CN102614126A - 一种热敏脂质体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种热敏脂质体，所述脂质体包含至少一种磷脂酰胆碱、至少一种溶血磷脂，以及至少一种不饱和磷脂，所述脂质体的相变温度为39.0℃～45.0℃。其还包含具有长循环特性的材料以及脂溶性活性剂。其中所述的磷脂酰胆碱、溶血磷脂、不饱和磷脂、具有长循环特性的材料的重量比为69-94∶1-6∶1-10∶4-15。其中各种磷脂的重量和与脂溶性活性剂的重量比为30-120∶1-10。本发明还涉及包含所述热敏脂质体的药物组合物。本发明还涉及所述热敏脂质体以及药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物的用途。

Description

一种热敏脂质体及其用途

技术领域

本发明涉及一种热敏脂质体，特别是一种包含脂溶性活性剂的热敏脂质体，以及包含所述热敏脂质体的药物组合物，以及所述热敏脂质体和药物组合物的用途。

背景技术

1978年，Yatvin和Weinstein首次报导了热敏脂质体(Thermosensitive liposomes)。热敏脂质体根据相变温度和释药速度的不同分为两种：传统热敏脂质体(Traditional thermosensitiveliposome，TTSL)，相变温度在43℃-45℃之间，释药需30min以上；低温热敏脂质体(low temperature sensitive liposome，LTSL)，相变温度在39℃-42℃之间，受热数秒内就能释放大量药物。与传统热敏脂质体相比，低温热敏脂质体的靶向性增强，能够增加脂质体在病变部位的聚集；而且通过控释作用，能够增加脂质体释药到病变内部提高疗效。由于低温热敏脂质体具有以上优势，其已成为脂质体靶向研究领域的热点和方向。

低温热敏脂质体又称温度敏感型脂质体是由具有特定相变温度(Phase Temperature，Tc)的磷脂制成。当环境温度低于脂质体的相变温度时，磷脂双分子层呈凝胶态，流动性和通透性均较小，当脂质体受热达到Tc时，组成脂质体膜的磷脂分子运动加强，如：翻转、移动、旋转、摆动等，其磷脂双分子层由胶晶态(gel)转变为疏松混乱的液晶态(liquid crystalline)。此时，相邻的磷脂分子之间距离增加，膜的厚度减小。这种结构的变化导致脂质体膜的流动性和通透性大大增加，短时间内释放内容物到受热部位。应用该原理，设计相变温度稍高于生理温度(39-42℃)的脂质体，可以在生理温度下稳定，而在热处理的肿瘤或炎症病灶部位立即释放药物。

专利WO/2009/059449公开了一种热敏脂质体，所述热敏脂质体中须加入具有单分子链结构的溶血磷脂以提高脂质体膜的热相变敏感度，加速脂质体在相变温度或相变温度以上时的药物释放，通常加入7％-15％的溶血磷脂以达到此效果，但据报导溶血磷脂在此含量范围存在产生溶血毒副作用的风险。同时中国药典明确规定，注射用磷脂中溶血磷脂的含量不得超过磷脂总量的3％。

另一方面，脂溶性药物制成脂质体制剂后，存在于磷脂双分子层中，其稳定性取决于药物与磷脂分子的相互作用。现有技术中通常采用饱和磷脂，对脂质体的载药能力有较大影响，载药量稍高时，容易发生药物渗漏、结晶析出等稳定性问题，限制了脂溶性活性剂在脂质体制剂方面的应用。

针对以上问题，亟需寻找新的处方及工艺，开发符合国家药品规范，溶血磷脂的含量不得超过磷脂总量3％的热敏脂质体，并提高脂溶性活性剂在脂质体制剂方面的应用的效果与脂质体制剂的稳定性。

发明内容

经过研究发现，脂溶性活性剂主要驻留于脂质体的双分子层中的磷脂脂肪疏水区，由于双饱和脂肪链整齐排列的结构并不利于脂溶性活性剂的嵌入，而根据脂溶性活性剂(空间结构)的特点，加入适当比例的不饱和磷脂(不饱和脂肪链是弯曲的)和单脂肪链磷脂，能形成合适的“空隙”，增加两者的亲和性，有利于脂溶性活性剂的嵌入，能够增加载药量并增强脂溶性药物在脂质体膜中的稳定性。因此，进行系统研究，发现根据药物结构的特点，加入合适比例的不饱和磷脂，可以在减少溶血磷脂的含量后，仍能维持脂质体膜的热相变的敏感度，并提高载药效果。在此研究的基础上，发明人发现了一种制备包含脂溶性活性剂的热敏脂质体的新处方，即降低溶血磷脂的含量，同时加入不饱和磷脂，由此完成了本发明。

