CN105853408B - 苯酰胺衍生物在制备Caspase-1抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供苯酰胺衍生物及其可药用盐在制备Caspase‐1选择性抑制剂和抗惊厥药物中的应用。本发明通过筛选得到了Caspase‐1新型选择性抑制剂3‐(3‐(噻吩‐2‐甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯，并从分子、细胞和整体动物水平试验证明了3‐(3‐(噻吩‐2‐甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯能够有效抑制Caspase‐1酶活性，并能抑制整体动物热惊厥的发作，延长热惊厥发作的潜时，提高热惊厥发作的阈值，降低热惊厥发作的比例，且没有明显的急性慢性毒副作用，为3‐(3‐(噻吩‐2‐甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯在治疗热惊厥的应用提供了实验依据。

Description

苯酰胺衍生物在制备Caspase-1抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及苯酰胺衍生物及其医药用途，尤其涉及苯酰胺衍生物在制备Caspase-1抑制剂和制备抗热惊厥药物中的应用。
背景技术
小儿热惊厥(Febrile seizures,FS)是由高热引起的惊厥，是婴幼儿时期最常见的惊厥发作类型，高发于6个月到5岁的婴幼儿，发病率约为3-14％，其中中国南部发病率高达16％。热惊厥是由于突发异常过度放电所引起的，排除颅内感染或代谢紊乱等因素，当前缺少有效的治疗策略。目前临床治疗小儿热惊厥主要采用甾体类抗炎药物辅助抗癫痫药物。常用的解热镇痛药如扑热息痛、布洛芬等虽能有效减缓发烧症状，却很难控制惊厥发作。而传统的抗癫痫药如苯巴比妥、丙戊酸等虽然能控制惊厥发作，但却有较大毒副作用，且对儿童智力发育有较大影响。除此之外，在出现发热症状时给予地西泮，虽能降低第一次FS发作比例，但对FS反复发作没有作用，且因为它的毒副作用不能作为预防治疗的手段。因此，简单的治疗并不能有效控制热惊厥，其中约1/3的患者会出现反复或长时间发作的复杂热惊厥，由此极易导致颞叶癫痫(TLE)，海马、颞叶内侧硬化(HS/MTS)或认知障碍。因此，探讨FS的发生机制以及寻找更为有效药物治疗潜在靶点已成为当下亟待解决的问题。
当受到高温等外界条件刺激时，细胞内炎症小体的模式识别受体和结合分子会招募Caspase-1前体(pro-Caspase-1)，组装形成完整的炎症小体，并通过自我催化形成有活性的催化酶(cleaved Caspase-1)。活化的Caspase-1可剪切炎症因子IL-1β和IL-18的前体，形成成熟IL-1β和IL-18并分泌至胞外参与一系列炎症反应。研究表明，周期性发热综合征(Periodic Fever Syndrome)病人血液中Caspase-1的表达水平会显著上调，预示着Caspase-1作为炎症小体的关键组成部分，可能对高热刺激更为敏感，且可能作为最早启动的炎性因子。另外，Caspase-1可能与神经元兴奋性相关，其可被AMPA受体所激活。此外，在癫痫病人和颞叶癫痫的动物模型上均检测到激活的Caspase-1和炎症小体水平的显著性上调。因此，Caspase-1很可能在FS发生过程中起到关键作用，其极可能成为治疗热惊厥发作的重要靶点。
发明人的前期研究结果表明Caspase-1在热惊厥的发生过程中发挥了重要作用。Caspase-1敲除后会降低神经元兴奋性，且对热惊厥的发生有更低的易感性。而胚胎电转Caspase-1过表达则会提高神经元兴奋性，更易诱发热惊厥，且电转Caspase-1会逆转Caspase-1敲除小鼠的易感性。目前，Caspase-1的抑制剂如Ac-YVAD-cmk等多为多肽类药物，其极易受到药代动力学限制，如多肽类药物经口服后会在胃肠道降解成小分子氨基酸后被吸收，导致药效丧失。因此多肽类药物成药性差，很难用于临床治疗。而其他的非肽类小分子抑制剂如VX-765和VX-740则因其显著的不良反应而终止于临床二期实验。因此，开发新型Caspase-1特异性抑制剂势在必行。
发明内容
本发明的目的是提供一种苯酰胺衍生物或其可药用的盐在制备抑制Caspase-1抑制剂中的应用，以及其在制备抗惊厥药物中的应用。所述可药用的盐包括盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来盐酸、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐。
本发明对上述苯酰胺衍生物进行进一步生物学活性测定，发现它们对Caspase-1都有明显的抑制活性，在细胞水平对Caspase-1有明显的抑制效果。
本发明提供一种的苯酰胺衍生物，其有Caspase-1抑制活性，其化学结构通式如下：
式中，R1为含有一个取代基的苯基、苯甲基、含有N的5元芳香杂环基；
R2为氯、酰胺基；
R3为酰胺基；
R4为酰胺基；
其中，化合物的末端含有-COOH官能团。
优选的技术方案中，所述苯酰胺衍生物选自：3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯(ChemBridge编号：6626080)；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯(ChemBridge编号：6810755)；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯(ChemBridge编号：9198978)；4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯(ChemBridge编号：7107576)；(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁(ChemBridge编号：9030280)；4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸(ChemBridge编号：6853559)；(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸(ChemBridge编号：6816912)。化学结构式依次如下所示：
