CN104459133A - 急性肾损伤诊断ngal胶体金免疫测试盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及急性肾损伤早期诊断是检测试剂板，属于早期诊断急性肾损伤的技术领域。本发明利用NGAL蛋白作为急性肾损伤早期诊断的生化指标，在一步法检测条或检测板上固定胶体金标记的针对抗原的抗体以及固定化的未标记的抗体，以达到一次性检测急性肾损伤指标的目的。本发明提供的试剂板简便、快捷，不需要仪器设备，仅用肉眼即可判读结果，适合在任何场所检测，且每份试剂均为单独包装，可存放于室温下，便于保存。本发明检测灵敏性高，特异性强，能够在急性肾损伤发病早期即开始检测，适合急性肾损伤早期筛选和诊断。

Description

急性肾损伤诊断NGAL胶体金免疫测试盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及NGAL蛋白的抗体对的制备，胶体金标记显色的免疫层析反应技术和利用NGAL的抗体来早期诊断急性肾损伤的技术领域。尤其涉及一种急性肾损伤早期诊断检测试剂板。
技术背景
本发明的主要技术背景包括NGAL的特异性、胶体金的快速简便、双抗体技术的敏感准确。
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是由各种原因引起的肾功能在短时间(几小时至几天)内突然下降而出现的临床综合征，是威胁重症患者生命的常见疾病。重症监护病房中约50％的患者可合并此症，AKI的终末阶段急性肾功能衰竭(acuterenal failure，ARF)，其病死率高达26.5％-45％。目前探寻一种稳定、特异、敏感的早期诊断标志物，以期达到早期诊断、早期防治AKI，成为降低重症患者病死率的关键。传统指标如血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及肾小球滤过率(eGFR)由于所受影响因素较多，不够敏感，作为肾损伤的标志物并不能令人满意。目前临床仍然主要以Scr作为AKI的诊断依据，但是Scr受年龄、性别、体质量、药物、容量负荷、肌肉代谢、蛋白摄入等诸多非肾脏因素的影响，结果并不可靠。尿量作为传统指标也面临与Scr类似的问题。体内外研究发现，肾近曲小管细胞在损伤后可高表达中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，肾脏皮质小管、血液和尿液中均有NGAL的大量堆积，提示血NGAL和尿NGAL对AKI具有早期诊断价值。
NGAL(中性粒细胞明胶酶相关转运蛋白)是一种小分子质量的分泌蛋白，与明胶酶B(MMP-9)的功能密切相关，可在肿瘤细胞及多种上皮细胞中表达，包括近端肾小管上皮细胞。对肾急性I／R损伤及顺铂诱导的AKI模型进行研究后发现：在缺血引起的肾损伤中，受损的肾小管上皮细胞能产生大量的NGAL，这些NGAL一方面能诱导肾小管间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡以保护肾组织免受炎症细胞的侵害，另一方面还可诱导肾间充质细胞向肾小管上皮细胞的转化，从而诱导肾小管上皮细胞的再生。在正常肾组织中，NGAL呈低水平表达，当接触肾毒性物质或发生缺血性损伤后，皮质肾小管、血液、尿液中会出现NGAL大量蓄积，并可在损伤后3h的尿液和血清中检测到NGAL，明显早于尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(中性粒细胞明胶酶)、β2微球蛋白及血肌酐的改变。NGAL还参与肾损伤的修复等。
用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。该溶液因静电作用而呈稳定的胶体状态，故称胶体金。在碱性条件下，胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团靠静电引力结合。
由于胶体金的电子密度高，颗粒聚集后呈红色，因此可用于标记多种大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。除了与蛋白质结合以外，它还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金免疫层析技术与以往常规诊断方法相比具有以下突出优点：
①快速：全部检测过程仅需1-3分钟。
②简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。
③可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待。
④稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。
⑤检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种人群的检查。
⑥可向基层医疗单位推广：由于具有以上几个特点，使得本方法既可在大型医院使用，又可向基层医疗单位如：乡镇卫生院、连队卫生所、医师诊所、甚至家庭推广使用。
⑦患者可自检，方法家庭化：如果给试剂盒里配置适当的用品，患者可以在家里自检。
⑧系统化：该方法易于形成系列化产品，如肝炎系列、性病系列、胃病系列、肿瘤系列等。
胶体金免疫渗透试验法是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应。胶体金标记抗原(或抗体)检测相应抗体(或抗原)的免疫学新方法，为研制特异、敏感、快速和便捷的免疫学检测技术和临床诊断方法奠定了基础。金标检测法在特制的金标板上加入5μL全血、血清或血浆放在检测仪上2～3min即可得到全定量的结果。
