CN1981755A - 固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物载体的新剂型 - Google Patents

Abstract

本发明提供了固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物药物载体材料的应用。另一方面，还提供了一种药物组合物，它含有药物活性成分鬼臼毒素及其衍生物和作为药物载体材料的固体脂质纳米粒。固体脂质纳米粒与鬼臼毒素及其衍生物的质量比为15～50。固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物的载药体系，具有较好的稳定性，包封率高，释放曲线良好，为鬼臼毒素及其衍生物提供了一种理想的载药方式。上述的药物组合物具有制备工艺简单，成本低，工艺参数容易控制的特点；而且生物相容性好、易生物降解、有成膜性、柔韧性等优点，还有一定的消炎、抗菌作用，提高了鬼臼毒素及其衍生物的药效。

Description

固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物载体的新剂型

技术领域

本发明涉及固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物载体的应用及其新剂型。

背景技术

固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是近十几年正在发展的一种新型的脂质载药系统，它是以天然的或人工合成的高熔点固体脂质(如饱和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂质)为载体，将药物吸附或包裹于脂质核中制成的纳米给药体系。和乳剂、脂质体相似，SLN以毒性低、生物相容性好的脂质材料作为载体。同时，固体脂质又使它具有聚合物纳米粒(PNP)的优点，如可以控制药物的释放、避免药物的降解或泄漏以及良好的靶向性等。SLN的水分散系统可以进行高压灭菌或γ辐射灭菌，具有长期的物理化学稳定性，也可通过冷冻干燥或喷雾干燥制成固体粉末，还可采用高压乳匀法进行规模化生产。

固体脂质纳米粒的主要成分有：(1)脂质，如脂肪酸甘油酯类(包括三硬脂酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三肉豆范酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三俞酸甘油酯、Witepsol W 35、Witepsol H35、Witepsol H42、单硬脂酸甘油酯)及脂肪酸类(如硬脂酸、棕榈酸)等；(2)乳化剂和助乳化剂，如磷脂(包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂及磷脂酰胆碱等)，Poloxamer，聚山梨醇，胆酸盐，四丁酚醛等；(3)药物，亲脂性药物和酯化后的亲水性药物均能制备成稳定的SLN体系，并且载药量和包封率都较高。

固体脂质纳米粒适于作为缓慢释药的给药系统，更为重要的是可以通过改变脂类骨架结构、表面活性剂浓度和生产工艺参数来修正释药曲线，药物的体外释放可达5～7周，释药曲线可被调整为延迟释放而完全无突释现象，也可以有部分突释，随后是延迟释药，在这些情况下突释药物可作为首剂量给予。

药物在SLN中的分布主要由药物性质(熔点、极性等)、脂质材料性质、表面活性剂浓度和工艺参数(制备温度等)决定，分布模式有三种：

1.药物以分子形式均匀分散于聚合物材料中；

2.药物吸附在粒子表面；

3.药物集中于内核。

若药物熔点高于脂质材料熔点，冷却时药物会优先凝固形成药物核心，表现出缓释行为和高包封率；若药物熔点低于脂质材料，脂质优先重结晶形成脂质核心，药物分布在其外层，表现为突释行为和低包封率。药物亲脂性越强，分布于脂质核心的药物就越多，分子极性越大，包封率越低。

固体脂质纳米粒的给药途径较为广泛，是一种很有发展前景的新型载药系统，主要包括以下几种方式：(1)注射给药：SLN最初是为静脉注射的靶向控释药物而设计。脂质液滴转变成为固体(SLN)以后，药物的扩散系数减小，从而能减慢了药物的释放。(2)口服给药：SLN的口服剂型包括水性的分散体和含SLN的传统剂型形式，如片剂、丸剂或胶囊剂等。通过优化乳化剂和脂质的种类和剂量，可以得到在胃肠道中稳定的SLN，利用纳米颗粒的粘着性可提高药物的生物利用度，减少不规则吸收。SLN可替代赋形剂以改善药物在胃肠道中的分布并控制药物从脂质基质中的释放。(3)局部给药：固体脂质纳米粒中有潜力很快投入市场的是用于局部的。和脂质体相似，SLN由耐受性很好的辅料组成，由于它们的粒径很小，拥有相似的粘合特性，在皮肤上能形成膜。SLN的另一显著优点是它为固态，保护药物避免化学降解，也可以调节药物的释放。极有前途的应用领域是将SLN用于防晒乳膏中，SLN本身也有遮光效应，可阻挡紫外线，分子遮光剂和SLN的协同作用，为新一类的防晒乳膏的研究开辟了道路。(4)肺部给药：脂质纳米粒的优点在于它可以控制药物在肺部的释放，延长药物在肺部的释放时间。与聚合物纳米粒相比，脂质纳米粒的降解速度较快。另外，脂质纳米粒的体内耐受性很好，适于装载对肺巨噬细胞靶向的药物。肺部的粒子易于被巨噬细胞吞噬，因此可以用脂质纳米粒来治疗RES系统的感染。

