CN101011358A - 一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体，负载抗肿瘤药物紫杉醇，脂质材料由单甘酯和液态脂质组成，其中液态脂质占脂质材料的5－20％，紫杉醇为含药固体脂质纳米粒的3.1％－3.6％，粒径为481～532nm。本发明通过具有高效细胞摄取和细胞浆滞留功能的纳米结构脂质载体，对分子靶标位于细胞浆的抗肿瘤药物的包封，可大大增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的摄取，以及药物分子靶标部位的药物浓度。增加肿瘤细胞对药物的摄取，有利于减小药物在正常组织或细胞的分布，降低药物的毒副作用；而药物分子靶标部位的药物浓度的增加，有利于提高抗肿瘤药物的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及纳米结构脂质载体的制备和该米结构脂质载体在抗肿瘤治疗中的应用。
背景技术
肿瘤一直是直接威胁人类健康的重大疾病，肿瘤化疗由于药物本身缺乏分子靶向性，因而出现治愈率低、毒副作用巨大等重大治疗问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织(器官)、细胞和亚细胞器是解决癌症化疗治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过载体技术在肿瘤药物的组织(器官)和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子靶标位于细胞内，因此肿瘤细胞内药物分子靶标(亚细胞器)靶向性载体材料技术的研究开发是突破癌症化疗瓶颈的关键。
靶向载体设计的技术核心，主要包括载体的病灶脏器靶向性，以及在此基础上穿越病灶脏器内的细胞膜，完成针对药物分子靶标的亚细胞器靶向。当前，研究者利用肿瘤细胞表面某些受体(如叶酸受体)过度表达的特性，将配体修饰载体材料成功应用于肿瘤的组织(脏器)靶向治疗。亚细胞器靶向一直引人关注，它可以大幅度提高药物的靶向治疗效果。受载体材料及其器件设计理论与制造技术的制约，包括非病毒载体基因治疗在内，多年来一直没有获得突破性进展。
固体脂质给药系统是20世纪90年代初发展起来的新型胶体给药系统，它是继乳剂、脂质体、聚合物纳米粒之后，极具发展潜力的靶向控释给药系统。固体脂质给药系统采用天然或合成的类脂材料，如硬脂酸、卵磷脂、单甘酯等为载体，将药物包裹于类脂核中制成固体胶粒给药系统。它既具备聚合物给药系统控释、避免药物泄漏等优点，又兼具了乳剂、脂质体的毒性低、生物相容性好、生物利用度高的优点。但是，固体脂质给药系统也存在一些潜在的局限性，如有限的载药能力、储存过程的药物排挤现象等问题。
在固体脂质中混和形态相异的液体脂质作为混合类脂基质，以此制备得到新型纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carrier，NLC)。液体脂质的加入，可扰乱固体脂质规则的晶格结构，增加纳米粒结构中不规则晶型的比例，使承载脂溶性药物的空间容量增加，从而提高载体的载药能力。通过控制液体脂质比例，还可使NLC在体温下保持固体骨架结构，实现NLC药物的控制释放。
紫杉醇是从紫杉树皮中提取出来的新型天然抗肿瘤药物，其化学结构是紫杉烷类中一种四环二萜类化合物。它通过与细胞微管蛋白结合，促进微管聚合，抑制其解聚，使细胞有丝分裂受到阻断，从而抑制肿瘤生长。紫杉醇在甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中可溶，而在水中的溶解度小于0.03mg/mL。因此，尽管紫杉醇具有良好的抗肿瘤活性，但由于在水中的溶解度很小，使其静脉注射给药带来很大困难。为解决这一难题，人们在注射剂中加入了表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油(CremophorEL)。聚氧乙烯氢化蓖麻油虽能增加紫杉醇的水溶性。但会引起包括严重过敏反应在内的多种不良反应。将紫杉醇制成纳米粒给药系统，可以克服上述困难，提高生物利用度，增强靶向疗效。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体，该载体负载了抗肿瘤药物紫杉醇，其脂质材料由单甘酯和液态脂质组成，其中液态脂质(油酸)占脂质材料的比例为5-20％，紫杉醇为含药固体脂质纳米粒的3.1％～3.6％，该纳米结构脂质载体的粒径为481～532nm。该纳米结构脂质载体与紫杉醇溶液相比，可显著改善药物在细胞水平上的抗肿瘤疗效。
本发明的另一个目的是提供一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体的制备方法，具体通过以下步骤实现：
精密称取30mg脂质材料和1.5mg紫杉醇，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到负载紫杉醇的纳米结构脂质载体分散液。所得到负载紫杉醇的纳米结构脂质载体分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。即得得到负载紫杉醇的纳米结构脂质载体。
本发明的有益之处是：通过具有高效细胞摄取和细胞浆滞留功能的纳米结构脂质载体，对分子靶标位于细胞浆的抗肿瘤药物的包封，可大大增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的摄取，以及药物分子靶标部位的药物浓度。增加肿瘤细胞对药物的摄取，有利于减小药物在正常组织或细胞的分布，降低药物的毒副作用；而药物分子靶标部位的药物浓度的增加，有利于提高抗肿瘤药物的疗效。
附图说明
图1为负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的药物体外释放曲线。
图2为FITC标记含5％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的A549细胞摄取荧光倒置显微镜照片。
图3为FITC标记含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的A549细胞摄取荧光倒置显微镜照片。
图4为FITC标记含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的A549细胞摄取荧光倒置显微镜照片。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例做进一步的说明。
实施例1：负载紫杉醇含5％油酸的单甘脂纳米结构载体的制备与应用
1)负载紫杉醇含5％油酸的单甘脂纳米结构载体的制备
分别精密称取30mg脂质材料(油酸与单甘酯的比例为：0.5/9.5)和1.5mg紫杉醇，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到5％油酸含量的单甘酯纳米结构脂质载体分散液。所得到纳米结构脂质载体分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。即得到负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体。
