CN104382856A - 一种去氧鬼臼毒素长循环脂质体冻干制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种去氧鬼臼毒素长循环脂质体冻干制剂。所述去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备方法包括将去氧鬼臼毒素、磷脂、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺溶解于有机溶剂，将溶剂驱尽成薄膜后，水化得到脂质体，进一步制成冻干制剂；该冻干制剂可以用于治疗肿瘤，载药包封率在90％以上，复溶后脂质体粒径为95～125nm，复溶后的脂质体溶液25℃可稳定8～24h。

Description

一种去氧鬼臼毒素长循环脂质体冻干制剂
技术领域
本发明涉及一种冻干药物长循环脂质体及其制备方法，特别涉及一种载有去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备方法及其冻干制剂。
背景技术
去氧鬼臼毒素是从木质素类植物中提取纯化得到的化合物，结构式如下：
上世纪九十年代已有实验报道证实：去氧鬼臼毒素对P-388白血病、人肺癌A-549、人体鼻咽癌KB以及结肠癌HT-29的细胞株具有体外抑制作用，以及一定的保肝和抗病毒作用。由于去氧鬼臼毒素不溶于水，微溶于乙醇和乙醚，无法直接用于制备静脉注射的制剂，并且在脂质体制备中很难采用注入法进行制备，限制其在制剂工业和临床上的应用。为了改善其水溶性，增加药效同时降低毒副作用，现有技术中采用了多种方法。
中国专利CN101693112A中公开了一种去氧鬼臼毒素与β-环糊精的包合物；中国专利CN102380104A中公开了一种去氧鬼臼毒素与羟丙基-β-环糊精包合物的改进制备方法；中国专利CN10369051A中公开了一种去氧鬼臼毒素聚合物胶束冻干制剂。以上专利均采用增溶材料解决了去氧鬼臼毒素的水溶性问题，但β-环糊精类化合物可能具有肾毒性及引起胰腺肿瘤的风险，且聚合物胶束的稳定性较弱。
脂质体具有良好的生物相容性，肝、脾网状内皮系统的被动靶向性，可作为抗肿瘤药物的输送载体，是一种提高药物的稳定性、肿瘤靶向性，同时降低药物毒性的给药系统。但由于普通脂质体稳定性不理想，靶向性不高，我们将去氧鬼臼毒素制成长循环脂质体输送至体内，可以增加药物在体循环时间，将药物更好的被动靶向至肿瘤部位，提高药物的抗肿瘤作用，降低其毒性反应。
发明内容
为了提高去氧鬼臼毒素水中溶解度、稳定性和体内靶向性，便于制成肿瘤治疗的药物制剂，我们使用脂质体作为药物载体，制备成载有去氧鬼臼毒素的脂质体。
本发明提供了一种去氧鬼臼毒素的长循环脂质体，所述长循环脂质体含有药物活性成分去氧鬼臼毒素、载体材料磷脂、胆固醇及聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，其质量比为1∶(5～20)∶(1～2)∶(0.5～2)。
作为优选，所述长循环脂质体粒径95～125nm，载药包封率90％以上。作为优选，
所选磷脂选自天然卵磷脂、大豆磷脂、合成磷脂中一种或几种的混合。本发明还提
供了所述长循环脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去氧鬼臼毒素和磷脂，胆固醇及聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于有机溶剂；
(2)将有机溶剂驱尽形成薄膜；
(3)向薄膜中加入水或冻干保护剂的水溶液，必要时加热水化，得到载有去氧鬼臼毒素的长循环脂质体溶液，冷冻干燥得去氧鬼臼毒素长循环脂质体冻干粉。
作为优选，所述步骤(1)中的有机溶剂选自：乙醇、乙腈、甲醇、二氯甲烷、氯仿中一种或几种的混合。
作为优选，所述步骤(3)中的冻干保护剂选自：甘露醇、海藻糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、葡聚糖中一种或几种的混合。
作为优选，所述步骤(3)中的加热温度为20～40℃。
本发明经过筛选发现，将去氧鬼臼毒素制备成长循环脂质体包封率较高，且具有良好的水溶性，稳定性，复溶性，可以制备成供静脉注射、或肌肉注射、或口服给药、或透皮给药的冻干药物制剂。
附图说明
图1去氧鬼臼毒素长循环脂质体的粒径分布图
图2去氧鬼臼毒素长循环脂质体透射电镜图
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步说明，但需要指出的是，以下实施例不能构成对本发明的任何限制。
实施例1
组方：
去氧鬼臼毒素9mg、大豆磷脂50mg、胆固醇10mg、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺5mg
制备方法：
将去氧鬼臼毒素和大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入水30ml，于20℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，获得具乳光脂质体溶液。
实施例2
组方：