固体脂质纳米粒是用毒性低，生物相容性好的脂质材料为载体，同聚合物纳米粒相比，SLN的毒性大大降低。以HL60细胞和人粒性白细胞的生存情况为指标，考察不同纳米载药体系的体外细胞毒性，发现SLN的毒性比PLGA纳米粒的毒性低90％，比PBCA纳米粒低99％。PLA纳米粒、PLGA纳米粒和SLN使人粒性白细胞的存活率降低50％的浓度分别为0.30％，0.15％，和大于10％，这说明SLN的毒性最低，更适合作为静脉给药系统药物的载体。

鬼臼毒素(podophyllotoxin)是鬼臼类植物的主要有效成分，鬼臼类植物是一类具有生物活性，且有漫长应用历史的药用植物。早在2000多年前，古代中国就有用鬼臼的提取液治疗恶性肿瘤。鬼臼的提取液还被广泛用作缓泻、利胆剂、治疗蛇毒、牛皮癣、淋病等的有效药剂。1942年，Chaplains局部应用鬼臼毒素治疗尖锐湿疣，获得了满意的效果。直到目前为止，鬼臼毒素还是治疗尖锐湿疣最有效的药剂，主要有鬼臼毒素的乙醇溶液和鬼臼毒素膏两种药剂形式。

1947年，科学家证实了鬼臼毒素对动物癌细胞的破坏作用，引起了人们对此进行广泛的医学、生物学和化学研究，但由于鬼臼毒素的醇溶液不稳定，在治疗剂量上很难把握，加之鬼臼毒素的毒性太大，使得鬼臼毒素作为抗肿瘤药物，在使用上受到很大的限制。50年代开始，国外很多研究机构(包括国家癌症治疗中心)开始对鬼臼毒素进行了很多结构改造工作，以期得到毒副作用小，但能保留鬼臼毒素的抗肿瘤活性的化合物。Sandoz制药公司的研究者分别在1966和1967年成功的合成了依托泊甙(Etoposide，VP-16，1.2)和替尼泊代(Teniposide，VM-26，1.3)。这两个化合物被证明对AML(acute myeloid leukaemia)、霍吉金氏病、非霍吉金氏淋巴瘤、肺癌(包括小细胞和非小细胞肺癌)、胃癌、乳腺癌、卵巢癌有效。VP-16在1983年通过FDA的审批，成为目前临床使用较多的抗肿瘤药之一。但它们仍存在以下不足：水溶性差，抗瘤谱窄，经代谢易失活，易形成耐药性和较严重的骨髓抑制等毒性作用，从而限制了其广泛应用于临床。促使人们进一步对鬼臼毒素母核进行结构改造和药理筛选，或找寻新的鬼臼毒素给药剂型，以期得到高效低毒的抗癌药物。

发明内容

本发明的目的在于提供固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物载体的应用以及鬼臼毒素的药物新剂型。

利用固体脂质纳米粒缓释、靶向性、稳定、安全的特点，作为鬼臼毒素的药物载体并形成了新的药物剂型，用于鬼臼毒素及其衍生物的运载和靶向定位，以提高鬼臼毒素及其衍生物的疗效，降低鬼臼毒素及其衍生物的毒性和不良反应。

本发明的一个方面，提供了固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物药物载体材料的应用。利用固体脂质纳米粒作为载体材料，生物相容性好，毒性低，具有缓释、靶向性、稳定、安全的特点，在体内可延长鬼臼毒素的循环时间，提高鬼臼毒素及其衍生物的生物利用率。

本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，它含有药物活性成分鬼臼毒素及其衍生物和作为药物载体材料的固体脂质纳米粒。

进一步的，上述的固体脂质纳米粒与鬼臼毒素的质量比为15～50∶1。

所述的固体脂质纳米粒的平均粒径为40～80nm。

上述固体脂质纳米粒的主要包括载体材料、乳化剂和表面活性剂。载体材料包括甘油酯类及脂肪酸类：甘油酯类包括三硬脂酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三肉豆范酸甘油酯、三月桂酸甘油酯及三俞酸甘油酯等；脂肪酸类包括硬脂酸、棕榈酸及癸酸等；乳化剂主要为磷脂类，包括卵磷脂、大豆卵磷脂和蛋黄磷脂等；表面活性剂包括非离子表面活性剂类、胆酸盐类和短链醇类等。

