CN104436172B - 一种新的哮喘动物模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域,具体涉及一种新的哮喘动物模型的制备方法。本发明所述哮喘动物模型的制备方法操作简单,不需要麻醉。采用本发明所述制备方法得到的哮喘动物模型,动物反应性好,适合研究包括哮喘的速发相及迟发相在内的哮喘发作整个反应过程,可用于筛选发现新的治疗哮喘的药物等研究。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种新的哮喘动物模型的制备方法及利用所述模型筛选药物的方法。
背景技术
哮喘是指一种常见气道的过敏性、炎症性疾病,全称过敏性哮喘或变应性哮喘。主要特征是多变和复发的症状、可逆性气流阻塞,和支气管痉挛。常见症状表现为喘息、咳嗽、胸部发紧、胸闷和气短。如果病情长期得不到有效控制,可以出现气道重塑,引起不可逆性气道缩窄。全球范围内的哮喘发病率在20世纪60年代和2008年之间大幅增长,并自20世纪70年代被认为是主要的公众健康问题。从20世界90年代开始,哮喘的发病率在发达国家趋于平稳,而在发展中国家快速增长。哮喘影响了美国大约7%的人口,影响了英国大约5%的人口。加拿大、澳大利亚和新西兰的发病率在14%~15%。截至2011年,世界上至少有3亿人患有哮喘,大约有25万人因哮喘而死。不同国家的哮喘发病率不同,一般在1%~18%之间。我国成人目前哮喘的发病率估计在2%左右。儿童发病情况比成人更高。中国人口基数大,因此即使只有2%,发病的绝对数目也是很大的。
过敏性哮喘发作前有先兆症状如打喷嚏、流涕、咳嗽、胸闷等,如不及时处理,可因支气管阻塞加重而出现哮喘。过敏哮喘发作严重者可被迫采取坐位或呈端坐呼吸,干咳或咯大量白色泡沫痰,甚至出现紫绀等,部分较轻的患者可自行恢复,但多数患者尤其是儿童患者需要用药或住院治疗达到缓解。临床上给患者做支气管特异性致敏原吸入激发试验发现患者在发作缓解一至数小时后可再次发作。典型的人类哮喘患者通过激发试验发现,其哮喘的发作从时间上划分,可见到速发相反应和迟发相反应。速发相反应是指吸入致敏原后立即或数分钟后出现喘息、胸闷等哮喘反应的表现,一般持续1到2小时,症状缓解。迟发相反应是指速发相以后1至数小时可能再次出现哮喘发作,一般持续时间比速发相更长,可达6-8小时或更长。症状一般会更严重。速发相反应一般认为是致敏原吸入后和支气管粘膜肥大细胞表面受体上的特异性IgE结合,导致肥大细胞脱颗粒释放活性物质如组织胺、白三烯等引起支气管平滑肌收缩所致。所以这个时间段的反应发生的迅速。也由于这些活性物质代谢分解很快,所以很快就消退了。肥大细胞同时也释放具有趋化活性的物质,促使炎症细胞主要是嗜酸性白细胞聚集到肺部支气管参与过敏性炎症过程,这个过程继速发相反应之后发生,持续时间可达数小时或十几小时,个别可能更久,称为迟发相反应。研究发现,速发和迟发相反应可以在一个患者哮喘时相继出现,也可能只观测到其中的一相。
近几十年,肾上腺糖皮质激素是治疗哮喘(尤其是过敏性哮喘)最常用的治疗药物,但此类药物有很大的副作用。因此研究人员一直试图发现有理想疗效且没有或较少副作用的治疗药物。这就需要有理想的动物模型模拟患哮喘的病人来进行药物评价和机理研究。
目前比较常用的动物模型有两种。第一种是经典的模型,是将过敏原致敏的动物麻醉后进行气道阻力测定,但是由于动物麻醉后已经不是正常动物,其反应性不好,一般只能观察哮喘的前期变化及哮喘的速发反应相,难以观察哮喘发作后期的迟发相,而且动物处于麻醉状态,迷走神经受到抑制,支气管痉挛会减弱,不能真实反映支气管痉挛程度。第二种是气道高反应性模型,此模型主要是针对哮喘发作后气道仍有炎症,通过炎症条件下气道呈现过度敏感的状态这个情况去研究,虽然是可以在动物非麻醉状态下进行实验,但是气道高反应性模型是在哮喘发作过后再来观察,已经错过了哮喘发作过程,并且非哮喘疾病如支气管炎、慢性阻塞性肺疾病等也可以有气道高反应性,所以气道高反应性模型不是哮喘的特异性的模型。而动物模型哮喘的发作情况越接近人类的哮喘发作情况可能越有实用价值。比如处于清醒状态下的哮喘发作,可以观测到速发和迟发双相反应等。迄今为止在啮齿类动物哮喘模型中未见这样的报告。本模型弥补了以往哮喘动物模型的不足,更加贴近了对人类患者进行哮喘激发试验的情况,即清醒状态下纪录,并可以进行哮喘发作的全程记录,观测到除速发相反应外的迟发相反应。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种新的哮喘动物模型的制备方法。本发明所述制备方法制备的哮喘动物模型不需要麻醉、可以观察哮喘发作整个反应过程。