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯(6626080)
5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯(6810755)
(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯(9198978)
4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯(7107576)
(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁(9030280)
4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸(6853559)
(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸(6816912)。
所述可药用的盐为苯酰胺衍生物盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐。
本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)本发明首次发现苯酰胺衍生物及其可药用盐具备Caspase-1抑制功能；(2)本发明通过细胞水平和整体动物水平的实验，筛选得到的Caspase-1新型选择性抑制剂3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯，能够有效抑制Caspase-1酶活性，抑制整体动物热惊厥的发作，延长热惊厥发作潜时，提高热惊厥发作的阈值，降低热惊厥发作的比例，且没有明显的急性慢性毒副作用，有效抑制热惊厥的发作，从而达到治疗热惊厥疾病的作用。
附图说明
图1.A1-A7为7个化合物3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯；4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯；(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁；4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸；(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸在Caspase-1活性口袋中的结合构象(化合物采用棍状模型显示)；B1-B7为7个化合物和Caspase-1活性口袋残基之间的相互作用模式。
图2. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯；4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯；(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁；4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸；(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸降低Caspase-1酶活性，与溶剂组相比，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯降低PBMC细胞Caspase-1酶活性，与溶剂组相比，其中*P<0.05，**P<0.01。
图4. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯对细胞活性无影响。
图5. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯延长惊厥发作的潜时，与溶剂组相比，其中**P<0.01，***P<0.001。
图6. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯提高惊厥发作的阈值，与溶剂组相比，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯对Caspase-1敲除小鼠热惊厥的潜时和阈值无影响。
图8. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后血药、脑药浓度。
图9. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯降低整体动物Caspase-1酶活性与溶剂组相比，其中*P<0.05，**P<0.01。
图10. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯降低整体动物IL-1β和IL-18的蛋白表达水平，其中**：与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯处理后P<0.01。
图11. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯延长整体动物热惊厥的潜时与溶剂组相比，其中**P<0.01，***P<0.001。
图12. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯提高整体动物热惊厥的阈值与溶剂组相比，其中**P<0.01，***P<0.001。
图13. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药延长整体动物第一次和第二次热惊厥的潜时，其中***：与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯处理后P<0.001。
