CN104458934B - 一种烟草及烟草制品中水溶性糖的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，它利用加速溶剂萃取提取烟草中的水溶性糖，再分别利用肟化‑硅烷化与糖氰化‑乙酰化二种衍生化方法，肟化‑硅烷化产物直接气相色谱‑火焰离子化检测器测定；糖氰化‑乙酰化产物利用超声辅助‑分散液液微萃取进行提取后再进行气相色谱‑火焰离子化检测器测定。本发明与其它分析烟草中的水溶性糖的方法相比，具有简单快速，重现性好，灵敏度高，以及对水溶性糖分离能力好的特点，能对烟草中的水溶性糖进行准确定量。

Description

一种烟草及烟草制品中水溶性糖的检测方法

技术领域

本发明属于烟草化学成分的测定方法技术领域，具体涉及一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法。

背景技术

水溶性糖是烟草生长发育过程中重要的初级代谢产物，它们不仅与烟草的光合与呼吸作用直接相关，还直接影响着烟草的品质与质量。水溶性糖的含量高低与烟草的香味、刺激性及焦油的产生关系密切，例如，水溶性的还原糖与氨基化合物能燃烧产生呋喃类美拉德反应产物，能有效改善烟草的品质，减少木质杂气，增加烟香。此外，高含量糖的烟草也会导致主流烟气中有毒及致癌物质的增加，主要有甲醛、乙醛、丙酮和丙烯醛等。据研究报道，乙醛还能够增加吸烟者对尼古丁的依耐性。不同品种、部位、产地的烟草中水溶性糖含量的不同，也导致了烟叶配伍性的显著差异。因此，建立烟叶中水溶性糖的检测方法，对于烟叶生产、烟叶品质评价、烟叶配伍性及安全性研究等具有非常重要的指导意义。

目前还没有一套简单，快速和对环境绿色友好的关于烟草及烟草制品中水溶性糖的测得方法。建立一套简单，快速、对环境绿色友好且准确的方法以提高样品检测通量，减少环境污染是非常必要的。

文献调研表明：烟草中水溶性糖的提取及净化方法主要为振荡提取，超声提取和固相萃取净化，但振荡提取与超声提取都存在提取时间长，溶剂消耗大等缺陷，从而导致样品检测通量不高，环境污染较大。此外，水溶性糖的固相萃取净化也大大增加了样品的检测成本。

烟草中水溶性的检测方法主要分为两大类，第一类为非衍生化方法：该方法主要利用液相色谱-蒸发光散射检测器和离子色谱-脉冲安培检测器进行检测，由于水溶性糖的结构非常相似，导致其在液相色谱柱和离子色谱柱上不能基线分离，从而影响定量。第二类为衍生化方法：该方法主要利用气相色谱进行检测，气相色谱具有非常高的理论塔板数，能顺利分离各种结构非常相似的水溶性糖。但通过对以往文献的调研表明：烟草中水溶性糖的衍生化检测主要存在三个问题1)由于水溶性糖(果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)的结构非常相似，没有单独的一种衍生化方法能较好的将其基线分离；2)衍生化方法的反应时间较长；3)衍生化后的后处理较复杂，需要多步骤的溶剂萃取。因此，有必要开发一种简单，快速，准确和对水溶性糖分离能力好的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，该方法具有简单快速，重现性好，灵敏度高，以及对水溶性糖分离能力好的特点，能对烟草中的水溶性糖进行准确定量，可以克服现有技术的不足。

本发明技术方案：

一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，它包括以下步骤：

A、烟草及烟草制品中水溶性糖的提取：将烟草样品粉碎后过80-100目筛后，向5mL萃取池中放入纤维素滤膜，再放入适量硅藻土，称取200mg烟草样品粉末按照1:2与硅藻土混合后放入萃取池，加入内标溶液进行加速溶剂萃取；将提取溶剂转移至10mL容量瓶中，再用乙醇：水(1:1V/V)定容到10mL后混匀，分别取二个500μL提取溶液至2mL色谱瓶和10mL离心管中，38-40℃条件下氮气吹干进行衍生化；