鬼臼毒素衍生物主要指去糖苷衍生物鬼臼乙叉苷(etoposide，VP16，又名依托泊苷)和鬼臼噻吩苷(teniposide，VM 26，又名特尼泊苷)如4甲基表鬼臼毒素。

上述的药物组合物，还可以含有药学上可接受的其他载体和添加剂，例如水、甘油、抗氧化剂等。可以根据需要制成各种剂型如溶液、片剂、胶囊等，本发明优选一种膜剂。药物组合物的给药方式可通过皮下，皮内，静脉注射等方式，也可以通过肌内注射或者输送到组织间隙来实现，也可以直接输送到病灶区。

本发明还提供了鬼臼毒素/鬼臼毒素衍生物-固体脂质纳米粒的制备方法，采用改造的微乳技术-乳化蒸发-低温固化法，工艺步骤如下：

(a)将鬼臼毒素/鬼臼毒素衍生物、载体材料和乳化剂溶解于有机溶剂，构成有机相；取表面活性剂溶于水中，构成水相；

(b)将有机相加入搅拌的70～80℃的水相，搅拌4h～6h；

(c)将步骤(b)中的产物混于一0～2℃的搅拌的水中，搅拌2h～4h，水的体积为步骤(b)中的溶液体积的2～10倍。。

其中，步骤(b)和(c)中水相的搅拌速度为600～1200r/min。

上述的有机溶剂为常规的溶剂，比如氯仿，丙酮、乙醇等。上述的乳化剂为卵磷脂、大豆卵磷脂及蛋黄磷脂中的一种。上述的表面活性剂可以是Poloxamer188(泊洛沙姆)、牛胆酸钠、甘胆酸钠、聚氧乙烯(100)硬脂酸酯(Myrj59)等。

固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物的载药体系，具有较好的稳定性，包封率高，释放曲线良好，为鬼臼毒素及其衍生物提供了一种理想的载药方式。

此外，由鬼臼毒素及其衍生物与固体脂质纳米粒制得的药物组合物具有广阔的应用前景，本发明制备的鬼臼毒素及其衍生物固体脂质纳米粒壳聚糖膜剂具有制备工艺简单，成本低，工艺参数容易控制的特点；而且生物相容性好、易生物降解、有成膜性、柔韧性等优点，还有一定的消炎、抗菌作用，提高了鬼臼毒素及其衍生物的药效。鬼臼毒素及其衍生物的固体脂质纳米粒在体内具备缓释功能，可延长鬼臼毒素的循环时间，减少重复用药的毒副作用，提高鬼臼毒素及其衍生物的生物利用率。

附图说明

图1鬼臼固体脂质纳米粒透射电镜图片

图2鬼臼固体脂质纳米粒透射电镜图片

图3鬼臼衍生物固体脂质纳米粒透射电镜图片

图4鬼臼固体脂质衍生物纳米粒的粒径分布图

图5细胞毒性实验图

图6鬼臼水溶液的紫外标准曲线

图7鬼臼固体脂质纳米粒的体外释药累积曲线

图8肿瘤细胞活性抑制实验图

具体实施方式

实施例1

取100mg的硬脂酸、丙酮5ml加入25ml具塞梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入100mg的卵磷脂氯仿液，加热使其溶解，构成有机相。另300mg的Myrj59溶于高纯水30ml中，构成水相。将有机相以6^#针头注入1000r/min搅拌的(75±2)℃的水相，继续搅拌约4h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml，将所得的半透明体系快速混于另一0～2℃的1000r/min搅拌的10ml的水相，继续搅拌2h，即得空白固体脂质纳米粒混悬液，体系定容至20ml。经粒径与行貌测定，所得空白固体脂质纳米粒混悬液为外观均一，稳定的胶体状分散体系，纳米粒子大小均一，分布均匀，平均粒径为50.4nm。