三明治双抗体技术是建立在单克隆抗体技术之上的生物技术领域较新的后抗体技术。双抗体夹心法应用抗体对识别抗原的两个位点来捕捉抗原，避免了抗体与抗原的同一位点的竞争结合，减少了抗原决定簇的空间位阻现象，所以较一般的抗原捕捉法更敏感，特异性更强，重复性更好，尤其适用于抗原含量很少的标本的检测。本发明结合此技术开发针对NGAL的抗体对，对早期检测急性肾损伤病人血液中指标更突显其重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用NGAL的单克隆抗体对作为急性肾损伤早期诊断的生化指标，建立一种能在现场快速检测的试剂板，本方法不需要任何的辅助仪器，检测时间仅5-15分钟，通过测定人血液中的NGAL的浓度，来诊断急性肾损伤，提高了急性肾损伤诊断的敏感性和特异性。
本发明的目的是这样实现的：一种急性肾损伤检测试剂板，包括胶体金标记的NGAL抗体及相应的未标记抗体，羊抗鼠IgG抗体，聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。所述NGAL的抗体是单克隆抗体对。
所述NGAL的单克隆抗体用纯化的抗原免疫BALB／c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞核小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELSA方法鉴定抗NGAL的细胞株，进行三次克隆化得到分泌高特异性单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗NGAL的单克隆抗体。
抗NGAL单克隆抗体对的筛选，主要采用抑制法筛选高亲和力的亚克隆，进而在克隆化和ELSA相加实验结果的基础上进行竞争抑制表位分析和亲和力的测定，得到不同表位的单抗细胞株，进一步腹水生产并纯化得到多量抗体，进行单株标记，采用ELSA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后采用ELSA竞争抑制法进行单标抗体表位测定，从而筛选出高效亲和力的三明治抗体对。
将胶体金标记的抗NGAL的单克隆抗体均匀喷洒于单位面积的聚酯膜上；将抗NGAL的单克隆抗体的另一和羊抗鼠IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上。
金标抗NGAL的单克隆抗体是制备方法为分别取半径为40nm的胶体金及相应的抗NGAL的单克隆抗体，在pH8.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加3％BSA作为稳定剂，采用高速离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单克隆抗体复合物。
该检测板水平面自下而上依次包括：样品吸收区，可溶解的金标抗NGAL的单克隆抗体，固定化抗NGAL的单克隆抗体，一条固相化羊抗鼠IgG抗体和吸水区。
本发明所提供的急性肾损伤检测试剂板，是以NGAL作为生化指标来诊断急性肾损伤。这包括制备上述NGAL的单克隆抗体对的方法，以及利用胶体金标记抗体和免疫层析方法测定血液或血清中的NGAL的浓度，以诊断急性肾损伤。
本方法利用金标记抗NGAL单抗作为第一抗体，用来捕捉抗原；精确呈横条状分布于免疫层析膜上的抗NGAL单克隆抗体对的另一抗体用来识别抗原，通过显示免疫层析膜上的条纹，来判定检测样品中的NGAL的含量，从而筛选和诊断急性肾损伤。
本检测试剂板由聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜、胶体金标记的抗NGAL单抗、未标记抗NGAL单抗、羊抗鼠IgG抗体和吸水纸组成。
与现有技术相比，本发明有突出的优点和实用性：
1、检测敏感性高、特异性强
2、可向基层医疗单位推广：由于具有以上几个特点，使得本方法既可在大型医院使用，又可向基层医疗单位如：乡镇卫生院、连队卫生所、医师诊所、甚至家庭推广使用。
3、检测快速
4、携带方便、操作简便：本发明改变了对急性肾损伤筛选和诊断必须由专业人员或专用仪器才能进行检测的局限性。样品可为全血、血清或血浆，即可直接用指血检测，操作简单快速。
5、本发明制备工艺简单，成本低；检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊设备和仪器。保存期可达两年。
附图说明
图1：急性肾损伤诊断检测试剂板平面结构区域图。
具体实施方式：
实施例一
急性肾损伤诊断检测试剂板的生产方法：
1、NGAL的单克隆抗体对的制备
用纯化的NGAL作为抗原分别免疫BALB／c小鼠，间隔21天免疫第二次，以后每间隔10天免疫一次，共免疫3-4次，然后取出免疫小鼠的脾脏细胞，用PEG将该脾脏细胞与小鼠的骨髓瘤细胞系F／O进行融合，利用HAT选择性培养基在96孔细胞培养板上筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗NGAL的细胞株，进行三次克隆化后得到稳定分泌高特异性单克隆抗体的细胞株，在相同抗原包被板上采用ELSA抑制法，即参照组中加入细胞培养上清，在抑制组加入细胞培养上清和抗原混合物，比较两组OD值差异从而筛选出高亲和力的亚克隆。然后在间接ELISA实验上进行相加法表位分析，即参照组中分别加入两个单株细胞培养上清，测定组中同时加入两株细胞培养上清，比较两组OD值(A1、A2和A1+2)，通过下面公式计算：AI=[2A1+2／(A1+A2)-1]×100％