B、烟草及烟草制品中水溶性糖的衍生化：(1)肟化-硅烷化：将2mL色谱瓶中的吹干残留物先进行肟化反应，再将肟化产物进行硅烷化，反应后直接用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测；(2)糖氰化-乙酰化：将10mL离心管中的吹干残留物先进行糖氰化反应，再将糖氰化产物进行乙酰化，反应结束后用超声辅助-分散液液微萃取萃取糖氰化-乙酰化产物；

C、烟草及烟草制品中水溶性糖的衍生化产物的提取：向氰化-乙酰化产物中加入氯化钠水溶液，再加入提取溶剂进行提取，提取结束后，用100μL微量进样针吸取离心管中的沉淀相，将其转移至250μL微量进样瓶中用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测；

D、烟草及烟草制品中水溶性糖的色谱检测条件：气相色谱-火焰离子化检测器色谱条件为：色谱柱为TR-1柱，长度60m，内径0.32mm，膜厚0.25μm，载气：高纯氮气，载气流量：1.5mL/min，进样口与检测器温度为260℃，进样量为1μL，分流进样，分流比为7:1，检测器气体流量为干燥空气：350mL min^-1，高纯氢气：35mL min^-1和尾吹气高纯氮气30mL min^-1；柱温升温程序为80℃保持2min，5℃min^-1升到240℃保持5min，再以20℃min^-1升到280℃保持15min，一共运行56min；

E、烟草及烟草制品中水溶性糖的定性及定量方法：分别采用保留时间和内标法进行定性和定量分析。

上述内标溶液为80μL浓度为25mg mL^-1的苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷乙醇：水(1:1V/V)溶液。

上述加速溶剂萃取的条件为：萃取溶剂为乙醇：水(1:1V/V)、压力为1500psi、温度为80℃、静态萃取时间为5min、静态循环次数为2次、冲洗体积为0％，吹扫时间为80s。

上述肟化条件为加入300μL浓度为25mg mL^-1的O-甲基羟胺盐酸盐(吡啶溶解)，80℃肟化10min。

上述硅烷化条件为加入100μL N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)，80℃硅烷化10min。

上述糖氰化反应的条件为加入300μL浓度为25mg mL^-1的盐酸羟胺(吡啶：N-甲基咪唑：甲醇2:1:1V/V/V溶解)，80℃糖氰化5min，乙酰化条件为加入500μL乙酸酐溶液，常温反应5min。

上述超声辅助-分散液液微萃取的条件为加入2.3mL11％w/v的氯化钠水溶液，再加入44μL三氯甲烷，涡旋混匀1min后放入超声波中超声辅助-分散液液微萃取5min，微萃取后放入离心机中4000rpm离心5min。

上述内标法定量的方法为果糖采用肟化-硅烷化方法进行定量，木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖10种水溶性糖采用糖氰化-乙酰化方法进行定量。

本发明的有益效果：

本发明建立了一种以加速溶剂萃取提取烟草中的水溶性糖，再分别以肟化-硅烷化和糖氰化-乙酰化进行衍生化，衍生化后肟化-硅烷化产物直接用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测，糖氰化-乙酰化产物利用超声辅助-分散液液微萃取进行提取后采用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测的方法。同时本发明为了获得超声辅助-分散液液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分别采用了部分析因设计、Doehlert设计和渴望函数进行方法优化。与现有技术相比，本方法的优点是：采用加速溶剂萃取提取的方法减少了有机溶剂的使用和提取时间；采用二种衍生化方法的方法，完全分离了11种水溶性糖；采用吡啶：N-甲基咪唑：甲醇2:1:1V/V/V为糖氰化-乙酰化的溶剂，大大减少了衍生化的反应时间；采用超声辅助-分散液液微萃取的方法，减少了有机溶剂的使用及提取的时间，提高了方法的灵敏度。本发明具有简单快速，重现性好，灵敏度高，以及对水溶性糖分离能力好的优点，能对烟草中的水溶性糖进行准确定量。

附图说明

图1本发明中烟草中水溶性糖的检测方法流程图；

图2中A为果糖肟化-硅烷化后的烟草样品色谱图；B为果糖肟化-硅烷化后的标准样品色谱图；1为果糖；IS为内标苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷；