去氧鬼臼毒素9mg、大豆磷脂200mg、胆固醇20mg、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺20mg
制备方法：
将去氧鬼臼毒素和大豆磷脂，胆固醇，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入水30ml，于40℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，获得具乳光脂质体溶液。
实施例3不含冻干保护剂的去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备
组方：
去氧鬼臼毒素9mg、大豆磷脂108mg、胆固醇12mg、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺6.5mg
制备方法：
将去氧鬼臼毒素和大豆磷脂，胆固醇，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入水30ml，于40℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，获得具乳光脂质体溶液，用0.22μm滤膜过滤，滤液按每瓶10ml分装于西林瓶中，冻干，得到白色疏松粉末。
实施例4以海藻糖为冻干保护剂的去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备
将去氧鬼臼毒素9mg和大豆磷脂108mg，胆固醇12mg，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺6.5mg置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入含8.3mg/ml海藻糖水溶液30ml，于40℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，得到具乳光脂质体溶液，用0.22μm滤膜过滤，滤液按每瓶10ml分装于西林瓶中，冻干，得到白色疏松粉末。
1、复溶时间及粒径稳定性考察
取实施例4冻干制剂1瓶，加生理盐水10ml复溶，测定冻干粉复溶至澄明脂质体溶液所需的时间约为1.5min。采用动态光散射法测定其粒径，散射角为90°，数据以球形模型采集。将复溶后的脂质体溶液置25℃水浴放置，监测48h内粒径变化，以考察脂质体动力学稳定性。测得脂质体粒径105.0nm(图1)，可稳定存放约24h。而实施例3不加保护剂的去氧鬼臼毒素长循环脂质体冻干制剂复溶困难，溶液浑浊无乳光，测得粒径487.4nm，且复溶后极不稳定。
2、形态学观察
取实施例4冻干制剂以水复溶至去氧鬼臼毒素的浓度为1mg/ml，并稀释至10μg/ml。取该溶液1滴滴于铜网上，静置10min后用滤纸片吸干，再滴加2.0％(w/w)磷钨酸溶液于铜网上负染1min，自然挥干，用透射电子显微镜观察形态并摄制照片。结果由附图2可见，长循环脂质体呈球形或类球形。
3、含量及包封率测定
3.1色谱条件
色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(45∶55)；检测波长：220nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；进样体积：20μl。
3.2线性关系考察
精密称取去氧鬼臼毒素标准品适量，置20ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得质量浓度为1mg/ml的去氧鬼臼毒素对照品储备液。分别精密量取储备液适量于10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，得浓度分别为1.0、10.0、20.0、20.0、30.0、50.0、100.0μg/ml的系列对照品溶液，按3.1项下去氧鬼臼毒素色谱条件测定，以峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归，得回归方程A＝76156C+67883(r2＝1)，表明去氧鬼臼毒素在1.0～100.0μg/ml内峰面积与药物浓度呈良好的线性关系。
3.3包封率和载药量测定
取实施例4冻干制剂以生理盐水复溶至去氧鬼臼毒素的浓度为1mg/ml，置于具塞离心管中，10000r/min离心15min，取上清液1ml于10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液按3.1项下色谱条件分别测定游离去氧鬼臼毒素的含量；另取实施例4冻干制剂以生理盐水复溶混悬液1ml于10ml容量瓶中，用乙腈破乳并稀释至刻度，经0.22μm微孔滤膜滤过，续滤液按3.1项下色谱条件分别测定去氧鬼臼毒素长循环脂质体中总的去氧鬼臼毒素含量；按下列公式分别计算脂质体中去氧鬼臼毒素的包封率(EE％)和载药量(DL％)。
EE％＝(W0-W1)/W0×100％
DL％＝(W0-W1)/Wt×100％
其中，W0为去氧鬼臼毒素长循环脂质体中的总药物量；W1为脂质体中的游离药物量；Wt：去氧鬼臼毒素长循环脂质体的总重量。
