CN104459134A - 脑损伤早期诊断s100胶体金免疫测试盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脑损伤早期诊断检测试剂板，属于早期诊断脑损伤的技术领域。本发明利用S100蛋白作为脑损伤早期诊断的生化指标，在一步法检测条或检测板上固定胶体金标记的针对抗原的抗体以及固定化的未标记的抗体，以达到一次性检测脑损伤指标的目的。本发明提供的试剂板简便、快捷，不需要仪器设备，仅用肉眼即可判读结果，适合在任何场所检测，且每份试剂均为单独包装，可存放于室温下，便于保存。本发明检测灵敏性高，特异性强，能够在脑损伤发病早期即开始检测，适合脑损伤早期筛选和诊断。

Description

脑损伤早期诊断S100胶体金免疫测试盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及S100蛋白的抗体对的制备，胶体金标记显色的免疫层析反应技术和利用S100的抗体来早期诊断脑损伤的技术领域。尤其涉及一种脑损伤早期诊断检测试剂板。
技术背景
本发明的主要技术背景包括S100的特异性、胶体金的快速简便、三明治双抗体技术的敏感准确。
S100蛋白是一种低分子量的酸性钙结合蛋白，分子量在10～12kD，其氨基酸序列在脊椎动物中高度保守，中枢神经系统中主要由星形胶质细胞合成与分泌。S100蛋白由A、B两种亚基组成，形成S100AA，S100AB，S100BB3种组合形式。S100AB和S100BB常被统称为S100B，脑内主要以此种形式存在。脑内生理量的S100B主要由星形胶质细胞产生，作用于神经元及其周围生长环境。S100B的功能包括调节细胞生长、能量代谢和参与细胞内信号转导，它能帮助一些特殊神经元的生长并增加发育中和损伤后的神经元存活率。
S100蛋白家族作用的靶蛋白、功能和相关疾病：S100蛋白家族的不同分子具有广泛的生物学活性，通过钙离子信号转导、影响激素分泌和抑制微管蛋白的组装及抑制蛋白激酶C介导的磷酸化等途径，在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达、分泌、及细胞凋亡中发挥重要作用，其功能异常亦可导致不同的疾病。
脑组织缺血、缺氧，继而导致脑损伤。在正常情况下，脑内S100蛋白少量表达，但不能通过血脑屏障，中枢神经系统受损时发生S100蛋白水平上调(30min后开始增加)，是星形胶质细胞常见的特征性反应之一。S100蛋白水平上调表明星形胶质细胞被激活。因此，S100蛋白被公认为星形胶质细胞的分子标记物之一，也被作为脑损伤的一种标记物。S100蛋白可视为星形胶质细胞合成并分泌的一种神经营养因子，在神经元发育和损伤时维持其活力，对脑组织损伤起保护性作用。因此，S100蛋白具有一系列重要的生物学功能。它不仅可以作为脑损伤的生化标志物，而且用于脑组织损伤、脑缺血及脑中风的诊断和治疗。
国内到现在为止还未出现S100蛋白用于脑损伤诊断的，并且到目前只有一个产品：angelplan-ELS1000型电阻抗乳腺诊断仪。国外只有Roche DiagnosticsGmbH生产厂家生产S100检测试剂盒(电化学发光法)，其他是S100定标液等。
电化学发光免疫测定(Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI)应用电致化学发光标记物与电化学手段相结合产生化学发光的免疫分析。ECLI是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。电化学发光法源于电化学法和化学发光法，而ECLI是电化学发光ECL和免疫测定相结合的产物，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程。
ECLI的缺点在于：不适于检测大量标本、检测费用高、仪器维护需要专业人员：检验科医生经培训应能对仪器进行操作和简单维护，但由于仪器故障造成的试剂、标本浪费、报告延迟也会发生。操作复杂，试剂成本高，仪器维护费用较高，这一点上，简便快捷的金标法应具有很大优势。
用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。该溶液因静电作用而呈稳定的胶体状态，故称胶体金。在碱性条件下，胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团靠静电引力结合。
由于胶体金的电子密度高，颗粒聚集后呈红色，因此可用于标记多种大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。除了与蛋白质结合以外，它还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根掘胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金免疫层析技术与以往常规诊断方法相比具有以下突出优点：
①快速：全部检测过程仅需1-3分钟。
②简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。
③可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待。
④稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。
⑤检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种人群的检查。
⑥可向基层医疗单位推广：由于具有以上几个特点，使得本方法既可在大型医院使用，又可向基层医疗单位如：乡镇卫生院、连队卫生所、医师诊所、甚至家庭推广使用。
⑦患者可自检，方法家庭化：如果给试剂盒里配置适当的用品，患者可以在家里自检。
⑧系统化：该方法易于形成系列化产品，如肝炎系列、性病系列、胃病系列、肿瘤系列等。