本发明的一个方面涉及一种热敏脂质体，其包含至少一种磷脂酰胆碱、至少一种溶血磷脂，以及至少一种不饱和磷脂，所述脂质体的相变温度为39.0℃～45.0℃。

所述热敏脂质体还可以包含具有长循环特性的材料。

所述热敏脂质体还可以包含脂溶性活性剂。

其中所述的磷脂酰胆碱、溶血磷脂、不饱和磷脂、具有长循环特性的材料的重量比为69-94∶1-6∶1-10∶4-15；所述重量比例如可以为：

69∶3∶6∶10，68∶3∶6∶10，70∶3∶6∶10，72∶3∶6∶10，

74∶3∶6∶10，75∶3∶6∶10，77∶3∶6∶10，79∶3∶6∶10，

65∶2∶6∶10，68∶2∶6∶10，70∶2∶6∶10，72∶2∶6∶10，

74∶2∶6∶10，75∶2∶6∶10，77∶2∶6∶10，65∶1∶6∶10，

90∶1∶6∶10，70∶1∶6∶10，72∶1∶6∶10，74∶1∶6∶10，

75∶1∶6∶10，77∶1∶6∶10，79∶1∶6∶10，79∶3∶4∶10，

68∶3∶4∶10，70∶3∶4∶10，72∶3∶4∶10，74∶3∶4∶10，

75∶3∶4∶10，77∶3∶4∶10，79∶3∶4∶10，65∶2∶4∶10，

85∶2∶4∶10，70∶2∶4∶10，72∶2∶4∶10，74∶2∶4∶10，

75∶2∶4∶10，77∶2∶4∶10，75∶1∶4∶10，80∶1∶4∶10，

70∶1∶4∶10，72∶1∶4∶10，74∶1∶4∶10，75∶1∶4∶10，

77∶1∶4∶10，79∶1∶4∶10。

在本发明的一个实施方案中，所述重量比为81∶3∶6∶10。在本发明的另一个实施方案中，所述重量比为82∶2∶6∶10。

所述的磷脂酰胆碱、溶血磷脂、不饱和磷脂和具有长循环特性的材料的重量和与脂溶性活性剂的重量比为30-120∶1-10，例如可以为35∶2，40∶2，45∶2，47∶2，50∶2，55∶2，60∶2，65∶2，70∶2，75∶2，80∶2，85∶2，90∶2，95∶2，100∶2，105∶2，110∶2，120∶2。

在本发明的一个实施方案中，所述重量比为100∶2。在本发明的另一个实施方案中，所述重量比为94∶4。

在本发明中，所述的磷脂酰胆碱包括但不限于二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，氢化大豆磷脂(HSPC)，氢化卵磷脂(HEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1-豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)等在25-70℃之间具有相变特性的饱和双分子链结构的胆碱类磷脂。

在本发明中，所述的溶血磷脂包括但不限于单豆蔻酰磷脂酰胆碱、单硬脂酰磷脂酰胆碱(MSPC)、单棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)等具有饱和单分子链结构的磷脂。

在本发明中，所述的不饱和磷脂包括但不限于蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、心磷脂等具有不饱和双分子链结构的磷脂。

在本发明中，所述的具有长循环特性的材料是指能够赋于脂质体在生物体内逃避网状内皮系统清除特性的材料，主要指分子量较大且具有亲水性或亲水基团的材料，该类材料可以在载体材料表面交错覆盖成致密的构象云，形成较厚的立体位阻层，阻碍了网状内皮系统的作用，或由于其亲水性而增强载体的溶剂化作用，有效阻止其表面的调理作用，降低MPS对其的亲和力，从而降低与单核吞噬细胞系统MPS的亲和力，可在循环系统中稳定存在并使半衰期延长。例如可以为聚乙二醇化的磷脂、神经节苷脂、非离子型表面活性剂或聚合物等。

在本发明中，所述具有长循环特性的材料包括但不限于平均分子量为2000的聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE-PEG2000)、平均分子量为5000的聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE-PEG5000)、平均分子量为2000的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、平均分子量为2000的聚乙二醇-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE-PEG2000)等不同分子量聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺类磷脂、神经节苷脂、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、吐温、泊洛沙姆等。