图14. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药提高整体动物第一次和第二次热惊厥的阈值，其中***：与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯处理后P<0.001。
图15. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药减少整体动物第一次和第二次热惊厥的发作比例，与溶剂组相比，其中*P<0.05，***P<0.001。
图16. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对Caspase-1敲除小鼠热惊厥的潜时和阈值无影响。
图17. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对整体动物呼吸频率无影响，与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后，呼吸频率P>0.05。
图18. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对整体动物运动功能无影响，与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后，总的运动距离P>0.05。
图19. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对整体动物不动时间无影响，与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后，不动时间的比例P>0.05。
图20. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对整体动物EEG相对能量无影响与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对EEG不同频段的频谱分析无影响，P>0.05。
图21. 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药对整体动物肝功能(ALT/AST)无影响与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后，P>0.05。
附图中出现的英文单词，中文翻译如下：
IL-1β：白介素-1β(interleukin-1β)，IL-18：白介素-18(interleukin-18)。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
实施例一苯酰胺衍生物的制备及其生物学活性测定
1.用分子对接的方法(包括glide HTVS,SP和XP)来设计化合物，将Caspase-1的晶体结构(PDB code:3NS7)作为起始结构进行分子对接，筛选活性化合物并分析结合机制。参见图1,A1-A7为3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯；4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯；(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁；4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸；(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸在Caspase-1活性口袋中的结合构象(化合物采用棍状模型显示)；B1-B7为7个化合物和Caspase-1活性口袋残基之间的相互作用模式。
2.Caspase-1酶活性测定：在96孔板上加入外周重组Caspase-1(0.5nM)，再分别加入15μM的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯；4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯；(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁；4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸；(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸。后根据试剂盒里的说明，用Caspase-1Colorimetric Assay Kit(Abcam,ab39470)试剂盒进行Caspase-1酶活性的测定。重复三次，将阴性对照组定为100％，结果显示以上化合物对Caspase-1的酶活性均有明显的抑制作用，*P<0.05。参见图2。
3.PBMC(peripheral blood mononuclear cell)人外周血单核细胞的培养：人浓缩白细胞用RPMI1640稀释一倍后，加到淋巴细胞分离液上层，2100rpm常温离心20min,吸取中间细胞层，至另一50ml离心管中，再2100rpm常温离心20min。弃上清，如红细胞过多，用ACK破红液破红。底部细胞用RPMI1640重悬，再1500rpm常温离心10min。重复一次，最后用RPMI1640+10％FCS+青霉素链霉素双抗重悬细胞，铺板，贴壁过夜。
