CN104546722A - 米铂脂质体和制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及米铂脂质体和制法。具体地说，发明涉及一种呈液体形式的药物组合物，其中包含：米铂、磷脂、胆固醇和水。该药物组合物每1ml中米铂的量为0.1～50mg，所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的，所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合，米铂与磷脂的重量比为1:0.2～20，胆固醇与磷脂的重量比为0.1～1:1。发明还提供了所述药物组合物的制备方法。发明呈液体形式的脂质体药物组合物具有如说明书所述的优点。

Description

米铂脂质体和制法

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种包含米铂的药物组合物，特别是涉及一种包含米铂的脂质体制剂，本发明还涉及它们的制备方法。

背景领域

米铂(Miriplatin)为脂溶性铂类金属络合物，是由日本住友制药株式会社研发并开发上市的新型铂(II)类抗肿瘤药物，代号为SM-11355，商品名：临床上以其一水合物的形式提供，用于治疗肝癌。米铂的化学名称为：顺-[(1R,2R)-1,2-环己二胺-N,N’]双十四酰氧基合铂，英文化学名为(SP-4-2)-[(1R,2R)-1,2-Cyclohexanediamine-kappaN,kappaN'])bis(myristato-kappa O)platinum(II)，其一水合物的化学式为：C34H68N2O4Pt·H2O，分子量：782.01，CAS登记号：141977-79-9，化学结构式见式(I)：

米铂一水合物为白色至微黄色结晶性粉末，在氯仿、二氯甲烷中溶解，在乙醇中微溶，在甲醇中极微溶，在水、乙腈中几乎不溶。

米铂可用于治疗或辅助治疗肝细胞癌、恶性淋巴瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌或表面膀胱癌等病症。米铂作为一种脂溶性铂类络合物，极低的水溶性使其难以制备成常规注射剂。在治疗肝癌时，将米铂用碘化油(罂粟籽油的脂肪酸酯的碘加成物，以下简称为碘化油)混悬后，用导管经肝动脉灌注后，可达到良好的治疗效果。由于肝细胞癌的血液供应与正常肝组织不同，其肿瘤血液供应的90％以上来源于肝动脉，10％左右来源于门静脉；而正常肝组织血液供应80％以上来源于门静脉。米铂采用碘化油混悬后，经导管肝动脉灌注，大部分药物直接进入肿瘤血管，仅有小部分药物进入正常肝组织血管。由于肿瘤组织的血管缺乏弹力层和肌层，常发生不规则扭曲，不能冲刷出粘滞的碘化油，且肿瘤组织缺乏能清除碘化油的单核巨噬系统和淋巴系统，使得碘化油选择性聚集于肝癌组织，既能有效阻断肝细胞癌的血液供应，也可将药物靶向地输送至肿瘤细胞中，保持肿瘤部位较高的局部药物浓度，而正常组织中较低的药物浓度，提高抗肿瘤疗效，降低毒副作用。

临床试验显示，肝细胞癌患者经米铂治疗，患者的TEV(肿块消失或肿瘤100％坏死率)达26.5％(22/83)；2年生存率达75.9％，3年生存率达58.4％。且由于给药操作未发生肝血管损伤，可以多次给药(J.Clin.Oncol.2009，27(15s)：4583)。另一组16例患者参加的临床试验数据显示，肝癌患者CR率达56％(9/16)(Invest.New.Drug.2004，22(2)：169-176)，耐受性好。

米铂是无菌注射制剂，通过混悬入碘化油中而给药。因此，需要将非无菌原料通过制剂工艺处理为无菌制剂。JP3255025A公开了采用叔丁醇和氯仿制备米铂冻干制剂的方法，该制剂混悬于碘化油(罂粟籽油的脂肪酸酯的碘加成物)中，长时间放置时出现粘度随时间延长而增加、混悬液分离成两层的问题。

CN1571666A公开了一种注射用冻干制剂及制备方法，该冻干制剂是通过将顺[((1R,2R)-1,2-环己烷二胺-N,N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中并冻干该溶液而获得的，所述制剂具有大约3～25μm的中心粒径分布和至多40μm的D90％值。该制剂采用2－甲基－2－丙醇(即叔丁醇)作为溶剂冻干样品，通过添加一定量的水(1.0～6.0mg/mL)，使得冻干的样品呈近似球形的颗粒，在混悬入碘化油中给药时，药物在碘化油中均匀混悬不易分层，可使药物有足够的时间不沉降，以进入肿瘤病灶而不在正常血管中滞留。但在冻干过程中，含水量需精确的控制，过低的含水量导致冻干产品为无定形粉末，过高含水量则使产品形成针状结晶，这两种形态，均会导致药物在碘化油中不能很好的混悬而分层。由于药物对水非常敏感，在含水量稍高时会立即析出针状结晶，冻干过程需加入极微量的水(1.0～6.0mg/mL)，在与叔丁醇混匀之前，水在局部过浓会导致针状晶体的形成，进而影响药物的混悬。同时需要在装瓶后瞬时冷冻样品以保证粒径的均匀性，这些都导致了制备过程中可操作性降低、风险增加。

CN1571666A公开的方法中，叔丁醇的熔点为25.5℃，在生产过程中，为了防止米铂溶液发生凝固或者局部凝固，需要控制生产环境温度为28～35℃。另外，叔丁醇易吸湿，在配料过程中，环境湿度要求在5～40％之间。生产所需的这种温湿度环境，既不符合制药行业GMP(温度应控制在18～26℃；相对湿度控制在45％～65％)规范的要求，又不适合操作人员长时间工作，该生产方式还会导致生产成本异乎寻常的增高。

CN102266297A公开了一种米铂冻干制剂的制备方法，通过使用叔丁醇和无水乙醇的混合溶剂，可降低对生产环境的温度要求，保证米铂溶液在生产过程中于室温环境下不发生凝固或局部凝固；同时产品中心粒径分布为10～25μm，混悬在碘化油注射液中后24h内沉降系数及粘度均无明显变化。但本发明人采用该专利描述方法制备冻干样品，将所得冻干样品加入碘化油混悬，将混悬液放置3h后，仍有分为两层的趋势，不能达到所述的技术效果。