在比较计算结果的基础上进行表位分析和亲和力的测定，AI值小于50％为相加阴性，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的表位相同，AI值大于50％为相加阳性，表示两细胞株之间无竞争，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的两个不同的表位，从而初步得到针对抗原不同表位的单抗细胞株。进一步将得到的单抗细胞株分别注射入小鼠腹腔进行腹水生产，利用ProteinA-Sepharose亲和层析柱纯化腹水得到多量单克隆抗体，用HRP酶对纯化的抗体进行单株标记，用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后用ELISA竞争抑制法在参照组中加入酶标抗体，在测定组中加入酶标抗体和未标记待测抗体混合物，比较两组OD值，参照组OD值大于测定值OD值的表示存在竞争抑制，视为两抗体识别抗原的表位相同。反之，两抗体不存在竞争抑制时视为两抗体识别抗原的表位不同，从而最终筛选得到高效亲和力的三明治抗体对。
2、胶体金标记抗NGAL单克隆抗体的方法
分别取半径为40nm的胶体金及相应的抗NGAL的单克隆抗体，在pH8.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加3％BSA作为稳定剂，BSA为牛血清白蛋白。采用高速离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单克隆抗体复合物。
3.将金标复合物喷涂于聚酯膜上
用聚乙二醇洗涤胶体金-单克隆抗体复合物，离心出去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，烘干。
4、免疫层析膜的包被
用纯化的抗NGAL单克隆抗体对中的另一单抗溶液和羊抗鼠IgG抗体溶液用喷涂设备于硝酸素纤维膜上划线，线的长度为3mm，每条线在3mm宽的硝酸素纤维膜上的滴加量为5-7ng。两种抗体由下至上分别为NGAL和羊抗鼠IgG抗体，每条线间隔3mm。包被好的免疫层析膜用3％BSA溶液进行封闭。
5、试剂板装备
塑料聚乙烯板作为支撑载体，上面粘有一层聚氧乙烯片材作为衬膜，由下至上由一层滤膜和一层玻璃纤维组成的样品吸收区，其次是三层吸附了胶体金-单抗复合物的聚酯膜。然后是硝酸纤维膜，最上一层是吸水层，由一层滤纸组成，外面用特制胶带包封。
实验例1
急性肾损伤诊断检测试剂板的使用方法：
1、对全血的检测
用滴管取指血100μl滴入检测板的孔中，5-15分钟观察结果。出现两条带时为阳性。只有一条带时为阴性。一条带都无时表示检测板失效。
2、对血清、血浆的检测
用滴管取离心好的血清、血浆100μl垂直滴入检测板的孔中，5-15分钟观察结果。出现两条带时为阳性。只有一条带时为阴性。一条带都无时表示检测板失效。

Claims (7)

1.一种急性肾损伤早期诊断检测试剂板，包括胶体金标记的NGAL抗体及相应的三种未标记抗体，羊抗鼠IgG抗体，聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。
2.如权利要求1所述的急性肾损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：所述抗NGAL的抗体为单克隆抗体对。
3.如权利要求1所述的急性肾损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：所述抗NGAL单克隆抗体分别用纯化的抗原免疫BALB／c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，用ELISA方法鉴定分别抗NGAL的细胞株，进行三次克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗NGAL的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的急性肾损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：抗NGAL单克隆抗体对的筛选，主要采用抑制法筛选高亲和力的亚克隆，进而在多次克隆化和ELISA相加实验结果的基础上进行竞争抑制表位分析和亲和力的测定，得到不同表位的单抗细胞株，进一步腹水生产并纯化得到多量抗体，进行单株标记，采用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后采用ELISA竞争抑制法进行单标抗体表位测定，从而筛选出高效亲和力的抗体对。
5.如权利要求1所述的急性肾损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：将胶体金标记的抗NGAL的单克隆抗体均匀喷洒于单位面积的聚酯膜上；将抗NGAL的单克隆抗体对的另一抗体和羊抗鼠IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上。
6.如权利要求5所述的急性肾损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：金标抗NGAL的单克隆抗体的制备方法为分别取半径为40nm的胶体金及相应的抗NGAL的单克隆抗体，在pH8.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加3％BSA作为稳定剂，采用高速离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单克隆抗体复合物。
7.如权利要求1所述的急性肾损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：该检测板水平面自下而上依次包括：样品吸收区。可溶解的金标抗NGAL的单克隆抗体，固相化抗NGAL的单克隆抗体，一条固相化羊抗鼠IgG抗体和吸水区。
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