在本发明的实施方案中，所述磷脂酰胆碱为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC )。

在本发明的实施方案中，所述溶血磷脂为单硬脂酰磷脂酰胆碱(MSPC)。

在本发明的实施方案中，所述不饱和磷脂为蛋黄卵磷脂(EPC)或二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)。

在本发明的实施方案中，所述具有长循环特性的材料为平均分子量为2000的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。

在本发明中，其中所述的脂溶性活性剂可以为脂溶性的治疗剂、显像剂、诊断剂或它们的组合。所述的脂溶性活性剂为至少一种。

在本发明的实施方案中，所述脂溶性活性剂为脂溶性的抗癌剂。其它活性剂包括但不限于脂溶性的抗生素、抗真菌剂、免疫抑制剂、抗病毒剂等。

在本发明中，所述抗癌剂选自脂溶性的烷化剂、抗代谢剂、纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒性抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体或其片段、光敏剂、激酶抑制剂、抗肿瘤酶和酶的抑制剂、细胞凋亡诱导剂、抗激素、类视黄醇和含铂化合物。

例如所述脂溶性的抗癌剂为紫杉醇或其类似物(如多西紫杉醇)、鬼臼毒素、埃坡霉素等。

在本发明的实施方案中，所述脂溶性的抗癌剂为紫杉醇、多西紫杉醇或鬼臼毒素。

在本发明中，所述热敏脂质体的粒径为80～200nm。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其含有本发明任一项所述的热敏脂质体。所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

本发明的再一方面涉及本发明的热敏脂质体或药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤为肺癌。

本发明的热敏脂质体可以使用任何适当的途径向受试者给药，例如，静脉内给药、动脉内给药、肌肉给药、腹膜内给药、皮下给药、关节内给药、鞘内给药、侧脑室内给药、鼻腔喷雾、肺吸入，口服给药以及本领域技术人员已知的其它适合的给药途径。可以利用本发明的方法治疗的组织包括但不限于，鼻、肺、肝、肾、骨骼、软组织、肌肉、肾上腺组织和乳房。可以被加热到39.5℃以上温度的任何组织或体液都可以用本发明的脂质体治疗。

本领域技术人员很容易确定利用本发明的热敏脂质体向受试者给予活性剂的剂量。如本领域所知的，活性剂的剂量可以依据包含在载体中的活性剂来调整。

在给予本发明的热敏脂质体之前和/或期间和/或之后，可以加热受试者的靶组织。在本发明的一个实施方案中，将本发明的热敏脂质体递送给受试者，在给药后尽可能快地加热靶组织。

可以使用任何适合的方式加热靶组织，例如，利用射频辐射，利用可以是高强度聚焦超声的超声，利用微波辐射，产生红外辐射的任何来源：如温水浴、光以及外部或内部应用的辐射，如由放射性同位素、电场和磁场产生的辐射，和/或以上的组合。

发明的有益效果

本发明优化了现有技术中包含脂溶性活性剂的热敏脂质体的处方，加入了不饱和磷脂，显著降低了溶血磷脂的含量，提高了脂溶性药物的载药能力，增加了脂质体中药物的稳定性。所得脂质体具有良好的热相变的敏感度，且溶血毒副作用减小，性质更稳定，包封率大于95％，且活性确实，具有良好的应用前景。

此外，现有技术中通常要求处方中至少含有一种磷脂酰甘油类磷脂以提高脂质体的稳定性，而在本发明中不需要加此类磷脂同样可以实现热敏脂质体的特性和稳定性，简化了处方。

附图说明

图1紫杉醇长循环热敏脂质体的差示扫描量热(DSC)图。

其中曲线A为实施例1中制备的长循环热敏脂质体；曲线B为调整了磷脂比例的长循环热敏脂质体(100ml脂质体的含量为DPPC 8.1g，DSPE-PEG2000 1.0g，DOPC 0.6g，MSPC 0.3g)。

图2紫杉醇长循环热敏脂质体体内热敏试验图，其中横坐标表示不同的剂型，纵坐标表示紫杉醇在肌肉内的累积量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，或参照《微载体药物递送系统》(梅兴国编，2009年11月1日出版，华中科技大学出版社)。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1紫杉醇长循环热敏脂质体的制备