然而，铂类抗癌药物是细胞毒性化合物，对癌细胞缺乏特异性和选择性，它在病灶杀灭癌细胞的同时，也杀伤体内增殖旺盛的正常细胞和某些特定类型的细胞，产生严重的毒副作用。因此，临床使用过程中，应降低铂类抗癌药物的毒副作用，提高疗效和克服耐药性。而脂质体是目前最成熟的靶向给药体系，能有效提高药物稳定性、降低毒性、减轻变态反应及免疫反应、改变药物体内分布、延缓释放、降低体内消除速度。

脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体用于制备药物中，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。其生物学定义为：当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡，称为脂质体。其药剂学定义脂质体：系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。然而由于米铂特殊的理化性质，在制备脂质体时同样会面临某些技术困难。

为此，本领域仍然期待有新的制备脂质体的方法特别是制备以米铂为活性药物的脂质体的方法，并且期待这样制备得到的脂质体具有某种或某些优异的药学性质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的制备脂质体的方法特别是制备以米铂为活性药物的脂质体的方法，并且期待这样制备得到的脂质体具有某种或某些优异的药学性质。本发明出人意料地发现，具有本发明特征的脂质体呈现优异的性质。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种呈液体形式的药物组合物，其中包含：米铂、磷脂、胆固醇和水。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其每1ml中米铂的量为0.1～50mg，例如0.2～25mg，例如0.25～20mg，例如0.5～10mg，例如0.75～7.5mg，例如1～5mg。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的。

在本发明中，提及米铂时，如未另外说明均是指其无水物。在本发明中，提及米铂的量时，均是折算成其无水物的量。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中米铂与磷脂的重量比为1:0.2～20，例如1:0.5～15，例如1:1～10。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中胆固醇与磷脂的重量比为0.1～1:1，例如0.15～0.75:1，例如0.15～0.5:1。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中所述胆固醇与磷脂在所述水中形成脂质体(本领域技术人员通常亦会称为脂微球、脂囊泡、脂质囊泡、脂质体囊泡等)的形式。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中有70％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。此短语表示的含义是，米铂在脂质体中的包封率大于70％；在本文中有类似表述时，亦具有类似的含义。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中有75％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中有80％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中有85％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中所述脂质体的平均粒径小于500nm，例如小于400nm，例如小于300nm，例如小于250nm，例如在50～500nm范围内，例如在60～400nm范围内，例如在70～300nm范围内，例如在80～200nm范围内。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其是以脂质体工艺的制备方式得到的。由此，本发明药物组合物还可称为脂质体制剂。

在本发明的一些具体实例中，如果向本发明呈液体形式的脂质体制剂中添加具有缓冲功能的缓冲剂时，会造成该呈液体形式的脂质体制在长时间贮藏时药物包封率显著的下降。该下降现象可用参数“包封率变化值”表征，其反映药物的物理稳定性特别是反映了组合物在长期放置过程中活性药物从脂质体中的渗漏。具体地说，本发明包封率变化值是照如下方法测定的：使本发明呈液体形式的药物组合物在25±1℃的温度下放置90天，分别测定0天和90天时组合物中米铂的包封率，以0天包封率减去90天包封率所得的差值，即为包封率变化值。显然，该参数越接近于0％，则包封率变化越小，如果该值>0％并且越大，则表明药物从脂质囊泡中渗漏的越多，脂质体越不稳定。

本发明人在具体试验中发现，使用了一种或多种缓冲剂的呈液体形式的脂质体药物组合物，其包封率变化值大于5％，例如大于7.5％。而未使用所述缓冲剂的本发明呈液体形式的脂质体药物组合物，其包封率变化值均在-2.5％～2.5％范围内，特别是均在-2.0％～2.0％范围内，特别是均在-1.5％～2.0％范围内，特别是均在-1.0％～2.0％范围内。本发明人已经发现，如果在本发明的呈液体形式的脂质体药物组合物中添加浓度为0.01～0.15M的如下缓冲剂时均会造成包封率变化值在7.9％～15.8％范围内：磷酸及其盐(包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、琥珀酸及其钠盐和钾盐、丁二酸及其钠盐和钾盐、柠檬酸及其钠盐和钾盐、甘氨酸及其钠盐和钾盐、乳糖酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐和钾盐、组氨酸及其钠盐。

因此，根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中不包含下列的缓冲剂：磷酸及其盐(包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、琥珀酸及其钠盐和钾盐、丁二酸及其钠盐和钾盐、柠檬酸及其钠盐和钾盐、甘氨酸及其钠盐和钾盐、乳糖酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐和钾盐、组氨酸及其钠盐。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中还包含聚乙二醇修饰的磷脂。其在本发明中亦可称为PEG化磷脂。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(可缩写为PEG-DSPE)。例如，所述PEG化磷脂选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(可缩写为PEG1000-DSPE，其余亦可类似表述)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000。它们可以容易地从市场上购买得到，例如它们可以从西安瑞禧生物购得。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中所述PEG化磷脂与胆固醇的重量比为1：1～10，例如1：1～7.5，例如1：1～5。

尽管PEG化磷脂是一种兼具PEG和磷脂性能的聚合物，然而，在本发明中，已经出人意料地发现，当添加适量PEG化磷脂时，可以使本发明呈液体形式的组合物中的活性成分呈现更加稳定的化学性质，这种改善米铂化学稳定性的性能是现有技术完全无法预期的。

出于使呈液体形式的脂质体制剂与血液等渗的目的，在本发明组合物中添加适量的渗透压调节剂是有益的。这一方面使得本发明呈液体形式的脂质体制剂可以直接注射到血管中，还可以避免在将它们添加到等渗输液例如5％葡萄糖注射液中时对脂质囊泡渗透压的剧烈改变带来的影响。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中还包含渗透压调节剂，其选自葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷等以及它们的组合。根据本发明，所述渗透压调节剂的用量是：使得所述呈液体形式的药物组合物的渗透压达到与5％～10％葡萄糖溶液相当的渗透压的程度。例如它们的添加量是使得这些渗透压调节剂在本发明所述呈液体形式的药物组合物中的浓度达到5％～10％，例如5％～7.5％，例如5％。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中还包含麦芽糖。在一个实施方案中，米铂与麦芽糖的重量比为1:1～10，例如为1:1～7.5，例如为1:1～5。已经出人意料地发现，当向本发明呈液体形式的药物组合物中添加适量的麦芽糖时，可以使得脂质体的zeta电位保持极佳的稳定性。麦芽糖是一种呈中性的物质，尽管是一种比较常规的药用辅料，但其所呈现的对保持脂质体zeta电位稳定性的效果，却是现有技术完全无法预见的，须知药液的zeta电位与所添加的组分的荷电性有一定的关联性。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)使磷脂、胆固醇和米铂添加到烧瓶中，加入溶剂使各物料溶解；