胶体金免疫渗透试验法是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应。胶体金标记抗原(或抗体)检测相应抗体(或抗原)的免疫学新方法，为研制特异、敏感、快速和便捷的免疫学检测技术和临床诊断方法奠定了基础。金标检测法在特制的金标板上加入5μL全血、血清或血浆放在检测仪上2～3分钟即可得到全定量的结果。
三明治双抗体技术是建立在单克隆抗体技术之上的生物技术领域较新的后抗体技术。双抗体夹心法应用抗体对识别抗原的两个位点来捕捉抗原，避免了抗体与抗原的同一位点的竞争结合，减少了抗原决定簇的空间位阻现象，所以较一般的抗原捕捉法更敏感，特异性更强，重复性更好，尤其适用于抗原含量很少的标本的检测。本发明结合此技术开发针对S100的抗体对，对早期检测脑损伤病人血液中指标更突显其重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用S100的单克隆抗体对作为脑损伤早期珍断的生化指标，建立一种能在现场快速检测的试剂板，本方法不需要任何的辅助仪器，检测时间仅5-15分钟，通过测定人血液中的S100的浓度来诊断脑损伤，提高了脑损伤珍断的敏感性和特异性。
本发明的目的是这样实现的：一种脑损伤检测试剂板，包括胶体金标记的S100抗体及相应的未标记抗体，羊抗鼠IgG抗体，聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。所述S100的抗体是单克隆抗体对。
所述S100的单克隆抗体用纯化的抗原免疫BALB／c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞核小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗S100的细胞株，进行三次克隆化得到分泌高特异性单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗S100的单克隆抗体。
抗S100单克隆抗体对的筛选，主要采用抑制法筛选高亲和力的亚克隆，进而在克隆化和ELISA相加实验结果的基础上进行竞争抑制表位分析和亲和力的测定，得到不同表位的单抗细胞株，进一步腹水生产并纯化得到多量抗体，进行单株标记，采用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后采用ELISA竞争抑制法进行单标抗体表位测定，从而筛选出高效亲和力的三明治抗体对。
将胶体金标记的抗S100的单克隆抗体均匀喷洒于单位面积的聚酯膜上；将抗S100的单克隆抗体的另一和羊抗鼠IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上。
金标抗S100的单克隆抗体是制备方法为分别取半径为40nm的胶体金及相应的抗S100的单克隆抗体，在pH8.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加3％BSA作为稳定剂，采用高速离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单克隆抗体复合物。
该检测板水平面自下而上依次包括：样品吸收区，可溶解的金标抗S100的单克隆抗体，固定化抗S100的单克隆抗体，一条固相化羊抗鼠IgG抗体和吸水区。
本发明所提供的脑损伤检测试剂板，是以S100作为生化指标来诊断脑损伤。这包括制备上述S100的单克隆抗体对的方法，以及利用胶体金标记抗体和免疫层析方法测定血液或血清中的S100的浓度，以诊断脑损伤。
本方法利用金标记抗S100单抗作为第一抗体，用来捕捉抗原；精确呈横条状分布于免疫层析膜上的抗S100单克隆抗体对的另一抗体用来识别抗原，通过显示免疫层析膜上的条纹，来判定检测样品中的S100的含量，从而筛选和珍断脑损伤。
本检测试剂板由聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜、胶体金标记的抗S100单抗、未标记抗S100单抗、羊抗鼠IgG抗体和吸水纸组成。
与现有技术相比，本发明有突出的优点和实用性：
1、检测敏感性高、特异性强
2、可向基层医疗单位推广：由于具有以上几个特点，使得本方法既可在大型医院使用，又可向基层医疗单位如：乡镇卫生院、连队卫生所、医师诊所、甚至家庭推广使用。
3、检测快速
4、携带方便、操作简便：本发明改变了对脑损伤筛选和诊断必须由专业人员或专用仪器才能进行检测的局限性。样品可为全血、血清或血浆，即可直接用指血检测，操作简单快速。
5、本发明制备工艺简单，成本低；检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊设备和仪器。保存期可达两年。
6、
附图说明
图1：脑损伤诊断检测试剂板平面结构区域图。
具体实施方式：
实施例一
脑损伤诊断检测试剂板的生产方法：
1、S100的单克隆抗体对的制备
用纯化的S100作为抗原分别免疫BALB／c小鼠，间隔21天免疫第二次，以后每间隔10天免疫一次，共免疫3-4次，然后取出免疫小鼠的脾脏细胞，用PEG将该脾脏细胞与小鼠的骨髓瘤细胞系F／O进行融合，利用HAT选择性培养基在96孔细胞培养板上筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗S100的细胞株，进行三次克隆化后得到稳定分泌高特异性单克隆抗体的细胞株，在相同抗原包被板上采用ELISA抑制法，即参照组中加入细胞培养上清，在抑制组加入细胞培养上清和抗原混合物，比较两组OD值差异从而筛选出高亲和力的亚克隆。然后在间接ELISA实验上进行相加法表位分析，即参照组中分别加入两个单株细胞培养上清，测定组中同时加入两株细胞培养上清，比较两组OD值(A1、A2和A1+2)，通过下面公式计算：AI=[2A1+2／(A1+A2)-1]×100％