为实现本发明的目的,本发明采用如下技术方案:
一种新的哮喘动物模型的制备方法,
取卵蛋白和氢氧化铝混合加生理盐水制成致敏液,其中所述致敏液中所述卵蛋白的含量为25mg/mL,所述氢氧化铝的含量为250mg/mL;
在大鼠皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第5天重复皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第37天给予大鼠5%卵蛋白-生理盐水溶液,雾化吸入10分钟激发哮喘,雾化结束后立即放入无创性全身体积描记检测仪中记录数据16-20小时,分析数据可见动物哮喘发作出现速发相反应和迟发相或单相反应直至发作消退,即得哮喘动物模型。
本发明所述哮喘动物模型的制备方法不需要对动物进行麻醉,动物反应性好,适合观察哮喘发作整个反应过程。
目前用于制备哮喘动物模型的动物主要为大鼠。其中,在一些实施方案中,本发明所述大鼠为6~8周近交系挪威褐鼠。
本发明所述哮喘是指过敏性哮喘。
本发明所述卵蛋白是指白蛋白又称清蛋白。本发明所述卵蛋白是指鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)。
在一些实施方案中,卵蛋白也可以被其他抗原及半抗原,如尘螨、霉菌、花粉、小分子化合物等替代,用来致敏动物。
进一步的,在一些实施方案中,所述致敏液中的卵蛋白的纯度≥98%。
在一些实施方案中,所述5%卵蛋白-生理盐水溶液的卵蛋白的纯度≥98%。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的哮喘动物模型。
本发明还提供了一种筛选治疗哮喘的新药物的方法,包括以下步骤:
a、设置待测药物组、生理盐水对照组和正常对照组,其中待测药物组和生理盐水对照组以卵蛋白注射致敏用卵蛋白液雾化激发哮喘制备哮喘动物模型,正常对照组以生理盐水注射并用生理盐水雾化吸入激发,然后分别采用无创性全身体积描记检测仪全程记录待测药物组、生理盐水对照组和正常对照组数据16-20小时;
b、待测药物组雾化吸入待测药物,每日一小时,共14日;生理盐水对照组和正常对照组雾化吸入生理盐水,每日一小时,共14日;第15日三组分别吸入卵蛋白激发哮喘,采用无创性全身体积描记检测仪全程记录16-20小时;
c、分析步骤a和步骤b记录的数据对药物的治疗效果进行评价。
其中,所述待测药物在卵蛋白致敏制备哮喘动物模型后给予。
本发明所述方法中所述待测药物给予可以采用注射、口服或吸入的方式。
在一些实施方案中,所述哮喘动物模型的制备方法具体为取卵蛋白和氢氧化铝混合加生理盐水制成致敏液,其中所述致敏液中所述卵蛋白的含量为25mg/mL,所述氢氧化铝的含量为250mg/mL;
在大鼠皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第5天重复皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第37天给予大鼠5%卵蛋白-生理盐水溶液,雾化吸入10分钟激发哮喘,雾化结束后立即放入无创性全身体积描记检测仪中记录数据16-20小时,分析数据可见动物哮喘发作出现速发相反应和迟发相或单相反应直至发作消退,即得哮喘动物模型。
本发明所述筛选治疗哮喘的药物的方法采用无创性全身体积描记检测仪记录待测药物组、生理盐水对照组及正常对照组,包括哮喘的速发相及迟发相的哮喘发作整个反应过程的数据,以评价药物对哮喘的治疗效果,筛选发现能够治疗哮喘的药物。
其中,在一些实施方案中,所述无创性全身体积描记检测仪是由美国Buxco公司制造的
卵蛋白作为过敏原激发致敏大鼠后30至60分钟内为哮喘的速发相,而从激发后1至2小时开始,往后为哮喘发作的迟发阶段,一般持续数小时或更长,可达十几小时,偶见超过20小时的。因此,本发明所述筛选治疗哮喘的新药物的方法中所述记录时间为16-20小时。
在一些实施方案中,本发明所述筛选治疗哮喘的新药物的方法中所述分析步骤a和步骤b记录的数据具体为分别比较正常对照组、生理盐水对照组和待测药物组步骤a和步骤b记录的数据:
若正常对照组步骤a和步骤b记录的数据均没有升高,而生理盐水对照组步骤a和步骤b记录的数据均有升高,出现速发相和迟发相反应或出现速发相与迟发相中的任意一相即表示哮喘动物模型制备成功;
若待测药物组步骤b记录的数据较步骤a记录的数据受到抑制,即表示待测药物有治疗哮喘的作用。