(2)蒸发除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成膜；

(3)向烧瓶中添加水，超声波处理，接着通过进行均质处理，以形成脂质体。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中所述溶剂是能够使米铂和各种亲脂性材料溶解的溶剂。可用的溶剂例如但不限于：乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿。优选的溶剂可以是氯仿。溶剂的用量是本领域技术人员根据技术经验容易确定的，并且通常是至少应保证各物料完全溶解的程度(但又不宜过量以减轻后续的蒸发除溶剂的工作量)。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(1)中，是在50～70℃(例如60～70℃)的温度下使各物料溶解。使各物料溶解的时间是根据操作经验容易确定的，通常可以在2小时以内达到溶解，更通常的可以在1小时以内达到溶解，例如可以在0.5小时以内达到溶解。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(1)中，所述的蒸发是旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(1)中，还向烧瓶中添加聚乙二醇修饰的磷脂。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(3)中，所述的水中还可包含渗透压调节剂。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(3)中，所述的水中还可包含麦芽糖。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(3)中，在50～70℃(例如60～70℃)的水浴中超声波处理5～30min，例如5～20min，例如5～10min。

根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物，其中步骤(3)中，在均质机中以5000～50000psi的压力下均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力下均质处理20～45min，例如以15000psi的压力下均质处理30min。

本发明上述制备本发明脂质体组合物的方法基本上是本领域的常规方法，也是制备它的一种示例性方法。当然，本发明呈液体形式的药物组合物，作为一种常规的脂质体制剂形式，还可以使用其它常规的制备方法，例如但不限于：薄膜分散法、注入法、超声波分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、复乳法、冻融法、表面活性剂处理法、前脂质体法、空白脂质体法、pH梯度法或硫酸铵梯度法等。

进一步地，本发明第二方面提供了一种制备呈液体形式的药物组合物(例如本发明第一方面任一实施方案所述药物组合物)的方法，所述药物组合物中包含：米铂、磷脂、胆固醇和水，该方法包括如下步骤：

(1)使磷脂、胆固醇和米铂添加到烧瓶中，加入溶剂使各物料溶解；

(2)蒸发除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成膜；

(3)向烧瓶中添加水，超声波处理，接着通过进行均质处理，以形成脂质体。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述溶剂是能够使米铂和各种亲脂性材料溶解的溶剂。可用的溶剂例如但不限于：乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿。优选的溶剂可以是氯仿。溶剂的用量是本领域技术人员根据技术经验容易确定的，并且通常是至少应保证各物料完全溶解的程度(但又不宜过量以减轻后续的蒸发除溶剂的工作量)。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(1)中，是在50～70℃(例如60～70℃)的温度下使各物料溶解。使各物料溶解的时间是根据操作经验容易确定的，通常可以在2小时以内达到溶解，更通常的可以在1小时以内达到溶解，例如可以在0.5小时以内达到溶解。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(1)中，所述的蒸发是旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(1)中，还向烧瓶中添加聚乙二醇修饰的磷脂。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)中，所述的水中还可包含渗透压调节剂。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)中，所述的水中还可包含麦芽糖。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)中，在50～70℃(例如60～70℃)的水浴中超声波处理5～30min，例如5～20min，例如5～10min。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)中，在均质机中以5000～50000psi的压力下均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力下均质处理20～45min，例如以15000psi的压力下均质处理30min。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述药物组合物每1ml中米铂的量为0.1～50mg，例如0.2～25mg，例如0.25～20mg，例如0.5～10mg，例如0.75～7.5mg，例如1～5mg。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中米铂与磷脂的重量比为1:0.2～20，例如1:0.5～15，例如1:1～10。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中胆固醇与磷脂的重量比为0.1～1:1，例如0.15～0.75:1，例如0.15～0.5:1。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述胆固醇与磷脂在所述水中形成脂质体(本领域技术人员通常亦会称为脂微球、脂囊泡、脂质囊泡、脂质体囊泡等)的形式。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中有70％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。此短语表示的含义是，米铂在脂质体中的包封率大于70％；在本文中有类似表述时，亦具有类似的含义。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中有75％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中有80％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中有85％以上的米铂被包裹在所述脂质体中。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中所述脂质体的平均粒径小于500nm，例如小于400nm，例如小于300nm，例如小于250nm，例如在50～500nm范围内，例如在60～400nm范围内，例如在70～300nm范围内，例如在80～200nm范围内。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中是以脂质体工艺的制备方式得到的。由此，本发明药物组合物还可称为脂质体制剂。

在本发明的一些具体实例中，如果向本发明呈液体形式的脂质体制剂中添加具有缓冲功能的缓冲剂时，会造成该呈液体形式的脂质体制在长时间贮藏时药物包封率显著的下降。该下降现象可用参数“包封率变化值”表征，其反映药物的物理稳定性特别是反映了组合物在长期放置过程中活性药物从脂质体中的渗漏。具体地说，本发明包封率变化值是照如下方法测定的：使本发明呈液体形式的药物组合物在25±1℃的温度下放置90天，分别测定0天和90天时组合物中米铂的包封率，以0天包封率减去90天包封率所得的差值，即为包封率变化值。显然，该参数越接近于0％，则包封率变化越小，如果该值>0％并且越大，则表明药物从脂质囊泡中渗漏的越多，脂质体越不稳定。

