CN104436183B - 一种伤寒多糖疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种伤寒多糖疫苗的制备方法，包括将培养液离心去除菌体后收集上清液；向上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液至终浓度为0.1％～0.2％，混匀，形成沉淀；将沉淀物离心处理后溶解沉淀物，然后向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为20％，于2～8℃存放24小时，离心收集上清液，然后洗涤精制。本发明对沉淀剂进行了优化，选择十二烷基硫酸钠作为沉淀剂，提高了疫苗的回收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及到一种伤寒多糖疫苗的制备方法。
背景技术
伤寒疫苗的制备包括了疫苗原液的制备以及将疫苗原液制备成疫苗产品这两个大的过程。在制备疫苗原液的过程中，往往需要先将培养液中的多糖形成沉淀物，而加入的沉淀剂常用的为十六烷基三甲基溴化铵。如已经公开的中国发明专利，专利号为201110171746.5，其中介绍了将培养液制备成原液的过程；且在该专利文件的背景技术中，也记载了其他多糖纯化工艺，这些文献中记载的沉淀剂均为十六烷基三甲基溴化铵。
经过本发明人的研究，对上述文件中记载的方法进行了确认，发现按照这些方法记载的步骤获得的回收率均在50％～76％之间。经过研究，影响回收率的条件可能存在于沉淀剂的选择、解离剂的选择以及各种工艺步骤的具体参数；且其中沉淀剂的类型选择对回收率的影响最大，因此发明人着重对沉淀剂进行了研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以克服现有生产伤寒VI多糖疫苗原液回收率低的缺陷的制备方法。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种伤寒多糖疫苗的制备方法，包括以下步骤：
A、将培养液离心去除菌体后收集上清液；
B、向上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液至终浓度为0.1％～0.2％，混匀，于2℃～8℃条件下存放24小时，使混合溶液形成沉淀；
C、将沉淀物离心处理，使用0.7mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌后使多糖与十二烷基硫酸钠解离；
D、向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为20％，于2～8℃存放24小时，离心收集上清液；
E、将上清液过滤，并在滤液中加入95％的乙醇至乙醇终浓度为75％，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后的多糖按200～300毫升/克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖疫苗原液。
作为上述实施例的优化，在步骤B中，十二烷基硫酸钠溶液在总溶液中的质量分数为0.13％；同时可以再多糖疫苗原液中加入稳定剂和冻干剂制成疫苗冻干粉。
综上所述，本发明具有以下优点：
本发明对沉淀剂进行了优化，选择十二烷基硫酸钠作为沉淀剂，提高了疫苗的回收率。
具体实施方式
对比实验方法：
选用3批不同批次的伤寒菌培养液，批号分别为201301、201302和201303，每个批号的培养液分成两组，一组采用传统的方法制备原液，另一组采用本发明的方法制备原液，并比较两者的回收率，并同时检测本发明的疫苗的稳定性。
实施例1：
将三个批号的培养液分别按照以下步骤制得三组疫苗原液。
步骤一、将培养液离心去除菌体后收集上清液；
步骤二、向上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液至终浓度为0.1％～0.2％，混匀，于5℃条件下存放24小时，使混合溶液形成沉淀；
步骤三、将沉淀物离心处理，使用0.7mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌后使多糖与十二烷基硫酸钠解离；
步骤四、向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为20％，于2～8℃存放24小时，离心收集上清液；
步骤五、将上清液过滤，并在滤液中加入95％的乙醇至乙醇终浓度为75％，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后的多糖按200～300毫升/克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖疫苗原液；得到三个批次的疫苗原液。
对照组：
将三个批号的培养液分别按照以下步骤制得三组疫苗原液。
步骤一、将培养液离心去除菌体后收集上清液；
步骤二、向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为0.1％～0.2％，混匀，于5℃条件下存放24小时，使混合溶液形成沉淀；
步骤三、将沉淀物离心处理，使用0.7mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌后使多糖与十二烷基硫酸钠解离；
步骤四、向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为20％，于2～8℃存放24小时，离心收集上清液；
步骤五、将上清液过滤，并在滤液中加入95％的乙醇至乙醇终浓度为75％，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后的多糖按200～300毫升/克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖疫苗原液；得到三个批次的疫苗原液。
将实施例1和对照组的疫苗原液进行适当的稀释，并对所有稀释后的疫苗产品进行检测，检测内容按照药典中伤寒VI多糖原液中蛋白含量、核酸含量。
表1：对照组疫苗原液检测结果
表2：实施例1疫苗原液检测结果
| 蛋白含量 | 核酸含量 | O-乙酰基含量 | 回收率 | |
| 药典标准 | <10 | <20 | >2.0 | >50％ |
| 201301 | 2.9 | 6.2 | 3.5 | 78％ |
| 201302 | 2.3 | 6.1 | 3.8 | 80％ |
| 201303 | 2.8 | 5.9 | 3.5 | 81％ |
| 平均值 | 2.67 | 6.07 | 36 | 79.7％ |
有表1和表2可以看出，本发明的方法对疫苗原液的各个检测指标的含量与传统技术相比，不具有明显的显著性差异，但是本发明的回收率远远高于对照组的回收率，两者之间具有显著性差异。
成品检定对经本发明工艺制备的3批成品依照药典中伤寒Vi多糖疫苗规程中方法进行鉴别试验、外观检查、pH值、多糖含量、无菌试验、热原检查、异常毒性检查、多糖分子大小各项检定。
对实施例1中的三个疫苗成品在0月、6月、12月、18月和24月时分别检测其pH值、多糖含量和热原检测。
表3：实施例1的疫苗检测结果
其余热原检测、无菌试验和异常毒性检测均符合药典规定。
Claims (3)
1.一种伤寒多糖疫苗的制备方法，包括以下步骤：
A、将培养液离心去除菌体后收集上清液；
B、向上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液至终浓度为0.1％～0.2％，混匀，于2℃～8℃条件下存放24小时，使混合溶液形成沉淀；
C、将沉淀物离心处理，使用0.7mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌后使多糖与十二烷基硫酸钠解离；
D、向解离液中加入95％乙醇至乙醇终浓度为20％，于2～8℃存放24小时，离心收集上清液；
E、将上清液过滤，并在滤液中加入95％的乙醇至乙醇终浓度为75％，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后的多糖按200～300毫升/克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖疫苗原液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤B中，十二烷基硫酸钠溶液在总溶液中的质量分数为0.13％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：还包括将多糖疫苗原液中加入稳定剂和冻干剂制成疫苗冻干粉的步骤。
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