在比较计算结果的基础上进行表位分析和亲和力的测定，AI值小于50％为相加阴性，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的表位相同，AI值大于50％为相加阳性，表示两细胞株之间无竞争，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的两个不同的表位，从而初步得到针对抗原不同表位的单抗细胞株。进一步将得到的单抗细胞株分别注射入小鼠腹腔进行腹水生产，利用ProteinA-Sepharose亲和层析柱纯化腹水得到多量单克隆抗体，用HRP酶对纯化的抗体进行单株标记，用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后用ELISA竞争抑制法在参照组中加入酶标抗体，在测定组中加入酶标抗体和未标记待测抗体混合物，比较两组OD值，参照组OD值大于测定值OD值的表示存在竞争抑制，视为两抗体识别抗原的表位相同。反之，两抗体不存在竞争抑制时视为两抗体识别抗原的表位不同，从而最终筛选得到高效亲和力的三明治抗体对。
2、胶体金标记抗S100单克隆抗体的方法
分别取半径为40nm的胶体金及相应的抗S100的单克隆抗体，在pH8.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加3％BSA作为稳定剂，BSA为牛血清白蛋白。采用高速离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单克隆抗体复合物。
3.将金标复合物喷涂于聚酯膜上
用聚乙二醇洗涤胶体金-单克隆抗体复合物，离心出去上青叶，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，烘干。
4、免疫层析膜的包被
用纯化的抗S100单克隆抗体对中的另一单抗溶液和羊抗鼠IgG抗体溶液用喷涂设备于硝酸素纤维膜上划线，线的长度为3mm，每条线在3mm宽的硝酸素纤维膜上的滴加量为5-7ng。两种抗体由下至上分别为S100和羊抗鼠IgG抗体，每条线间隔3mm。包被好的免疫层析膜用3％BSA溶液进行封闭。
5、试剂板装备
塑料聚乙烯板作为支撑载体，上面粘有一层聚氧乙烯片材作为衬膜，由下至上由一层滤膜和一层玻璃纤维组成的样品吸收区，其次是三层吸附了胶体金-单抗复合物的聚酯膜。然后是硝酸纤维膜，最上一层是吸水层，由一层滤纸组成，外面用特制胶带包封。
实验例一
脑损伤珍断检测试剂板的使用方法：
1、对全血的检测
用滴管取指血100μl滴入检测板的孔中，5-15分钟观察结果。出现两条带时为阳性。只有一条带时为阴性。一条带都无时表示检测板失效。
2、对血清、血浆的检测
用滴管取离心好的血清、血浆100μl垂直滴入检测板的孔中，5-15分钟观察结果。出现两条时为阳性。只有一条带时为阴性。一条带都无时表示检测板失效。
虽然已经根据上述特定的实施方案叙述了本发明，但应该承认，本领域技术人员可能对本发明做出各种修饰和转变，而这些修饰和转变同样属于所附权利要求书所定义的本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种脑损伤早期诊断检测试剂板，包括胶体金标记的S100抗体及相应的单克隆抗体，羊抗鼠IgG抗体，聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。
2.如权利要求1所述的脑损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：所述抗S100的抗体为单克隆抗体对。
3.如权利要求1所述的脑损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：所述抗S100单克隆抗体分别用纯化的抗原免疫BALB／c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，用ELISA方法鉴定分别抗S100的细胞株，进行三次克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗S100的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的脑损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：抗S100单克隆抗体对的筛选，主要采用抑制法筛选高亲和力的亚克隆，进而在多次克隆化和ELISA相加实验结果的基础上进行竞争抑制表位分析和亲和力的测定，得到不同表位的单抗细胞株，进一步腹水生产并纯化得到多量抗体，进行单株标记，采用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后采用ELISA竞争抑制法进行单标抗体表位测定，从而筛选出高效亲和力的抗体对。
5.如权利要求1所述的脑损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：将胶体金标记的抗S100的单克隆抗体均匀喷洒于单位面积的聚酯膜上；将抗S100的单克隆抗体对的另一抗体和羊抗鼠IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上。
6.如权利要求5所述的脑损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：金标抗S100的单克隆抗体的制备方法为分别取半径为40nm的胶体金及相应的抗S100的单克隆抗体，在pH8.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加3％BSA作为稳定剂，采用高速离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单克隆抗体复合物。
7.如权利要求1所述的脑损伤早期诊断检测试剂板，其特征在于：该检测板水平面自下而上依次包括：样品吸收区，可溶解的金标抗S100的单克隆抗体，固相化抗S100的单克隆抗体，一条固相化羊抗鼠IgG抗体和吸水区。
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