本发明人在具体试验中发现，使用了一种或多种缓冲剂的呈液体形式的脂质体药物组合物，其包封率变化值大于5％，例如大于7.5％。而未使用所述缓冲剂的本发明呈液体形式的脂质体药物组合物，其包封率变化值均在-2.5％～2.5％范围内，特别是均在-2.0％～2.0％范围内，特别是均在-1.5％～2.0％范围内，特别是均在-1.0％～2.0％范围内。本发明人已经发现，如果在本发明的呈液体形式的脂质体药物组合物中添加浓度为0.01～0.15M的如下缓冲剂时均会造成包封率变化值在7.9％～15.8％范围内：磷酸及其盐(包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、琥珀酸及其钠盐和钾盐、丁二酸及其钠盐和钾盐、柠檬酸及其钠盐和钾盐、甘氨酸及其钠盐和钾盐、乳糖酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐和钾盐、组氨酸及其钠盐。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中不包含下列的缓冲剂：磷酸及其盐(包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、琥珀酸及其钠盐和钾盐、丁二酸及其钠盐和钾盐、柠檬酸及其钠盐和钾盐、甘氨酸及其钠盐和钾盐、乳糖酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐和钾盐、组氨酸及其钠盐。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中还包含聚乙二醇修饰的磷脂。其在本发明中亦可称为PEG化磷脂。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(可缩写为PEG-DSPE)。例如，所述PEG化磷脂选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(可缩写为PEG1000-DSPE，其余亦可类似表述)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000。它们可以容易地从市场上购买得到，例如它们可以从西安瑞禧生物购得。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中所述PEG化磷脂与胆固醇的重量比为1：1～10，例如1：1～7.5，例如1：1～5。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中还包含渗透压调节剂，其选自葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷等以及它们的组合。根据本发明，所述渗透压调节剂的用量是：使得所述呈液体形式的药物组合物的渗透压达到与5％～10％葡萄糖溶液相当的渗透压的程度。例如它们的添加量是使得这些渗透压调节剂在本发明所述呈液体形式的药物组合物中的浓度达到5％～10％，例如5％～7.5％，例如5％。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述药物组合物中还包含麦芽糖。在一个实施方案中，米铂与麦芽糖的重量比为1:1～10，例如为1:1～7.5，例如为1:1～5。

在本发明的任一方面，所制备的呈液体形式的药物组合物即脂质体制剂，可以通过控制制备工艺的方式，将该脂质体制剂制成供无菌方式使用的无菌制剂。这种工艺的控制是容易的，例如先控制方式，即将各原辅料经无菌处理，再以全程无菌操作制备成无菌制剂；还可以是后控制的方式，即将制备得到的呈液体形式的脂质体经例如但不限于微孔滤膜过滤的方式除菌。因此，根据本发明的任一方面，所制备的呈液体形式的药物组合物是无菌制剂。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中如未另外说明，涉及的％是重量/重量百分数。

首次将米铂推向市场的是大日本住友公司的Miripla(miriplatin)制剂，剂型为冻干粉针剂，并配有专利溶媒(专用混悬液)，其用于肝细胞癌(HCC)的治疗，商品名为：英文名：Miriplatin Hydrate，日文名：ミリプラチン水和物，化学名：(SP-4-2)-[(1R,2R)-1,2环己二氨-N,N′]二(十四酸-O)合铂一水合物，CAS登记号：141977-79-9，分子式：C34H68N2O4Pt·H2O，相对分子量：782.01，结构式为：

的用法用量为：将70mg本品溶于3.5mL本品专用混悬液中，通过插入肝动脉内的导管注射进肝脏，直至药液充满肿瘤血管内时结束。给药上限为每次6mL(含本品120mg)，且需重复给药时要设4周以上的观察期。

Miriplatin Hydrate是大日本住友制药株式会社开发的脂溶性铂复合物抗癌药，于2009年10月16日获得日本厚生劳动省批准，用于治疗肝细胞癌。本品专用混悬液已于同年8月20日获得批准。2010年1月20日，Miriplatin Hydrate及其专用混悬液同时上市销售。

肝细胞癌是世界上最常见的、复发率很高的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位，死因第3位，且呈逐年增长趋势，已超过62.6万人/年，我国发病人数约占全球总发病人数的55％，日本2005年肝细胞癌患者约6.6万人。肝细胞癌的发病特点多为丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒持续感染导致慢性肝炎、肝硬化而最终发展为肝细胞癌。临床上通常采用肝脏切除、移植等外科手术治疗；射频消融术、经皮微波凝固疗法、经皮无水乙醇注射疗法等内科局部治疗；经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)、经导管的动脉灌注治疗；全身化疗。其中，TACE尽管只在无法实施外科手术或内科局部治疗的时候才使用，但在首次治疗中的比例却为29.6％，在肝内复发治疗中占53.3％，其重要地位可见一斑。TACE是将抗癌药物与碘化罂粟子油的混合物从肝动脉内注入病灶，同时注入明胶海绵等栓塞物质堵塞动脉，切断动脉血流，达到致肿瘤坏死的目的。用于TACE的抗癌药物有盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、丝裂霉素、顺铂、净司他丁斯酯等。其中，铂类抗癌药物顺铂因其高效抗癌活性与广谱抗癌效果而被广泛使用，对肝细胞癌也表现出良好的临床效果，但其水溶性的特点使得它利用碘化罂粟子油为载体的物理稳定性受到严重影响；净司他丁斯酯是唯一作为以碘化罂粟子油脂肪酸乙酯(ethyl ester of iodinated poppy-seed oilfatty acid)为载体、由肝动脉注射给药的抗癌药物获得批准的，自1994年上市后抗肿瘤效果获得首肯，但该药存在可能导致肝动脉血管损伤、对肝胆系统的影响不可逆转等问题，对以后治疗及预后有影响，用药安全存在隐患。因此，寻找与碘化罂粟子油脂肪酸乙基酯亲和性高、抗癌效果不逊于净司他丁斯酯、预后安全、隐患小的药物成为药物研发的新目标。