(1)材料及用量：(100ml脂质体的用量)

(2)制备方法：

按以上用量称取各种磷脂和药物，溶于氯仿，50～60℃下旋转蒸发除去有机溶剂，得到干燥、均匀附着在玻璃瓶底的膜。用含乳糖磷酸盐缓冲液水化后得到多层脂质体溶液。挤压过聚碳酸酯膜，先过孔径为200nm的聚碳酸酯膜，再过孔径为100nm的聚碳酸酯膜。测定粒径为110nm，脂质体溶液呈透明蓝色乳光，且流动性好。

实施例2紫杉醇长循环热敏脂质体的包封率测定

取实施例1制备的紫杉醇长循环热敏脂质体1ml于1.5mlEP管中，8000r/min，离心8min。取上清0.2ml于10ml容量瓶中，用甲醇溶液破膜定容后，HPLC进样分析，得载入脂质体中的紫杉醇药物含量(C1)；另取未离心的紫杉醇长循环热敏脂质体样品0.2ml于10ml容量瓶中，用甲醇溶液破膜定容后，HPLC进样分析，得紫杉醇长循环热敏脂质体混悬液中紫杉醇的总药物含量(C2)。包封率(E)＝C1/C2＊100％。结果表明紫杉醇长循环热敏脂质体的包封率为99.2％。

实施例3紫杉醇长循环热敏脂质体的相变温度测定

采用差示扫描量热法(DSC)测定本发明实施例1中制备的紫杉醇长循环热敏脂质体的相变温度。将长循环热敏脂质体稀释至磷脂浓度约为20mg/ml，吸取10μl于铝盘中，30-50℃范围扫描，扫描速度2℃/min。测得脂质体的相变温度在42.24℃左右(如图1中曲线A)，相变明显且相变温度变化范围较窄。调整磷脂的比例，相变温度就可在39-45℃之间变动，如图1中曲线B(100ml脂质体的含量为DPPC 7.5g，DSPE-PEG2000 0.6g，DOPC 0.6g，MSPC 0.3g)，相变温度为41.6℃。

实施例4紫杉醇长循环热敏脂质体体内热敏研究

将昆明小鼠随机分为三组，即普通注射液组(PTX，紫杉醇市售注射液)、普通脂质体组(PL，将实施例1中的DPPC换成同重量的EPC制备的脂质体)和本发明中实施例1的长循环热敏脂质体(PTL)组。分别尾静脉给药后立即将各小鼠的右前腿置于43℃的水浴上加热，未加热左前腿作为自身对照，加热30min后分别测定加热和不加热的小鼠腿部肌肉药物累积量(见图2)。

由图2结果可知，注射液组、普通脂质体组和长循环热敏脂质体组未加热部位中的紫杉醇的含量没有明显差异；注射液组和普通脂质体组加热部位的药物含量与未加热部位相比并没有明显增加，而长循环热敏脂质体组加热部位中的药物含量比未加热部位增加了近1倍，显著提高了加热部位的药物含量。因此，本发明的长循环热敏脂质体具有明显的热敏释药性。

实施例5紫杉醇长循环热敏脂质体的室温放置稳定性

紫杉醇在水中不溶，制备成脂质体后如果有药物渗漏，脂质体溶液中就会有药物晶体析出，因此可以通过观察晶体析出的方式考察样品的室温放置稳定性。取实施例1中样品和未加EPC的脂质体(其它同实施例1)样品，在不同的时间点观察有无药物晶体。结果见表1。

表1

以上数据表明加入不饱和磷脂EPC后，室温放置稳定性明显增强，24h内没有晶体析出。

实施例6紫杉醇长循环热敏脂质体的体外溶血性

取不同体积的待测样品溶液(以生理盐水补充至2.5ml)，加入2％的红细胞悬液2.5ml(兔血)，以生理盐水的红细胞悬液作为阴性对照，蒸馏水的红细胞悬液为阳性对照。37℃孵育24h后，2000rpm离心3min，取上清液500微升，用生理盐水稀释至2.5ml，以生理盐水作为空白对照，于545nm处测定吸光度，溶血百分率＝样品的吸光度/阳性对照的吸光度×100％，结果见表2(两种脂质体样品只是MSPC含量不同其它同实施例1)。

