CN104447365A - 一种阳离子脂质分子及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式(I)表示的脂质分子-CL1、其制备方法及其用途。所述脂质分子-CL1的制备方法为：以对甲基苯磺酸为催化剂，将含叔胺的分子与含有疏水尾部的分子进行反应得到CL1，简称为(I)。CL1脂质分子制备方法简单，可用于制备脂质体，该脂质分子所提供的正电荷可以有效地复合带负电荷的基因药物，提高脂质体的运转效率，可用于医药领域、化妆品领域等。
Description
技术领域
本发明属于药物载体领域，具体涉及一种阳离子脂质分子，尤其涉及一种合成工艺简单、低毒性的阳离子脂质分子-CL1、其制备方法和用途。
背景技术
脂质体是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构。脂质体具有生物相容性好、低毒性、低免疫反应等优点。目前，脂质体被用于包封疏水性药物、亲水性药物和基因药物等，静脉注射后脂质体能有效延缓药物释放，提高生物利用度，在医药领域、化妆品领域等具有广泛应用。
阳离子脂质体通常由阳离子脂质和其他辅脂质在适当的条件下复合而成，其中阳离子脂质通过静电作用与基因复合，而辅脂质则起到防止脂质氧化或将配体连接至脂质体的表面的作用或者可以减少脂质颗粒的聚集。
带有正电荷的阳离子脂质体，可作为带负电荷药物的传递载体，特别适用于蛋白、多肽、DNA和RNA类药物，故在抗病毒、抗癌症等方面的基因治疗研究中有独特应用。但是阳离子脂质体在临床应用仍然存在困难。阳离子脂质体基因复合物由于表面一直带有正电荷，在血液循环过程中，易于与血浆中的血清蛋白产生非特异性吸附，形成大尺寸的聚集体，该聚集体易被网状内皮系统清除，导致其血液循环时间短，稳定性差，运转效率低。
尽管目前国内利用脂质体介导核酸药物用于基因治疗的报道比较多，但对于脂质体能多大程度包裹核酸药物以及脂质体在机体内的毒性等方面的研究，均未见有综合性报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子脂质分子，特别是一种合成工艺简单、低毒性的阳离子脂质分子-CL1及其制备方法和用途。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种脂质分子-CL1，所述脂质分子-CL1由下式(I)表示：
其中：
R1为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
R2为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
X为氢、取代或未取代的C10-18烷基(例如卤代-C10-18烷基或羟基-C10-18烷基)、取代或未取代的C10-18烷氧基(例如卤代-C1-10烷氧基)、取代或未取代的C6-12芳基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳基-C10-18烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的C10-18环烷基、取代或未取代的C10-18环烷基-C10-18烷基或取代或未取代的杂环基-C10-18烷基中的任意1种。
R3独立地选自氢、取代或未取代的C1-10烷基(例如卤代-C1-10烷基或羟基-C1-10烷基)、取代或未取代的C1-10烷氧基(例如卤代-C1-10烷氧基)、取代或未取代的C6-12芳基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳基-C1-8烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的C3-10环烷基、取代或未取代的C3-10环烷基-C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基-C1-8烷基中的任意1种。
第二方面，本发明还提供了如第一方面所述的脂质分子-CL1的制备方法，包括以下步骤：
化合物(I)的合成：叔胺分子与Y-X反应得到化合物(I)
下面按照上述反应式说明本发明的具体制备方法。
所述制备方法包括：叔胺分子与Y-X反应得到化合物(I)。
本发明中所述叔胺分子为含有羟基，氨基，巯基或卤素接头的亲水基团的分子，优选为含有羟基。
本发明中所述Y-X为含有羧基和/或酰氯接头的化合物，优选为含有羧基。
本发明中所述反应以二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、正己烷、乙醚、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或甲苯中的任意1种或至少2种的组合为溶剂，优选为甲苯。
本发明中所述反应以磷酸，硼酸，有机磺酸，盐酸盐及硫酸盐，阳离子交换树脂，多种沸石(包括合成分子筛)和各种改性沸石及氧化物催化剂，杂多酸以及固体超强酸等为催化剂，优选为对甲基苯磺酸。
本发明中所述反应温度为80～150℃，进一步优选为100～120℃，特别优选为110℃。
第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的脂质分子-CL1的用途，所述脂质分子-CL1用于脂质体的提供正电荷负载带负电的基因药物，可用于提高脂质体的运转效率，在医药领域、化妆品领域具有很大应用前景。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
本发明的脂质分子具有叔胺头部，该叔胺结构在中性条件不带电荷，所以在血液中具有长循环的特点，减少了在机体中的毒性，而且该新型脂质分子-CL1合成工艺简单，并具有较强负载基因能力，可以提高转染效率。
附图说明
图1是本发明实施例1所制备的化合物(I)CL1脂质分子的1H NMR谱图。
图2是本发明实施例2所制备的化合物(I)CL1脂质分子的相转变温度PIT图。
图3是本发明实施例3所制备的是化合物(I)CL1脂质分子构成脂质体的细胞毒性图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
脂质分子CL1(化合物(I))的合成
称取50.27g(176.7mmol)硬脂酸，18.3g(96.2mmol)对甲基苯磺酸，取约350mL甲苯溶解，在温度为110℃条件回流反应；1h之后，在混合液中加入9.56g(80.2mmol)N-甲基二乙醇胺(NMA)，反应过夜；第二天，停止加热，加入30mLNaCl饱和溶液萃取。采用旋转蒸发仪除去溶剂甲苯，加入适量二氯甲烷，抽滤，得白色固体，继而柱层析提纯，得终产物，其结构表征如图1所示。