Miriplatin Hydrate是日本国立癌症中心研究所前田等人研发的脂溶性铂复合物，与碘化罂粟子油脂肪酸乙酯的亲和性高，能稳定溶于碘化罂粟子油脂肪酸乙酯构成缓释药物，经肝动脉给药后选择性地、长时间滞留在癌症部位，缓慢地释放药物，抗癌效果出色。住友以前田等人的研究为基础，从20世纪90年代开始有关本品的合成、物理性质、制剂化的探讨以及非临床试验，并以获得的非临床试验结果为依据，从1994年开始在日本对肝细胞癌患者进行临床试验。1994年10月开始Ⅰ期临床试验，1998年7月开始Ⅱ期A阶段临床试验，2002年4月开始Ⅱ期B阶段临床试验。临床试验表明，不仅对首次接受治疗患者，而且对一些曾接受过肝切除术等其他方法治疗又再次复发的肝细胞癌患者，本品都显示出良好的抗肿瘤效果。而且本品的不良反应都是本疗法已知的一般性不良反应，患者只要在精通本疗法的医疗机构接受本品治疗，这些不良反应可耐受。基于这3次临床试验的成绩以及Ⅱ期B阶段临床试验的后续给药试验成绩，本品最终获得了日本厚生劳动省的批准。

利用肝脏内移植鼠肝癌细胞株AH109A或人肝癌细胞株Li-7的鼠移植肝癌模型，评价本品混悬液在体内对癌细胞增殖的抑制作用。结果显示，本品混悬液以剂量相关方式抑制癌细胞增殖，且当混悬液中的本品为20mg/mL时肿瘤细胞增殖率明显降低。本品混悬液单剂量给药，对同一肝癌模型也呈剂量相关地抗肿瘤作用。

本品是溶于专用碘化罂粟子油脂肪酸乙酯、肝动脉内给药的抗癌药物，其与碘化罂粟子油脂肪酸乙酯的亲和性高，且肝动脉内给药后滞留于肿瘤部位，混悬液中的铂成分可长时间缓慢释放进入血液或组织中，铂二价化合物与DNA结合，通过阻止DNA合成抑制癌细胞增殖，提高了抗癌效果。

Ⅰ期临床试验结果表明，本品最大耐受量为20mg/mL以上(给药量最多6mL)；给药后血中总铂浓度极低，可长时间维持；不良反应程度较轻，可控且在耐受范围。本品1年生存率为63.6％，2年生存率为38.2％

Ⅱ期A阶段临床试验结果表明，本品给药后血中总铂浓度(ng)等级极低，属微量且维持时间长，给药后约1年Cmax大约降至17％。未见等级4的严重不良反应，所见不良反应几乎都在给药后4～6周消失，可控且在耐受范围。本品对肝细胞癌的疗效(TE)良好，CR率达60％。

Ⅱ期B阶段临床试验结果表明，本品与净司他丁斯酯疗效相当，且更安全。血中总铂质量浓度(平均值)：首次及第2次给药后分别为9.6、12.9ng/mL，甲醇分离出的铂质量浓度(平均值)分别为1.17、1.19ng/mL。本品1、2、3年的生存率分别为90.1％、75.9％、58.4％；对照药组1、2、3年的生存率分别为97.4％、70.3％、48.7％。

临床试验显示，不论是首次接受此项治疗肝细胞癌患者，还是一些接受过肝切除等其他治疗方法的复发患者，本品都表现出良好的抗癌效果。而且产生副作用均为这类治疗中常见的副作用，在精通这类疗法的医疗机构接受本品治疗，这些副作用都控制在耐受范围。

尽管米铂制剂已经在临床上取得了良好的效果，然而由于其给药方式的特殊性(插入肝动脉内的导管注射进肝脏)，这在临床上将严重限制它的使用范围。另外，由于其制剂的特殊性(使用有机溶剂的特殊冻干工艺，以及使用特殊的油作为专用溶媒)，使得制剂的制造成工艺非常复杂并且生产成本极高。因此将米铂制成类似于本发明的脂质体，以便像其它铂类制剂那样从血管经全身给药是极为有利的。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

在以下具体实例部分，如未另外提及，提供的呈液体形式的药物组合物的配方是每1ml所得药物组合物中各物料的用量来表示的；在实际制备时，以制备1000ml呈液体形式的药物组合物的量投料。如未另外提及，所述米铂是以其一水合物的形式添加的。如未另外提及，涉及米铂的量时，均是折算成其无水物的量。

实施例1：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂3mg、

蛋黄卵磷脂15mg、

胆固醇3mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.08Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例2：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂1mg、

氢化蛋黄卵磷脂1mg、

胆固醇0.15mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约1/3浓度)，在60℃水浴中处理约25min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(45℃、0.05Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，70℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例3：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂5mg、

大豆卵磷脂50mg、

胆固醇25mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在70℃水浴中处理约30min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(35℃、0.1Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，60℃水浴中用超声波处理10min，接着通过进行均质处理(20min，均质机压力20000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例4：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂0.75mg、

氢化大豆卵磷脂3mg、

胆固醇0.6mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂(以无水物添加)添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约1/4浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.06Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理20min，接着通过进行均质处理(45min，均质机压力10000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例5：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂7.5mg、

二棕榈酰磷脂酰胆碱45mg、

胆固醇9mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.09Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例6：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂2mg、

磷脂酰乙醇胺15mg、

胆固醇6mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.08Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例7：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂5mg、

二棕榈酰磷脂酰胆碱15mg、

胆固醇3mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.08Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例8：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂3mg、

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱15mg、

胆固醇6mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.08Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

实施例9：制备呈液体形式的药物组合物

处方：

米铂3mg、

二肉豆蔻酰磷脂酰甘油10mg、

胆固醇3mg、

注射用水，适量加至1ml。

制法：

(1)使磷脂、胆固醇等脂质材料和米铂添加到圆底烧瓶中，加入溶剂(氯仿，其添加量是达到全部固体物料在此溶剂中饱和溶解度浓度的约一半浓度)，在65℃水浴中处理约20min，使各物料溶解；

(2)旋转蒸发(40℃、0.08Mpa、10min)除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成脂质膜；

(3)向烧瓶中添加水(如有其它水溶性材料，预先溶解在所添加的水中)，65℃水浴中用超声波处理5min，接着通过进行均质处理(30min，均质机压力15000psi))，以形成呈液体形式的药物组合物，为脂质体；接着对所得脂质体进行微孔滤膜过滤除菌处理，得到可注射给药的呈液体形式的脂质体制剂。