测得实施例4冻干制剂载药量为6.15％，包封率为92.6％。
实施例5以乳糖为冻干保护剂的去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备及物理性质
将去氧鬼臼毒素9mg和大豆磷脂108mg，胆固醇12mg，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺6.5mg置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入含16.7mg/ml乳糖水溶液30ml，于40℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，得到具乳光脂质体溶液，用0.22μm滤膜过滤，滤液按每瓶10ml分装于西林瓶中，冻干，得到白色疏松粉末。加入10ml生理盐水复溶，得到具乳光脂质体溶液，复溶时间约2min，高效液相色谱法法测定去氧鬼臼毒素脂质体的包封率为90.3％，载药量为6％，粒径122.8nm，可稳定约16h。
实施例6以蔗糖为冻干保护剂的去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备及物理性质
将去氧鬼臼毒素9mg和大豆磷脂108mg，胆固醇12mg，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺6.5mg置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入含16.7mg/ml蔗糖水溶液30ml，于40℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，得到具乳光脂质体溶液，用0.22μm滤膜过滤，滤液按每瓶10ml分装于西林瓶中，冻干，得到白色疏松粉末。加入10ml生理盐水复溶，得到具乳光脂质体溶液，复溶时间约2min，高效液相色谱法法测定去氧鬼臼毒素脂质体的包封率为96.7％，载药量6.42％，粒径95.3nm，可稳定约12h。
实施例7以山梨醇为冻干保护剂的去氧鬼臼毒素长循环脂质体的制备及物理性质
将去氧鬼臼毒素9mg和大豆磷脂108mg，胆固醇12mg，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺6.5mg置于茄形瓶，加入三氯甲烷20ml使完全溶解，于40℃水浴加热减压蒸发至三氯甲烷驱尽，呈透明薄膜状附于瓶底，加入含8.3mg/ml山梨醇水溶液30ml，于40℃水浴加热，薄膜旋转水化20min，得到具乳光脂质体溶液，用0.22μm滤膜过滤，滤液按每瓶10ml分装于西林瓶中，冻干，得到白色疏松粉末。加入10ml生理盐水复溶，得到具乳光脂质体溶液，复溶时间约1.5min，高效液相色谱法法测定去氧鬼臼毒素脂质体的包封率为90％，载药量为5.97％，粒径107.2nm，可稳定约8h。

Claims (8)

1.一种去氧鬼臼毒素的长循环脂质体，其特征在于，所述长循环脂质体含有药物活性成分去氧鬼臼毒素、载体材料磷脂、胆固醇及聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，其质量比为1∶(5～20)∶(1～2)∶(0.5～2)。
2.一种去氧鬼臼毒素的长循环脂质体，其特征在于，粒径95～125nm，载药包封率90％以上。
3.根据权利求1或2所述的长循环脂质体，其特征在于，所选磷脂选自天然卵磷脂、大豆磷脂、合成磷脂中一种或几种的混合。
4.权利要求1-3所述长循环脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将去氧鬼臼毒素和磷脂、胆固醇及聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于有机溶剂；
(2)将有机溶剂驱尽形成薄膜；
(3)向薄膜中加入水或冻干保护剂的水溶液，必要时加热水化，得到载有去氧鬼臼毒素的长循环脂质体溶液，冷冻干燥得去氧鬼臼毒素长循环脂质体冻干粉。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的有机溶剂选自：
乙醇、乙腈、甲醇、二氯甲烷、氯仿中一种或几种的混合。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的冻干保护剂选自：
甘露醇、海藻糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、葡聚糖中一种或几种的混合。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的加热温度为20～40℃。
8.根据权利要求1-6所述的去氧鬼臼毒素的长循环脂质体，加生理盐水、或磷酸盐缓冲液、或5％葡萄糖溶液溶解，以静脉注射、或肌肉注射、或口服给药、或透皮给药方式用于疾病的治疗。
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