实施例2
阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
1)制备阳离子脂质体：称取摩尔比例为6：3：1的阳离子脂质CL1，胆固醇和DSPE-PEG，使其在有机溶剂中充分溶解，摇匀，形成油相，至浓度为1mg/mL；量取体积为3倍量有机溶剂的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在水浴中，磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌得到脂质体混悬液；将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的有机溶剂透出，每隔一段时间更换一次透析液；将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
2)制备核酸类药物制剂工作液：取0.03mL的生理盐水作为核酸类药物制剂的工作液。
3)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取一定量的阳离子脂质体，溶于核酸类药物制剂工作液，平衡2h。按照质量比为5/1、25/1，50/1，100/1，150/1和200/1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂工作液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实施例3
脂质分子CL1(化合物(I))的相转变温度(PIT)分析
相转变温度(PIT)，对于某一特定的表面活性剂-油-水体系，存在着一个较窄的温度范围。在该温度以上，表面活性剂溶于油相，而在该温度以下，表面活性剂溶于水相。制备脂质体以及复合siRNA的温度均为37℃及以下，脂质分子CL1的相转变温度在38℃，因此可以在制备过程中保持脂质体的稳定性，其表征如图2所示。
实施例4
脂质分子CL1(化合物(I))的细胞毒性实验
实验以质量比为5:1、25:1、50:1、100:1、150:1、200:1的阳离子脂质体/siRNA复合物为例，加入脂质分子CL1和长循环中性脂质DSPE-PEG进行修饰，以HepG-2细胞为模型，采用MTT法，在酶联免疫检测仪490nm波长条件下，测定其吸光度值(A490)，以未转染细胞为空白细胞，检测该脂质体的细胞毒性。发现该阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞毒性低，5:1、25:1、50:1、100:1、150:1、200:1等比例的细胞存活率均在85.8％以上，优选比例的细胞存活率在95.5％以上，因此本发明的脂质分子能显著降低脂质体细胞毒性，详细结果如图3所示。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种脂质分子-CL1，其特征在于，所述脂质分子-CL1的结构式如下：
其中：
R1为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
R2为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
X为氢、取代或未取代的C10-18烷基、取代或未取代的C10-18烷氧基、取代或未取代的C6-12芳基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳基-C10-18烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的C10-18环烷基、取代或未取代的C10-18环烷基-C10-18烷基、取代或未取代的杂环基-C10-18烷基中的任意1种；
R3独立地选自氢、取代或未取代的C1-10烷基、取代或未取代的C1-10烷氧基、取代或未取代的C6-12芳基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳基-C1-8烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的C3-10环烷基、取代或未取代的C3-10环烷基-C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基-C1-8烷基中的任意1种。
2.如权利要求1所述的脂质分子-CL1，其特征在于，所述X为卤代-C10-18烷基、羟基-C10-18烷基或卤代-C1-10烷氧基中的任意1种。
3.如权利要求1所述的脂质分子-CL1，其特征在于，所述R3为卤代-C1-10烷基、羟基-C1-10烷基或卤代-C1-10烷氧基中的任意1中。
4.如权利要求1所述的脂质分子-CL1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
化合物(I)的合成：叔胺分子与Y-X反应得到化合物(I)
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述叔胺分子为含有羟基，氨基，巯基或卤素接头的亲水基团的分子，优选为含有羟基；
所述Y-X为含有羧基和/或酰氯接头的化合物，优选为含有羧基。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述反应以二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、正己烷、乙醚、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或甲苯中的任意1种或至少2种的组合为溶剂，优选为甲苯。
7.如权利要求4-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述反应以磷酸，硼酸，有机磺酸，盐酸盐、硫酸盐，阳离子交换树脂，沸石、氧化物、杂多酸或固体超强酸中的任意1中或至少2中的组合为催化剂，优选为对甲基苯磺酸。
8.如权利要求4-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述反应温度为80～150℃，进一步优选为100～120℃，特别优选为110℃。
9.如权利要求1-8中任意一项所述的脂质分子-CL1的用途，其特征在于，所述脂质分子-CL1用于脂质体的提供正电荷负载带负电的基因药物。
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