以上实施例1-9制备得到的脂质体，分别可以用Ex1、Ex2、Ex3、Ex4、Ex5、Ex6、Ex7、Ex8、Ex9标示。

实施例10：制备呈液体形式的药物组合物

分别照CN103735509A说明书实施例1-8所载的配方和制法，制备得到八个脂质体，分别用Ex10a1、Ex10a2、Ex10a3、Ex10a4、Ex10a5、Ex10a6、Ex10a7、Ex10a8标示。另外，分别照本发明上文实施例1-9的配方和方法，不同的是在步骤(3)中所用的水是含有0.025mol/L磷酸根的磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠和磷酸二氢钠混配，pH6.8)，制备得到九个脂质体，分别用Ex10b1、Ex10b2、Ex10b3、Ex10b4、Ex10b5、Ex10b6、Ex10b7、Ex10b8、Ex10b9标示。另外，分别照本发明上文实施例1的配方和方法，不同的是在步骤(3)中所用的水是含有0.025mol/L酸根的使用如下8种缓冲剂配制的缓冲液(pH均调节为6.8)：磷酸盐(磷酸氢二钾/磷酸二氢钾)、琥珀酸盐(琥珀酸/琥珀酸钠)、丁二酸盐(丁二酸/丁二酸钠)、柠檬酸盐(柠檬酸/柠檬酸钠)、甘氨酸盐(甘氨酸/甘氨酸钠)、乳糖酸盐(乳糖酸/乳糖酸钠)、酒石酸盐(酒石酸/酒石酸钠)、组氨酸盐(组氨酸/组氨酸钠)，制备得到八个脂质体，分别用Ex10c1、Ex10c2、Ex10c3、Ex10c4、Ex10c5、Ex10c6、Ex10c7、Ex10c8标示。

试验例1：脂质体稳定性考察方法

脂质体密封在安瓿新中，在避光的室温(25±1℃)条件下放置3个月(具体为90天)可以推定相当于在4～8℃密闭、避光放置至少18个月。以上室温放置3个月的方法作为高温处理法，考察脂质体的稳定性。

试验例2：脂质体包封率的测定

本发明采用离心法测定米铂脂质体的包封率：称取约411.50mg各脂质体溶液(约定为400μl)，200000g、4℃离心30min后，取上清进样检测。沉淀用甲醇全量转移并定容于10ml容量瓶中，超声15min后，12000g、4℃离心15min后，取上清液进样检测。按照如下公式计算包封率：

结果表明，上文实施例1至9所得九个脂质体样本、Ex10a1至Ex10a8八个脂质体样本、Ex10b1至Ex10b9九个脂质体样本、Ex10c1至Ex10c8八个脂质体样本，它们的包封率均在68～96％范围内，特别是上文实施例1至9所得九个脂质体样本的包封率均在86～95％范围内，显示这些脂质体均有较高的包封率。

使用上文所述高温处理法，分别测定每个脂质体样本在0月时以及在3月时的包封率，以下式计算包封率变化值：

包封率变化值＝0月包封率-3月包封率

测定上文实施例1至9所得九个脂质体样本、Ex10a1至Ex10a8八个脂质体样本、Ex10b1至Ex10b9九个脂质体样本、Ex10c1至Ex10c8八个脂质体样本，它们的包封率变化值，结果显示，本发明上文实施例1至9所得九个脂质体样本的包封率变化值均在-1.5％～2.0％范围内，绝大多数在-1.0％～2.0％范围内。但是，出人意料的是，Ex10a1至Ex10a8八个脂质体样本的包封率变化值均在8.7％～14.6％范围内，Ex10b1至Ex10b9九个脂质体样本的包封率变化值均在7.9％～13.6％范围内，Ex10c1至Ex10c8八个脂质体样本的包封率变化值均在9.6％～15.8％范围内。显示这些添加了缓冲剂的脂质体均出现包封率不稳定的性质。

实施例11：制备呈液体形式的药物组合物

参考上文实施例1的配方和制法，不同的是在步骤(1)中随磷脂还一同添加有如下PEG化磷脂：PEG1000-DSPE(其用量以该PEG化磷脂与处方中胆固醇的重量比表示，为1：2，下同，并且可用“相对用量”表示)、PEG2000-DSPE(1：2)、PEG3350-DSPE(1：3)、PEG4000-DSPE(1：5)、PEG5000-DSPE(1：1)、PEG6000-DSPE(1：3)、PEG8000-DSPE(1：6)、PEG10000-DSPE(1：7.5)，制备得到八个脂质体，分别用Ex111、Ex112、Ex113、Ex114、Ex115、Ex116、Ex117、Ex118标示。

实施例12：制备呈液体形式的药物组合物

参考上文实施例1～9的配方和制法，不同的是在步骤(1)中随磷脂还一同添加有如下PEG化磷脂：参照实施例1～3的均添加PEG2000-DSPE(相对用量1：3)、参照实施例4～6的均添加PEG3350-DSPE(相对用量1：2)、参照实施例7～9的均添加PEG4000-DSPE(相对用量1：4)，制备得到九个脂质体，分别用Ex121、Ex122、Ex123、Ex124、Ex125、Ex126、Ex127、Ex128、Ex129标示。

试验例3：脂质体中米铂的含量测定

以反相高效液相色谱法测定脂质体中米铂的含量，并以外标法计算，具体如下：

脂质体样品处理：精密称取51.50mg的米铂脂质体(约定体积为50μl)于1.5ml的Ep管中，加入1ml甲醇(移液管移取)，混匀，12000g、4℃、离心15min，取上清液进样检测；

米铂外标：精密称取3.17mg米铂原料药，置于50ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，进样检测；

色谱条件：色谱柱为C8柱，柱温为30℃；流动相为甲醇:水＝90:10，流速为1ml/min；检测波长为210nm；进样量为20μl；样品仓温度为20℃。

经测定，上文实施例1～9、实施例10、实施例11、实施例12制备得到的全部脂质体样本，它们中米铂的含量均相当配方投料量的98.7～101.8％范围内，表明终产物的活性药物实际含量与理论投料量相当，即各种配方使用各种工艺制备得到的脂质体其活性成分无损失。