表2

由以上数据可知，MSPC含量降低后其溶血百分率明显降低，当加入脂质体样品体积为0.4ml时含MSPC8％脂质体的溶血百分率大于5％，而含3％MSPC的溶血百分率小于5％，体积增大至0.5ml时仍然小于5％。

实施例7紫杉醇长循环热敏脂质体的药效学观察

取对数生长期Lewis肺癌细胞，，按每只0.2ml Lewis肺癌细胞悬液(2×10⁶/mL)接种于小鼠右腋偏背部皮下。于接种肿瘤细胞后第10日，选择肿瘤大小相对均一的小鼠40只，随机分为四组：对照组，普通注射液组(PTX，紫杉醇市售注射液)、普通脂质体组(PL，将实施例1中的DPPC换成同重量的EPC制备的脂质体)和本发明中的长循环热敏脂质体(PTL)组。除了对照组尾静脉注射生理盐水外，其它两组分别尾静脉注射给相同剂量的紫杉醇(10mg/kg)，称为治疗组。注射后，立即在肿瘤部位加热30min。共给药三次，每隔两天一次，每次给药后加热30min。取三组小鼠的肿瘤称重，根据公式计算肿瘤抑制率，结果见表3。

其中，Ws为治疗组的肿瘤质量；Wx为生理盐水组的肿瘤质量。

表3

以上数据表明紫杉醇制成长循环热敏脂质体后，与热疗结合，抑瘤效果明显增强。

实施例8紫杉醇长循环热敏脂质体的制备

所需材料与实施例1相同，称取各种磷脂(100ml脂质体的用量)和药物，溶于氯仿，50～60℃下旋转蒸发除去有机溶剂，得到干燥、均匀附着在玻璃瓶底的膜。用含乳糖磷酸盐缓冲液水化，得到多室脂质体溶液。高压下均质多室脂质体溶液，得到粒径小于200nm的溶液，再过孔径为100nm的聚碳酸酯膜。测定粒径约为150nm，脂质体溶液呈透明蓝色乳光，且流动性好。

实施例9紫杉醇长循环热敏脂质体的制备

(1)材料及用量：(100ml脂质体的用量)

(2)制备方法：

按(1)称取各种磷脂，其它操作过程与实施例1相同。

实施例10多西紫杉醇长循环热敏脂质体的制备

(1)材料及用量：(100ml脂质体的用量)

(2)制备方法：

按(1)称取各种磷脂，其它操作过程与实施例1相同。

实施例11鬼臼毒素长循环热敏脂质体的制备

(2)制备方法：

按(1)称取各种磷脂，其它操作过程与实施例1相同。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (12)

1.一种热敏脂质体，其包含至少一种磷脂酰胆碱、至少一种溶血磷脂，以及至少一种不饱和磷脂，所述脂质体的相变温度为39.0℃～45.0℃。

2.权利要求1的热敏脂质体，其还包含具有长循环特性的材料。

3.权利要求1的热敏脂质体，其还包含脂溶性活性剂，例如为脂溶性抗癌剂，例如为紫杉醇、多西紫杉醇、鬼臼毒素或埃坡霉素。

4.权利要求1的热敏脂质体，其中所述磷脂酰胆碱选自二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，氢化大豆磷脂(HSPC)，氢化卵磷脂(HEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1-豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)和1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)。

5.权利要求1的热敏脂质体，其中所述溶血磷脂选自单豆蔻酰磷脂酰胆碱、单硬脂酰磷脂酰胆碱(MSPC)和单棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)。

6.权利要求1的热敏脂质体，其中所述不饱和磷脂选自蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和心磷脂。

7.权利要求1的热敏脂质体，其中所述长循环材料选自聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺类磷脂、神经节苷脂、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、吐温和泊洛沙姆。

8.权利要求1-7任一项的热敏脂质体，其中所述的磷脂酰胆碱、溶血磷脂、不饱和磷脂、具有长循环特性的材料的重量比为69-94∶1-6∶1-10∶4-15。

9.权利要求1-8任一项的热敏脂质体，其中所述的磷脂酰胆碱、溶血磷脂、不饱和磷脂和具有长循环特性的材料的重量和与脂溶性活性剂的重量比为30-120∶1-10。

10.权利要求1-9任一项的热敏脂质体，其粒径为80～200nm。

11.药物组合物，其含有权利要求1-10任一项所述的热敏脂质体。

12.权利要求1-10的热敏脂质体或权利要求11的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

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