由上述技术方案可知,本发明提供了一种新的哮喘动物模型的制备方法及一种筛选治疗哮喘的药物的方法。本发明所述哮喘动物模型的制备方法操作简单,不需要麻醉。采用本发明所述制备方法制备得到的哮喘动物模型,动物反应性好,适合特异性的观察包括哮喘的速发相及哮喘的迟发相在内的哮喘发作整个反应过程。采用本发明所述制备方法制备得到的哮喘动物模型去试验治疗哮喘的药物可以全面的观察药物对哮喘发作全过程的影响,弥补现有模型的不足。本发明所述筛选治疗哮喘的药物的方法可实现在动物不麻醉的清醒状态下,连续观察药物对哮喘速发相、迟发相的影响。由于速发和迟发这两相的机理不同,通常一种药物可能只对速发相有效,另一种药物可能只对迟发相有效,本发明所述筛选治疗哮喘的药物的方法,可更广泛的筛选获得对哮喘速发相或哮喘迟发相有效的治疗哮喘的药物,同时还可间接观察反映支气管痉挛程度和气道阻力的变化,进而全面考察药物对哮喘发作全过程的影响,为哮喘发病机理研究、筛选治疗哮喘的药物提供一种新途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1无创性全身体积描记检测仪对制备的哮喘动物模型连续记录16小时的检测图;其中横坐标为时间,单位为小时,纵坐标为呼气相延长参数(Enhanced Pause,Penh);
图2示实施例1无创性全身体积描记检测仪对正常的6~8周挪威褐鼠连续记录16小时的检测图;其中横坐标为时间,单位为小时,纵坐标为呼气相延长参数(EnhancedPause,Penh);
图3示实施例2大鼠哮喘发作后肺部HE染色图,嗜酸性白细胞浸润明显;
图4示实施例2大鼠哮喘发作后肺部HE染色图,其中,箭头所指的为粘液;
图5示实施例3待测药物组雾化吸入地塞米松前与吸入地塞米松后的对比图;其中图5a为吸入前,图5b为吸入后,横坐标为时间,单位为小时,纵坐标为呼气相延长参数(Enhanced Pause,Penh);吸入地塞米松前后对比显示地塞米松可抑制哮喘发作;
图6示实施例3生理盐水对照组雾化吸入生理盐水前与吸入生理盐水后的对比图;其中图6a为吸入前,图6b为吸入后,横坐标为时间,单位为小时,纵坐标为呼气相延长参数(Enhanced Pause,Penh);吸入生理盐水前后对比显示生理盐水对哮喘没有治疗作用;
图7示实施例3正常对照组雾化吸入生理盐水前与吸入生理盐水后的对比图;其中图7a为吸入前,图7b为吸入后,横坐标为时间,单位为小时,纵坐标为呼气相延长参数(Enhanced Pause,Penh);吸入前后对比显示没有致敏的动物无哮喘发作,吸入生理盐水没有影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。如无特别说明,本发明所使用的实验材料均为市售产品,可通过商业渠道购买得到。
实施例1、哮喘动物模型的制备
实验材料:卵蛋白(购自美国Sigma-Aldrich公司),氢氧化铝干粉(购自美国Sigma-Aldrich公司),生理盐水、6~8周挪威褐鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)
制备方法:
1、取25mg卵蛋白和250mg氢氧化铝干粉混合加入1mL生理盐水制成致敏液;
2、取0.5mg卵蛋白加入10mL生理盐水制成5%卵蛋白-生理盐水溶液10mL;
3、取6~8周挪威褐鼠,在大鼠皮下分两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
4、第5天重复在大鼠皮下分两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
5、第37天给予大鼠5%卵蛋白-生理盐水溶液,雾化吸入10分钟激发哮喘,雾化结束后立即放入无创性全身体积描记检测仪中记录数据16-20小时,分析数据可见动物哮喘发作出现速发相反应和迟发相或单相反应直至发作消退,即得哮喘动物模型。
采用无创性全身体积描记检测仪分别对制备的哮喘动物模型和正常的6~8周挪威褐鼠连续记录16小时。结果见图1和图2。
由图1结果可见制备的哮喘动物模型在卵蛋白激发后出现了包括哮喘速发反应相和迟发反应相直至消退的哮喘发作的全过程。速发反应相发生在激发后的前一个小时(横坐标120处)。一个小时后逐渐发生的是迟发反应相,持续约5个小时(横坐标600处)后回落到正常,反应强度也比速发相大。而图2结果显示对照组正常动物,无哮喘发作,无速发、迟发相。
实施例2、哮喘动物模型鉴定
动物在给予卵蛋白致敏注射前以及注射后第7、14、21、28和35天分别取血检测特异性IgE。结果显示从第14天开始出现IgE,28天时达到峰值。