4.细胞上Caspase-1酶活性测定：PBMC加入LPS(脂多糖，5μg/ml)刺激16h后，加入75μM的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯；4-(4-(2-氯代苯甲酰基)苯基磺酰胺)苯甲酸甲酯；(R)-4-氧代-4-((2-((1-苯乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)丁；4-((4-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸；(Z)-(2-苯甲酰氨基-3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰)-D-谷氨酸。再根据试剂盒里的说明，用Caspase-1Colorimetric Assay Kit(Abcam,ab39470)试剂盒进行Caspase-1酶活性的测定。重复三次，将阴性对照组定为100％，结果显示在细胞上，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯对Caspase-1的酶活性有明显的抑制作用，*P<0.05。参见图3。
5.MTT试验：PBMC加入LPS(脂多糖，5μg/ml)刺激16h后，加入浓度梯度的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯。加入MTT溶液(噻唑蓝，5mg/ml)，孵育2小时，后吸出，加入300μl DMSO(二甲基亚砜)，充分溶解后，测定570nm吸光度。重复三次，将阴性对照组定为100％，结果显示，不同浓度下的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯对细胞活性没有明显影响，参见图4。
实施例二苯酰胺衍生物在小鼠热惊厥模型中的抗抑郁效应
1.热惊厥动物模型:采用出生后8天(P8)的C57BL/6J小鼠和Casp1-/-小鼠，雌雄兼用，称量体重，并记录肛温(基础体温)。将幼鼠置于温度41℃的烘箱中，每5min记录一次肛温，直到幼鼠出现高温诱导的惊厥发作行为特征：1，全身性肌阵挛；2，疯狂奔跑；3，混乱行走；4，转圈；5，站立不稳，跌倒，四肢强直性阵挛。动物一旦出现跌倒、四肢阵挛的行为，则被认作第一次惊厥发作(1st seizure)，从放入烘箱到惊厥发作的时间记录为潜时，测定此时的肛温为惊厥发作阈值温度。动物一旦出现惊厥发作，即被移至常温平板上休息2min,之后将动物重新放入烘箱，直至惊厥行为再次出现，被定义为第二次发作(2nd seizure)。如果在55min中内没有出现惊厥行为，则认为没有惊厥发作，并将55min定义为潜时。热惊厥实验结束后，称量体重，将动物置于常温平板上直至体温恢复正常，放回笼内继续饲养。采用出自同一窝的小鼠作为对照，对照组在实验过程中置于笼外，且它们的体温在实验过程中维持在正常范围。
2.给药及剂量:3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯粉末溶于2‰DMSO(二甲基亚砜)的生理盐水中，C57BL/6J小鼠经海马内注射给药，剂量为0.01，0.1，1nmol；Casp1-/-小鼠海马内注射给药，剂量为1nmol，以上每组10只。后进行热惊厥动物模型的潜时和阈值测定。图5、图6为C57BL/6J小鼠给药后惊厥发作的潜时和阈值，结果显示，与溶剂组相比，不同剂量的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯和(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯均能明显延长潜时。0.1和1nmol的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯和(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯能够明显提高阈值，*P<0.05。
3.图7为Casp1-/-小鼠上的潜时和阈值，1nmol的三个化合物对敲除小鼠的潜时和阈值没有影响，进一步证明这几个化合物的靶点是Caspase-1。
4.HPLC：P8的C57BL/6J小鼠尾静脉注射0.75mg/kg 3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯，15，30，45，60，120，240，480min后取血浆和脑组织。血液从眼眶取血，静置后，3000rpm常温离心10min。液相条件：乙腈:水相＝4.5:5.5；色谱条件：流速：1ml/min；进样量：20μl；波长：209nm。参见图8，证明3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯能够穿过血脑屏障。
5.Caspase-1酶活性测定:P8的C57BL/6J小鼠尾静脉注射3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯，剂量分别为0.0075，0.075，0.75，7.5mg/kg，将实验动物行生理盐水灌流取脑后，立即置于冰上，分离海马组织。根据试剂盒里的说明，用Caspase-1Colorimetric Assay Kit(Abcam,ab39470)试剂盒进行Caspase-1酶活性的测定。Caspase-1酶活性的改变通过与对照进行对比。以上每组6只。参见图9，结果显示，与溶剂组相比，不同剂量的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯均能降低Caspase-1酶活性，起到明显的抑制作用，*P<0.05。
6.免疫印迹实验
P8的C57BL/6J小鼠尾静脉注射3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯，剂量分别为0.0075，0.075，0.75，7.5mg/kg，将实验动物行生理盐水灌流取脑后，立即置于冰上，分离海马组织，加入组织细胞裂解液(RIPA buffer)，4℃匀浆，15000rpm低温离心20min,取上清。制定标准曲线，依次稀释BSA，浓度为0，0.125，0.25，0.75，1，1.5，2mg/ml。再在同一块96孔板上加入蛋白提取液，之后用BCA法测定标准曲线和蛋白提取液中的蛋白浓度。
聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：配制14％的分离胶，当浓缩胶聚合完全后，将凝胶固定于电泳装置上，加入1*running buffer，小心移出梳子。将加过1*loading buffer的样本金属浴5min，使蛋白变性，然后按预定的顺序上样，上样量为100μg，电泳电压为80V，当溴酚蓝条带进入分离胶后，电压调整为100V，继续电泳至溴酚蓝条带至凝胶底部，卸下玻璃板，取出凝胶。将凝胶、一张硝酸纤维素膜(孔径0.22μm)和四张Whatman滤纸一起置于转膜装置中，转膜液为20％甲醇：10％10*trans buffer：70％ddH2O，转膜条件为180mA，60min。转完膜，将硝酸纤维素膜用1*TPBS进行漂洗，放入5％脱脂牛奶的封闭液中，置于摇床上，室温孵育60min。取出硝酸纤维素膜分别放入含有IL-1β(1:200；ab9787)，IL-18(1:1000；Biovision 5180R-100)和GAPDH(1:8,000；KangChen KM9002S)的一抗中，4℃过夜。之后用1*TPBS进行漂洗15min 3次，再分别加入兔二抗(1:10,000；Odyssey 92632211,LotC3040907)和鼠二抗(1:10,000；Odyssey 92668020,Lot C30627-05)中，室温孵育2h,用1*TPBS进行漂洗15min 3次。之后采用Odyssey荧光成像系统，并用Odyssey软件进行定量分析。参见图10。
7.惊厥行为实验
3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯粉末溶于2‰DMSO(二甲基亚砜)的生理盐水中，C57BL/6J小鼠经尾静脉注射给药，剂量为0.0075，0.075，0.75，7.5mg/kg，以上每组10只，后进行热惊厥动物模型的潜时和阈值测定。图11和12为不同剂量3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后的潜时和阈值，结果显示，与溶剂组相比，0.075，0.75和7.5mg/kg的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯给药后均明显延长潜时，提高阈值，*P<0.05。随后选择0.75mg/kg作为后续实验的剂量。
图13、14、15分别为尾静脉注射0.75mg/kg的3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯后的潜时、阈值和发作比例，结果显示与溶剂组相比，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯能明显延长潜时，提高阈值，降低发作比例，起到明显的抑制惊厥行为的作用，*P<0.05。
而在Casp1-/-小鼠尾静脉3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯，参见图16，结果显示，3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯对敲除小鼠的潜时和阈值没有影响。
实施例三毒副作用测定
1.呼吸频率的测定和旷场实验：P8的C57BL/6J小鼠尾静脉注射溶剂(2‰DMSO的生理盐水)和3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯(0.75mg/kg)，之后记录每分钟的呼吸频率，参见图17。5min后进行旷场实验，通过旷场实验动物行为学分析系统，测定实验在15min中内运动的距离(运动能力)和不动的时间比例(镇静作用)，参见图18，19。以上每组6只。
2.幼鼠在体脑电(Electroencephalogram,EEG)记录及分析：P8的C57BL/6J小鼠经异氟烷气体麻醉(4％诱导，2％维持)后固定于小动物立体定位仪，于右侧海马(AP:-1.3mm,L:-1.5mm,V:-1.6mm)和前额叶皮层(AP:-0.5mm,L:-0.5mm,V:-1mm)垂直埋置电极(A.M.Systems.Inc.,Carlsborg,WA,USA)，坐标相对于颅骨前囱并参照发育大脑图谱。所有电极均为双股螺旋不锈钢电极，电极顶端分叉0.5mm，末端剥去包被绝缘层剥离0.5mm。电极丝为Teflon绝缘，直径为0.2mm，电极另一端与微型插座焊接，用牙科水泥固定于颅骨上。实验过程中使用Neuroscan系统采集EEG信号，LFP采用率为1k/s，滤波范围为0.3-250Hz。首先记录15min的基础脑电，再分别尾静脉给予溶剂(2‰DMSO的生理盐水)和3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯(0.75mg/kg)的处理，持续记录30min脑电。在整个实验过程中，小鼠清醒，且可以自由活动。采用Neuroscan系统自带软件包傅里叶变化对记录的EEG进行频谱和能谱的分析。参见图20。
3.生化指标测定：P8的C57BL/6J小鼠尾静脉注射溶剂(2‰DMSO的生理盐水)和3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯(0.75mg/kg)。在给药12h后，委托给浙江大学动物实验中心的药物安全评价平台测定肝功能：谷丙转氨酶、谷草转氨酶。参见图21。

Claims (3)

1.一种苯酰胺衍生物及其可药用的盐在制备Caspase-1选择性抑制剂中的应用，所述苯酰胺衍生物选自：3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯；5-((3-((2,4-二甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯；(S)-1-(2-氯代苯甲酰胺)-5-氧代吡咯烷-3-羧酸乙酯。
2.一种苯酰胺衍生物及其可药用的盐在制备抗惊厥药物中的应用，所述苯酰胺衍生物为3-(3-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酰氨基)苯甲酸甲酯。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述可药用的盐为苯酰胺衍生物盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐。
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