实施例2

取10mg鬼臼毒素、100mg的硬脂酸、丙酮5ml加入25ml具塞梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入100mg的卵磷脂氯仿液，加热使其溶解，构成有机相。另取200mg的Myrj59溶于高纯水30ml中，构成水相。将有机相以6^#针头注入1000r/min搅拌的(75±2)℃的水相，继续搅拌约4h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml，将所得的半透明体系快速混于另一0～2℃的1000r/min搅拌的10ml的水相，继续搅拌2h，即得鬼臼固体脂质纳米粒混悬液，体系定容至20ml。取鬼臼固体脂质纳米粒混悬液加高纯水稀释，用激光粒度仪测定纳米粒混悬液的粒径分布；取鬼臼固体脂质纳米粒混悬液适量加高纯水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2％的磷钨酸钠液负染，静置15分钟，在透射电镜下观察其粒径大小和形态，可得鬼臼固体脂质纳米粒的粒径分布图和TEM图，见图1、2、4。所得鬼臼固体脂质纳米粒混悬液为外观均一，稳定的胶体状分散体系，体系中可见略带蓝白色光泽的乳光带。纳米粒子大小均一，分布均匀，平均粒径为52.9nm。

实施例3

用实施例2中的方法得到鬼臼毒素衍生物固体脂质纳米粒混悬液，通过透射电镜图可以看出所得鬼臼毒素衍生物固体脂质纳米粒大小均一，分布均匀，平均粒径为54.4nm，见图3。

实施例4

细胞毒性测定采用四唑盐比色法(MTT Assay)。采用293T细胞，用含10％小牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养液，以2.5×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板中，每孔体积100μl。所用MTT(溴化-3-(4，5二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四唑)为Sigma公司产品，酶标仪ELX 800uv。

培养24h细胞贴壁生长后，每组3孔分别加入不同浓度的鬼臼毒素溶液、Poloxamer188为表面活性剂的鬼臼毒素固体脂质纳米粒悬混液(鬼PSLN)及Mrij59为表面活性剂的鬼臼毒素固体脂质纳米粒悬混液(鬼MSLN)，浓度分别为10，20，30，40，50μg/ml，及空白水溶液对照，培养24h后，每孔加入MTT溶液20μl，孵育4h后弃去上清液，每孔加入DMSO150μl终止反应。将培养板水平振荡30min，用酶联检测仪在490nm处测定吸收度，按下式计算细胞存活率：

细胞存活率％＝A490(样品)/A490(对照)×100％

其中A490(样品)为加入样品后的细胞吸收度，A490(对照)为空白水溶液对照的细胞吸收度。

实验结果如图5所示：鬼臼毒素溶液、鬼PSLN及鬼MSLN悬混液的细胞毒性分别随溶液浓度的增大而增大，鬼PSLN及鬼MSLN的细胞毒性均比同浓度的鬼臼毒素溶液细胞毒性小，由此可证明用固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素的载体可降低鬼臼毒素的毒性。

实施例5

用凝胶柱分离法结合紫外分光光度法对鬼臼固体脂质纳米粒的包封率进行测定。首先制备标准曲线，见图5。在波长为289nm，浓度范围5～25μg/ml内，鬼臼溶液的吸光度和浓度具有线性关系，得到回归方程为Abs＝10.24203*Conc+0.00323，r＝0.9997。取一定量的鬼臼固体脂质纳米粒混悬液用高速冷冻离心机离心后，将上清液上柱于Sephadex G50凝胶柱上，以高纯水为洗脱液，接取不同体积的洗脱部分，结合紫外分光光度计于289nm处测量吸光度(在此波长处，辅料无吸收干扰)，根据标准曲线计算鬼臼固体脂质纳米粒中游离鬼臼的含量，按下述公式计算包封率(EE％)。

EE％＝(W1-W2)/W1×100％

其中：W1-药物总量；W2-游离药物量。

三批鬼臼毒素经凝胶柱分离结合紫外分光光度法测得的包封率分别为77.50％、78.90％、78.50％，平均包封率为78.30％。结果见表1：

表1鬼臼固体脂质纳米粒包封率测定结果

W1(μg/ml)	W2(μg/ml)	包封率(％)	平均包封率(％)
				666625588	150132126	77.50％78.90％78.50％	78.30％

结果表明：固体脂质纳米粒对鬼臼毒素的包封率可达到78.3％，高于乳剂、毫微粒等常规载体材料对鬼臼毒素的包封率，达到了较高的水平。

实施例6

精密称取5mL鬼臼固体脂质纳米粒混悬液，放入处理过的透析袋中，透析袋两端夹紧至不渗漏；精密称取pH7.4磷酸盐缓冲释放液50ml，放入100mL烧杯中；将装药透析袋移入装有溶出介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封杯口；将烧杯置于恒温震荡器内，设置温度为(37±1)℃，水平震荡频率为150次/min。于2、4、6、8、12、16、20、24、28、32和36h取样，分别将烧杯内的溶出介质全部取出，再加入50ml新的同种介质继续恒温震荡。将取出的溶出介质溶液用紫外分光光度计测定鬼臼的浓度，计算药物的释放率，以累积释放率和时间的关系做出体外释药曲线。如图6所示。