图3中A为10种水溶性糖糖氰化-乙酰化后的烟草样品色谱图；B为10种水溶性糖糖氰化-乙酰化后的标准样品色谱图；2木糖、3甘露糖、4葡萄糖、5半乳糖、6肌醇、7山梨醇、8麦芽糖、9乳糖、10蔗糖、11蜜二糖；IS内标苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷。

具体实施方案

本发明通过以下实例对上述方法进一步进行描述，但并不限制本发明。

实施例1

本发明烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法包括如下步骤：

(1)将烟草样品粉碎后过80-100目筛后，向5mL萃取池中放入纤维素滤膜,再放入适量硅藻土，称取200mg烟草粉末按照1:2与硅藻土混合后放入萃取池，加入80μL浓度为25mg mL^-1的苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷内标后进行加速溶剂萃取。其中加速溶剂萃取条件为：萃取溶剂为乙醇：水(1:1V/V)、压力为1500psi、温度为80℃、静态萃取时间为5min、静态循环次数为2次、冲洗体积为0％和吹扫时间为80s。

(2)将提取溶剂转移至10mL容量瓶中，再用乙醇：水(1:1V/V)定量到10mL后混匀，分别取二个500μL提取溶液至2mL色谱瓶和10mL离心管中，38-40℃条件下氮气吹干进行衍生化。

(3)将2mL色谱瓶中的吹干残留物进行肟化-硅烷化：加入300μL浓度为25mg mL^-1的O-甲基羟胺盐酸盐(吡啶溶解)，80℃肟化10min，再加入100μL N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)，80℃硅烷化10min，反应后用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测。

(4)将10mL离心管中的吹干残留物进行糖氰化-乙酰化：加入300μL浓度为25mgmL^-1的盐酸羟胺(吡啶：N-甲基咪唑：甲醇2:1:1V/V/V溶解)，80℃糖氰化5min，再加入500μL溶液，常温乙酰化5min，反应结束后用超声辅助-分散液液微萃取提取糖氰化-乙酰化产物。

(5)加入2.3mL11％w/v的氯化钠水溶液，再加入44μL三氯甲烷，涡旋混匀1min后放入超声波中超声辅助-分散液液微萃取5min，萃取后放入离心机中4000rpm离心5min，用100μL微量进样针吸取离心管中的沉淀相，将其转移至250μL微量进样瓶中用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测。

(6)本发明中果糖采用肟化-硅烷化方法进行定量，其它10种水溶性糖(木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖)采用糖氰化-乙酰化方法进行定量。

本发明中气相色谱-火焰离子化检测器色谱分析条件为：色谱柱为TR-1柱，长度60m，内径0.32mm，膜厚0.25μm，载气：高纯氮气，载气流量：1.5mL/min，进样口与检测器温度为260℃，进样量为1μL，分流进样，分流比为7:1，检测器气体流量为干燥空气：350mL min^-1，高纯氢气：35mL min^-1和尾吹气高纯氮气30mL min^-1。柱温升温程序为80℃保持2min，5℃min^-1升到240℃保持5min，再以20℃min^-1升到280℃保持15min，一共运行56min。

配制相应浓度的母液，然后按照对应的衍生化方法将母液混合并稀释成5个浓度梯度的混合标样分别进行衍生化并提取，再进行气相色谱-火焰离子化检测器分析，并以目标化合物峰面积与内标物峰面积的比为纵坐标(Y)，目标化合物量与内标量(100μg)的比值为横坐标(X)进行回归分析，得到回归方程及相关参数，将最低浓度的标准溶液按照信噪比(S/N＝3)为3计算方法的最低检测限(LOD)，同时向烟草中添加两个浓度梯度的水溶性糖后进行提取，对方法的回收率进行评价，重复5次，从而对方法的精密度(RSD)进行评价。结果见表1。

表1烟草中11种水溶性糖的回收率，精密度，线性及检测限

结果表明，相关系数R²均在0.9987以上，表明烟草中的11种水溶性糖在浓度范围内呈良好的线性关系，同时该方法还表现出非常好的灵敏度。此外，方法的回收率与精密度分别在94.1-105.0％和2.1-6.6％之间，都达到了严格的定量要求。