试验例3a：以米铂含量变化表征的脂质体稳定性

以脂质体中米铂残余量为指标考察脂质体中活性成分的化学稳定性。对于某一样本：测定其在0月时米铂含量；接着将该样本经室温放置3个月的高温处理，测定3月时米铂含量，以下式计算经此处理后的米铂残余量：

米铂残余量＝(3月米铂含量÷0月米铂含量)×100％

考察上文实施例1～9、实施例10、实施例11、实施例12制备得到的全部脂质体样本经高温3月处理后的米铂残余量。结果：实施例1～9所得全部脂质体的米铂残余量在91～94％范围内，结果尚可接受但不能令人满意；实施例10所得全部脂质体的米铂残余量在84～90％范围内，结果不能令人接受；实施例11和实施例12所得全部脂质体的米铂残余量均在97～101％范围内，结果非常令人满意。可见，添加了PEG化磷脂的脂质体对于维持脂质体中米铂的化学稳定性是显著更优的，而不添加PEG化磷脂或者更甚地另外添加了缓冲剂的脂质体中米铂化学稳定性不能令人满意甚至不能令人接受。尽管众所周知的PEG化磷脂仅仅是一种脂质体形成材料以促进脂质体囊泡的形成，但出人意料地显示它们的存在能有助于提高米铂在脂质体中的化学稳定性，这是目前无任何理论能够解释的。

实施例13：制备呈液体形式的药物组合物

分别参考上文实施例1-9的配方和制法，不同的是在步骤(3)中添加麦芽糖：参照实施例1-3添加麦芽糖的量为米铂重量的3倍、参照实施例4-6添加麦芽糖的量为米铂重量的1倍、参照实施例7-9添加麦芽糖的量为米铂重量的5倍。制备得到九个脂质体，分别用Ex131、Ex132、Ex133、Ex134、Ex135、Ex136、Ex137、Ex138、Ex139标示。

实施例14：制备呈液体形式的药物组合物

分别参考上文实施例11中所得八个脂质体的配方和制法，不同的是在步骤(3)中添加麦芽糖，麦芽糖的量为米铂重量的3倍。制备得到八个脂质体，分别用Ex141、Ex142、Ex143、Ex144、Ex145、Ex146、Ex147、Ex148标示。

实施例15：制备呈液体形式的药物组合物

分别参考上文实施例12中所得九个脂质体的配方和制法，不同的是在步骤(3)中添加麦芽糖，麦芽糖的量为米铂重量的2.5倍。制备得到九个脂质体，分别用Ex151、Ex152、Ex153、Ex154、Ex155、Ex156、Ex157、Ex158、Ex159标示。

试验例4：脂质体zeta电位测定

使用公知的方法测定脂质体的zeta电位。由于配方的不同，不同脂质体的zeta电位可能会存在巨大差异，因此不同脂质体之间zeta电位的不具可比性。但是脂质体在经过一段时间放置(类似于药品长期贮藏)后其zeta电位的变化，即zeta电位变化值，可以反映所检测的脂质体的物理稳定性。

对于某一样本，测定其在0月时zeta电位；接着将该样本经室温放置3个月的高温处理，测定3月时zeta电位，以下式计算经此处理后的zeta电位变化值(取其绝对值)：

zeta电位变化值＝|[(3月米铂含量-0月米铂含量)÷0月米铂含量]×100％|

上述zeta电位变化值越接近于0％则表明以zeta电位表征的脂质体稳定性越好。

经测定：实施例13所得9个脂质体、实施例14所得8个脂质体、实施例15所得9个脂质体，这些添加了麦芽糖的脂质体，它们的zeta电位变化值均小于4.5％，均在0.2～4.3％范围内，表明这些添加麦芽糖的脂质体zeta电位非常稳定；实施例1-9所得9个脂质体、实施例10所得全部脂质体、实施例11所得8个脂质体、实施例12所得9个脂质体，其zeta电位变化值均在13.6～27.8％范围内，表明这些未添加麦芽糖的脂质体zeta电位不稳定。

另外，参照本发明实施例1的配方和制法，不同的是在步骤(3)中添加下列物质(其添加量均为米铂重量的3倍)：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷，制备得到六个脂质体；照上法测定这六个脂质体的zeta电位变化值，结果显示均在11.2～19.7％范围内，表明这些即使是同类的糖却不能实现如麦芽糖的效果。但是另外地，在此使用六种物质制得的脂质体中，补充添加米铂重量3倍的麦芽糖时，所得六个脂质体经测定其zeta电位变化值均在1.6～3.4％范围内，这表明在含有麦芽糖的脂质体中再添加上述这些常规糖类仍然维持优良的zeta电位稳定性。

试验例5：脂质体性能测试

1、脂质体的包封率和包封率变化值

照上文所述方法测定。实施例11所得8个脂质体、实施例12所得9个脂质体、实施例13所得9个脂质体、实施例14所得8个脂质体、实施例15所得9个脂质体，经测定，它们的包封率均在85～95％；它们经高温处理后，包封率变化值均在-1.5％～2.0％范围内，绝大多数在-1.0％～2.0％范围内。

2、脂质体中米铂的含量和含量变化

照上文所述方法测定。经测定，实施例13、实施例14、实施例15制备得到的全部脂质体样本，它们中米铂的含量均相当配方投料量的98.5～101.2％范围内；它们经高温处理后，实施例13制备得到的全部脂质体样本的米铂残余量在90～94％范围内，实施例14和实施例15制备得到的全部脂质体样本的米铂残余量在97～99％范围内。

3、脂质体的粒径

使用常规的脂质体粒径测定方法，测定实施例1至实施例9所得9个脂质体、实施例11所得全部脂质体、实施例12所得全部脂质体、实施例13所得全部脂质体、实施例14所得全部脂质体、实施例15所得全部脂质体的粒径，结果显示它们的平均粒径均在80～200nm范围内，例如Ex131样本的平均粒径为128±19nm。

Claims (10)