从图7中可以观察到释放初期(2h)，有药物的突释现象(释放了药物总量的34.5％)，随后SLN中的药物呈持续释放，至36h药物的累积释放量为87.0％，从这一结果可以知道，SLN是一个药物与脂质的骨架结构，由于纳米粒比表面积很大，药物分子一部分吸附在纳米粒的表面，或者富集在纳米粒的外层，另一部分分散在脂质骨架中，形成固体溶液。外层的药物分子很快释放，从而产生的累积释放曲线初始阶段的药物突释现象。而此后，药物的释放主要是从固体骨架中的扩散，具有持续性和缓慢性的特点。至36h，药物仍然以比较恒定的速度从SLN中释放。而此时释放至释放介质中的药物，仍然维持在一个比较高的稳定性水平，表明被包裹在载体中的药物是稳定的。

实施例7

鬼臼毒素固体脂质纳米粒壳聚糖膜剂的制备方法

称取一定量的壳聚糖、明胶及相应的醋酸溶液与10ml蒸馏水于50ml烧杯内混合，将烧杯置于40℃的电热水浴箱中，将混合物均匀搅拌至壳聚糖及明胶溶解，形成淡黄色凝胶。将实施例2已制备的鬼臼毒素固体脂质纳米粒混悬液5ml加入凝胶，充分搅拌均匀，取一10cm×14cm的玻璃板，用75％的酒精均匀涂抹表面，待酒精未干，铺一层聚乙烯薄膜，将15ml凝胶置于薄膜上用流涎法制膜，置于37℃温箱干燥12h后成膜并起膜，用紫外线消毒30min。

实施例8

药物组合物的抗肿瘤活性试验：

采用EJ(膀胱癌)细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液，以2.5×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板中，每孔体积100μl。所用MTT(溴化-3-(4，5二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四唑)为Sigma公司产品，酶标仪Model 550 Microplate reader。

培养24h细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的鬼臼毒素溶液、鬼臼毒素固体脂质纳米粒悬混液及空白固体脂质纳米粒悬混液(浓度分别为5，2.5，1μg/ml)及空白和单培养液对照，每个样品4复孔，培养24h、48h后，每孔加入MTT溶液20μl，37℃孵育4h后弃去上清液，每孔加入DMSO 100μl终止反应。将培养板水平振荡30min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，计算对肿瘤细胞活性的抑制率。

实验结果如图8所示：(其中鬼臼24h/48指的是鬼臼毒素培养24/48小时，鬼臼-SLN24h/48指的是鬼臼毒素固体脂质纳米粒悬混液培养24h/48小时)鬼臼毒素溶液及鬼臼毒素固体脂质纳米粒悬混液随着浓度的增加，对肿瘤细胞活性的抑制率相应增加。当鬼臼毒素溶液浓度为5μg/ml时，抑制率24h为6.16％，48h达到48.55％；鬼臼毒素固体脂质纳米粒悬混液24h的抑制率为34.48％，48h可达到63.83％，这表明鬼臼毒素固体脂质纳米粒具备缓释放性能，具有更高的抑制率，可提高鬼臼毒素的药物利用率。

Claims (6)

1.一种药物组合物，其特征在于含有药物活性成分鬼臼毒素或者鬼臼毒素衍生物和固体脂质纳米粒。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于固体脂质纳米粒与鬼臼毒素的质量比为15～50∶1。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述的固体脂质纳米粒的平均粒径为40～80nm。

4.固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素及其衍生物药物载体材料的应用。

5.鬼臼毒素/鬼臼毒素衍生物-固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于含有如下的工艺步骤：

(a)将鬼臼毒素/鬼臼毒素衍生物、载体材料和乳化剂溶解于有机溶剂，构成有机相；取表面活性剂溶于水中，构成水相；

(b)将有机相加入搅拌的70～80℃的水相，搅拌4h～6h；

(c)将步骤(b)中的产物混于一0～2℃的搅拌的水中，搅拌2h～4h，水的体积为步骤(b)中的溶液体积的2～10倍。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(b)和(c)中水相的搅拌速度为600～1200r/min。

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