激发哮喘发作后24小时,动物取肺经HE染色光学显微镜下观察,见嗜酸性白细胞浸润,支气管和肺泡空腔内可见粘液分泌增加,有灶性出血,符合过敏性支气管哮喘发作炎症性变化,结果见图3、4。
实施例3、筛选治疗哮喘的药物的方法
实验材料:6~8周近交系挪威褐鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),地塞米松磷酸钠注射液(购自:天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司)。
取6~8周近交系挪威褐鼠分三组:生理盐水对照组、正常对照组、待测药物组,按照实施例1的方法生理盐水对照组和待测药物组以卵蛋白注射致敏,用卵蛋白液雾化激发哮喘;正常对照组以生理盐水注射,并用生理盐水雾化吸入激发,然后均采用无创性全身体积描记检测仪全程记录16-20小时,待测药物组结果见图5a,生理盐水对照组结果见图6a,正常对照组结果见7a。然后待测药物组雾化吸入地塞米松0.5mg/mL,每日一小时,共14日,生理盐水对照组和正常对照组雾化吸入生理盐水每日一小时,共14日。第15日三组分别吸入卵蛋白激发哮喘,采用无创性全身体积描记检测仪全程记录16-20小时,待测药物组结果见图5b,生理盐水对照组结果见图6b,正常对照组结果见图7b。
由图7a和图7b可见正常对照组无哮喘发作,图6a和图6b可见生理盐水对照组在给予生理盐水前后均有哮喘发作,以上表明哮喘动物造模成功。由图5a和图5b待测药物组给药前后的自身对照及与生理盐水对照组的比较,可见吸入地塞米松后动物哮喘发作程度受到抑制。
Claims (6)
1.一种哮喘动物模型的制备方法,
取卵蛋白和氢氧化铝混合加生理盐水制成致敏液,其中所述致敏液中卵蛋白的含量为25mg/mL,所述氢氧化铝的含量为250mg/mL;
在大鼠皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第5天重复皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第37天给予大鼠5%卵蛋白-生理盐水溶液,雾化吸入10分钟激发哮喘,雾化结束后立即放入无创性全身体积描记检测仪中记录数据16-20小时,分析数据可见动物哮喘发作出现速发相反应和迟发相或单相反应直至发作消退,即得哮喘动物模型;所述大鼠为挪威褐鼠。
2.根据权利要求1所述的方法,所述大鼠为6~8周挪威褐鼠。
3.根据权利要求1所述的方法,所述致敏液中的卵蛋白的纯度≥98%。
4.根据权利要求1所述的方法,所述5%卵蛋白-生理盐水溶液的卵蛋白的纯度≥98%。
5.一种筛选治疗哮喘的药物的方法,包括以下步骤:
a、设置待测药物组、生理盐水对照组和正常对照组,其中待测药物组和生理盐水对照组以卵蛋白注射致敏用卵蛋白液雾化激发哮喘制备哮喘动物模型,正常对照组以生理盐水注射并用生理盐水雾化吸入激发,然后分别采用无创性全身体积描记检测仪全程记录待测药物组、生理盐水对照组和正常对照组数据16-20小时;
b、待测药物组雾化吸入待测药物,每日一小时,共14日;生理盐水对照组和正常对照组雾化吸入生理盐水,每日一小时,共14日;第15日三组分别吸入卵蛋白激发哮喘,采用无创性全身体积描记检测仪全程记录16-20小时;
c、分析步骤a和步骤b记录的数据对药物的治疗效果进行评价;所述哮喘动物模型的制备方法具体为:
取卵蛋白和氢氧化铝混合加生理盐水制成致敏液,其中所述致敏液中卵蛋白的含量为25mg/mL,所述氢氧化铝的含量为250mg/mL;
在大鼠皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第5天重复皮下两点注射所述致敏液,每点0.2ml;
第37天给予大鼠5%卵蛋白-生理盐水溶液,雾化吸入10分钟激发哮喘,雾化结束后立即放入无创性全身体积描记检测仪中记录数据16-20小时,分析数据可见动物哮喘发作出现速发相反应和迟发相或单相反应直至发作消退,即得哮喘动物模型。
6.根据权利要求5所述的方法,所述分析步骤a和步骤b记录的数据具体为分别比较正常对照组、生理盐水对照组和待测药物组步骤a和步骤b记录的数据:
若正常对照组步骤a和步骤b记录的数据均没有升高,而生理盐水对照组步骤a和步骤b记录的数据均有升高,出现速发相和迟发相反应或出现速发相与迟发相中的任意一相即表示哮喘动物模型制备成功;
若待测药物组步骤b记录的数据较步骤a记录的数据受到抑制,即表示待测药物有治疗哮喘的作用。
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