s，3H)，1.97(s，3H)，0.98(t，J＝7.2Hz，6H).

实施例1-17、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-双烯丙基胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF017)的制备

将吡咯烷置换成二烯丙基胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF017。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57-7.54(m，4H)，6.46(s，1H)，5.86-5.84(m，2H)，5.14-5.11(m，4H)，3.65(s，2H)，3.22(d，J＝6.3Hz，4H)，2.24(s，3H)，1.97(s，3H).

实施例1-18、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-丙胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF018)的制备

将吡咯烷置换成丙胺，按制备化合物YF001的方法相应制备YF018。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.99(d，J＝6.6Hz，2H)，7.56(d，J＝6.9Hz，2H)，6.47(s，1H)，3.84(s，2H)，2.55(t，J＝6.9Hz，2H)，2.25(s，3H)，1.96(s，3H)，1.50-1.43(m，2H)，0.98(t，J＝7.2Hz，3H).

实施例1-19、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-胺基乙酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF019)的制备

将吡咯烷置换成氨基乙酸甲酯，按制备化合物YF001的方法相应制备YF019。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.97(d，J＝8.1Hz，2H)，7.57-7.53(m，4H)，6.41(s，1H)，3.81(s，2H)，3.62(s，3H)，3.31(s，2H)，2.24(s，3H)，1.95(s，3H).

实施例1-20、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-胺基乙酸乙酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF020) 的制备

将吡咯烷置换成氨基乙酸乙酯，按制备化合物YF001的方法相应制备YF020。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.58-7.54(m，4H)，6.51(s，1H)，4.08-4.05(m，2H)，3.71(s，2H)，3.61(s，2H)，2.24(s，3H)，1.96-1.90(m，6H).

实施例1-21、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-脯氨酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF021)的制备

将吡咯烷置换成脯氨酸甲酯，按制备化合物YF001的方法相应制备YF021。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ8.05(d，J＝8.4Hz，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，2H)，6.36(s，1H)，4.03(d，J＝16.8Hz，1H)，3.69(d，J＝16.8Hz，1H)，3.69(s，3H)，3.62-3.60(m，1H)，2.94-2.92(m，2H)，2.86-2.84(m，2H)，2.25(s，3H)，1.95(s，3H)，1.24-1.22(m，2H).

实施例1-22、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-谷氨酸二甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF022)的制备

将吡咯烷置换成谷氨酸二甲酯，按制备化合物YF001的方法相应制备YF022。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝6.3Hz，2H)，7.57-7.52(m，4H)，6.43(s，1H)，3.86-3.83(m，2H)，3.61(s，3H)，3.59(s，3H)，2.72-2.70(m，2H)，2.64-2.62(m，1H)，2.24(s，3H)，1.96(s，3H).

实施例1-23、化合物4-[2，5-二甲基-3-(2-苯丙氨酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺(YF023)的制备

将吡咯烷置换成苯丙氨酸甲酯，按制备化合物YF001的方法相应制备YF023。¹H NMR(DMSO，300MHz)：δ7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57-7.53(m，4H)，7.26(d，J＝8.4Hz，2H)，7.24-7.21(m，3H)，6.39(s，1H)，3.85(d，J＝18.0Hz，1H)，3.69(d，J＝18.0Hz，1H)，3.56(s，3H)，2.94-2.91(m，1H)，2.88-2.86(m，2H)，2.72(s，1H)，2.22(s，3H)，1.95(s，3H)。

Claims

1.一类酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，其特征在于，其结构如式(I)所示：

其中：

n＝0-2；

R₁选自下列基团中的一个或多个：磺胺基、甲磺基、酯基、硝基、N，N-二乙基乙酰胺基、N-苄基乙酰胺基、或卤素；

NR₂R₃为吡咯烷基、哌啶基、N-甲基哌嗪基、氨乙基吗啉基、吗啉基、二乙胺基、二烯丙基胺基、丙胺基、氨基乙酸甲酯基、氨基乙酸乙酯基、脯氨酸甲酯基、谷氨酸二甲酯基、或苯丙氨酸甲酯基。

2.根据权利要求1所示的酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，其特征在于，当R₁为SO₂R₄时，其结构如式(II)所示：

其中：

n＝0-2；

NR₂R₃为吡咯烷基、哌啶基、N-甲基哌嗪基、氨乙基吗啉基、吗啉基、二乙胺基、二烯丙基胺基、丙胺基、氨基乙酸甲酯基、氨基乙酸乙酯基、脯氨酸甲酯基、谷氨酸二甲酯基、或苯丙氨酸甲酯基；

R₄为氨基、胺基或甲基。

3.根据权利要求1所示的酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，其特征在于，当R₁为SO₂NH₂；NR₃R₄为含氮五元或者六元杂环时，其结构如式(III)所示：

其中：m＝0或者1；n＝0-2；X为CH₂、O或NCH₃。

4.根据权利要求1所述的酰基吡咯类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，包括：

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]硝基苯；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]氯苯；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(1-哌啶基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-(4-吗啉基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(3-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(4-(1-吡咯烷基)-乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-二乙胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-丙胺基乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

4-[2，5-二甲基-3-(2-脯氨酸甲酯乙酰基)-1-吡咯基]苯磺酰胺；

5.一种药物组合物，其特征在于，其含有权利要求1-4之任一项所述的酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物被配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

7.如权利要求1-4之任一项所述的酰基吡咯类小分子有机化合物或药学上可接受的盐以及如权利要求5所述的药物组合物在制备促进血管新生药物方面的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物应用的疾病包括伤口愈合、糖尿病病足、心血管疾病。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。