实施例2

采用如实施例1的方法分别对不同品种(Bina 1、K326和Nanjiang 3)、同一部位(C3F)的烟叶进行加速溶剂萃取-衍生化-超声辅助分散液液微萃取-气相色谱-火焰离子化检测器测定水溶性糖。测定结果见表2。

表2不同品种烟叶中水溶性糖的含量

^a数据为5次测定的平均值±标准偏差；ND,未检测到。

Claims (8)

1.一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、烟草及烟草制品中水溶性糖的提取：将烟草样品粉碎后过80-100目筛后，向5mL萃取池中放入纤维素滤膜，再放入适量硅藻土，称取200mg烟草样品粉末按照1:2与硅藻土混合后放入萃取池，加入内标溶液进行加速溶剂萃取；将提取溶剂转移至10mL容量瓶中，再用体积比为1:1的乙醇和水的溶液定容到10mL后混匀，分别取二个500μL提取溶液至2mL色谱瓶和10mL离心管中，38–40℃条件下氮气吹干进行衍生化；

B、烟草及烟草制品中水溶性糖的衍生化：(1)肟化-硅烷化：将2mL色谱瓶中的吹干残留物先进行肟化反应，再将肟化产物进行硅烷化，反应后直接用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测；(2)糖氰化-乙酰化：将10mL离心管中的吹干残留物先进行糖氰化反应，再将糖氰化产物进行乙酰化，反应结束后用超声辅助-分散液液微萃取萃取糖氰化-乙酰化产物；

C、烟草及烟草制品中水溶性糖的衍生化产物的提取：向氰化-乙酰化产物中加入氯化钠水溶液，再加入提取溶剂进行提取，提取结束后，用100μL微量进样针吸取离心管中的沉淀相，将其转移至250μL微量进样瓶中用气相色谱-火焰离子化检测器进行检测；

D、烟草及烟草制品中水溶性糖的色谱检测条件：气相色谱-火焰离子化检测器色谱分析条件为：色谱柱为TR-1柱，长度60m，内径0.32mm，膜厚0.25μm，载气：高纯氮气，载气流量：1.5mL/min，进样口与检测器温度为260℃，进样量为1μL，分流进样，分流比为7:1，检测器气体流量为干燥空气：350mL min^-1，高纯氢气：35mL min^-1和尾吹气高纯氮气30mLmin^-1；柱温升温程序为80℃保持2min，5℃min^-1升到240℃保持5min，再以20℃min^-1升到280℃保持15min，一共运行56min；

E、烟草及烟草制品中水溶性糖的定性及定量方法：分别采用保留时间和内标法进行定性和定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述内标溶液为80μL浓度为25mg mL^-1的苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷溶液。

3.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述加速溶剂萃取的条件为：萃取溶剂为体积比例为1:1的乙醇：水溶液、压力为1500psi、温度为80℃、静态萃取时间为5min、静态循环次数为2次、冲洗体积为0％，吹扫时间为80s。

4.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述肟化条件为加入300μL、用吡啶溶解的浓度为25mg mL^-1的O-甲基羟胺盐酸盐，80℃肟化10min。

5.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述硅烷化条件为加入含1％三甲基氯硅烷的100μL N,O-双-三甲基硅烷基-乙酰胺，80℃硅烷化10min。

6.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述糖氰化反应的条件为加入300μL、浓度为25mg mL^-1的盐酸羟胺，80℃糖氰化5min，乙酰化条件为加入500μL乙酸酐溶液，常温反应5min，其中盐酸羟胺所用溶剂中吡啶：N-甲基咪唑：甲醇体积比为2:1:1。

7.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述超声辅助-分散液液微萃取的条件为加入2.3mL11％w/v的氯化钠水溶液，再加入44μL三氯甲烷，涡旋混匀1min后放入超声波中超声辅助-分散液液微萃取5min，微萃取后放入离心机中4000rpm离心5min。

8.根据权利要求1所述的一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述内标法定量的方法为果糖采用肟化-硅烷化方法进行定量，木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖10种水溶性糖采用糖氰化-乙酰化方法进行定量。