1.一种呈液体形式的药物组合物，其中包含：米铂、磷脂、胆固醇和水。

2.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于：

该药物组合物每1ml中米铂的量为0.1～50mg，例如0.2～25mg，例如0.25～20mg，例如0.5～10mg，例如0.75～7.5mg，例如1～5mg；

所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的；

所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合；

米铂与磷脂的重量比为1:0.2～20，例如1:0.5～15，例如1:1～10；和/或

胆固醇与磷脂的重量比为0.1～1:1，例如0.15～0.75:1，例如0.15～0.5:1。

3.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于：

所述胆固醇与磷脂在所述水中形成脂质体的形式；

其中有70％以上的米铂被包裹在所述脂质体中；

其中有75％以上的米铂被包裹在所述脂质体中；

其中有80％以上的米铂被包裹在所述脂质体中；

其中有85％以上的米铂被包裹在所述脂质体中；

其中所述脂质体的平均粒径小于500nm，例如小于400nm，例如小于300nm，例如小于250nm，例如在50～500nm范围内，例如在60～400nm范围内，例如在70～300nm范围内，例如在80～200nm范围内；和/或

其是以脂质体工艺的制备方式得到的。

4.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于：

其中不包含下列的缓冲剂；

其中不包含下列的缓冲剂：磷酸及其盐(包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、琥珀酸及其钠盐和钾盐、丁二酸及其钠盐和钾盐、柠檬酸及其钠盐和钾盐、甘氨酸及其钠盐和钾盐、乳糖酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐和钾盐、组氨酸及其钠盐；

其中还包含聚乙二醇修饰的磷脂；

所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿；

所述PEG化磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；

所述PEG化磷脂选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(可缩写为PEG1000-DSPE，其余亦可类似表述)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000；

所述PEG化磷脂与胆固醇的重量比为1：1～10，例如1：1～7.5，例如1：1～5；

还包含渗透压调节剂，其选自葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷等以及它们的组合；

还包含麦芽糖；和/或

其中米铂与麦芽糖的重量比为1:1～10，例如为1:1～7.5，例如为1:1～5。

5.根据权利要求1的药物组合物，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)使磷脂、胆固醇和米铂添加到烧瓶中，加入溶剂使各物料溶解；

(2)蒸发除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成膜；

(3)向烧瓶中添加水，超声波处理，接着通过进行均质处理，以形成脂质体。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于：

其中所述溶剂是能够使米铂和各种亲脂性材料溶解的溶剂，例如但不限于：乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿；

步骤(1)中，是在50～70℃(例如60～70℃)的温度下使各物料溶解；

步骤(1)中，所述的蒸发是旋转蒸发；

所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发；

所述的旋转蒸发在减压下进行的；

所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的；

所述的旋转蒸发在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的；

步骤(1)中，还向烧瓶中添加聚乙二醇修饰的磷脂；

步骤(3)中，所述的水中还可包含渗透压调节剂；

步骤(3)中，所述的水中还可包含麦芽糖；

步骤(3)中，在50～70℃(例如60～70℃)的水浴中超声波处理5～30min，例如5～20min，例如5～10min；

步骤(3)中，在均质机中以5000～50000psi的压力下均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力下均质处理20～45min，例如以15000psi的压力下均质处理30min。

7.制备呈液体形式的药物组合物的方法，所述药物组合物中包含：米铂、磷脂、胆固醇和水，该方法包括如下步骤：

(1)使磷脂、胆固醇和米铂添加到烧瓶中，加入溶剂使各物料溶解；

(2)蒸发除去溶剂，使各物料在烧瓶内壁形成膜；

(3)向烧瓶中添加水，超声波处理，接着通过进行均质处理，以形成脂质体。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于：

述溶剂是能够使米铂和各种亲脂性材料溶解的溶剂，例如但不限于：乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿；

步骤(1)中，是在50～70℃(例如60～70℃)的温度下使各物料溶解；

步骤(1)中，所述的蒸发是旋转蒸发；

所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发；

所述的旋转蒸发在减压下进行的；

所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的；

所述的旋转蒸发在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的；

步骤(1)中，还向烧瓶中添加聚乙二醇修饰的磷脂；

步骤(3)中，所述的水中还可包含渗透压调节剂；

步骤(3)中，所述的水中还可包含麦芽糖；

步骤(3)中，在50～70℃(例如60～70℃)的水浴中超声波处理5～30min，例如5～20min，例如5～10min；和/或

步骤(3)中，在均质机中以5000～50000psi的压力下均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力下均质处理20～45min，例如以15000psi的压力下均质处理30min。

9.根据权利要求7的方法，其特征在于：

所述药物组合物每1ml中米铂的量为0.1～50mg，例如0.2～25mg，例如0.25～20mg，例如0.5～10mg，例如0.75～7.5mg，例如1～5mg；

所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的；

所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合；

米铂与磷脂的重量比为1:0.2～20，例如1:0.5～15，例如1:1～10；

胆固醇与磷脂的重量比为0.1～1:1，例如0.15～0.75:1，例如0.15～0.5:1；

所述胆固醇与磷脂在所述水中形成脂质体的形式；

所述药物组合物中有70％以上、75％以上、80％以上、或85％以上的米铂被包裹在所述脂质体中；

所述药物组合物中所述脂质体的平均粒径小于500nm，例如小于400nm，例如小于300nm，例如小于250nm，例如在50～500nm范围内，例如在60～400nm范围内，例如在70～300nm范围内，例如在80～200nm范围内；和/或

所述药物组合物中是以脂质体工艺的制备方式得到的。

10.根据权利要求7的方法，其特征在于：

所述药物组合物中不包含下列的缓冲剂：磷酸及其盐(包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、琥珀酸及其钠盐和钾盐、丁二酸及其钠盐和钾盐、柠檬酸及其钠盐和钾盐、甘氨酸及其钠盐和钾盐、乳糖酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐和钾盐、组氨酸及其钠盐；

所述药物组合物中还包含聚乙二醇修饰的磷脂；

所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿；

所述PEG化磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(可缩写为PEG-DSPE)；

所述PEG化磷脂选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(可缩写为PEG1000-DSPE，其余亦可类似表述)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000；

所述PEG化磷脂与胆固醇的重量比为1：1～10，例如1：1～7.5，例如1：1～5；

所述药物组合物中还包含渗透压调节剂，其选自葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷等以及它们的组合；

所述药物组合物中还包含麦芽糖；

米铂与麦芽糖的重量比为1:1～10，例如为1:1～7.5，例如为1:1～5。4 -->