表1为所制备得到的负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的粒径、表面电位和药物包封率等理化性质。
表1：负载紫杉醇纳米结构脂质载体的粒径、表面电位和药物包封率。
| 纳米结构脂质载体的油酸比例(％) | 粒径(nm) | 表面电位(-mV) | 药物包封率(％) | 载药量(％) |
| 5 | 481.3 | 46.6 | 64.4 | 3.1 |
| 10 | 561.7 | 37.4 | 68.7 | 3.3 |
| 20 | 531.4 | 36.5 | 75.6 | 3.6 |
负载紫杉醇纳米结构脂质载体的药物体外释放，通过以下方式实现：取离心得到的纳米结构脂质载体沉淀再分散到50mL PH7.4PBS(内含2M水杨酸钠)中，漩涡振荡3min，使纳米粒分散均匀，放入37℃水浴恒温振荡器中恒温振荡，振荡频率为60次·min-1。间隔一定时间(0、1、2、4、8、12、24、48h)吸取分散液1mL，20000r·min-1离心15min，上清液用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC测定续滤液中的药物浓度，其结果参见图1，图1为含5％，10％，15％油酸的负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的药物体外释放曲线。
2)单甘酯油酸纳米结构脂质载体的肺癌A549细胞转运
本发明采用含有异硫氰基荧光素(FITC)与硬脂胺化学嫁接物的油酸单甘酯纳米结构脂质载体进行肺癌A549细胞的转运研究。含有异硫氰基荧光素与硬脂胺化学嫁接物的油酸单甘酯纳米结构脂质载体通过以下方法制备：精密称取27mg脂质材料(油酸与单甘酯的比例分别为：0.5/9.5)和4.5mg异硫氰基荧光素与硬脂胺化学嫁接物，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到FITC标记油酸单甘酯纳米结构脂质载体的分散液。所得到FITC标记油酸单甘酯纳米结构脂质载体的分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。所得分散液用于肺癌A549细胞转运研究。
取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO2，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×105个细胞的密度接种于24孔培养板内，24孔培养板中的细胞贴壁生长后，加入FITC标记的油酸单甘酯纳米结构脂质载体(终浓度为100μg·mL-1)，孵育1，2，4，12，24h后，用PBS冲洗细胞3次，荧光倒置显微镜观察并拍照，结果显示在载体与A549细胞共孵育一小时后就可在细胞内观察到荧光，其中载体与A549细胞共孵育4和24小时后的结果分别见图2a和2b。
3)负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的抗肿瘤疗效
以肺癌A549细胞为模型，负载紫杉醇的油酸单甘酯纳米结构脂质载体给药系统的抗肿瘤疗效通过给药系统与细胞共孵育后的IC50值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTT Assay)测定。于24孔板预培养24h细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的空白含5％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的混悬液；不同浓度的紫杉醇溶液(溶剂为Cremophor：无水乙醇1∶1(V/V))和不同浓度的负载紫杉醇含5％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的混悬液，并设对照孔，每组重复3次；孵育48小时后，每孔加入MTT溶液60μL孵育4小时后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO500μL，终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(1)式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝A570(样品)/A570(对照)×100％ (1)
其中A570(样品)为加入混悬液后的细胞的吸收度，A570(对照)为空白对照的细胞的吸收度。
所测定的空白油酸单甘酯纳米结构脂质载体、紫杉醇溶液和负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的IC50值结果见表2。
表2：单甘酯油酸纳米结构脂质载体、紫杉醇溶液和负载紫杉醇单甘酯油酸纳米结构脂质载体的IC50值
| 给药系统 | 空白载体的IC50(μg/ml) | 给药系统的IC50(μg/ml) |
| 紫杉醇溶液含5％油酸纳米结构脂质载体含10％油酸纳米结构脂质载体 | /332.8315.2 | 1.720.690.25 |
| 含20％油酸纳米结构脂质载体 | 298.4 | 0.12 |
结果表明含5％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体为低毒性载体材料，紫杉醇经含5％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体包封后可提高2.5倍左右的抗肿瘤疗效。
实施例2：负载紫杉醇含10％油酸的单甘脂纳米结构载体的制备与应用
1)负载紫杉醇含10％油酸的单甘脂纳米结构载体的制备
分别精密称取30mg脂质材料(油酸与单甘酯的比例为：1/9)和1.5mg紫杉醇，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到10％油酸含量的单甘酯纳米结构脂质载体分散液。所得到纳米结构脂质载体分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。即得到负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体。
所制备得到的负载紫杉醇含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的粒径、表面电位和药物包封率等理化性质见表1。
负载紫杉醇含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的药物体外释放，通过以下方式实现：取离心得到的纳米结构脂质载体沉淀再分散到50mL PH7.4PBS(内含2M水杨酸钠)中，漩涡振荡3min，使纳米粒分散均匀，放入37℃水浴恒温振荡器中恒温振荡，振荡频率为60次·min-1。间隔一定时间(0、1、2、4、8、12、24、48h)吸取分散液1mL，20000r·min-1离心15min，上清液用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC测定续滤液中的药物浓度。其结果参见图1。
2)含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的肺癌A549细胞转运
本发明采用含有异硫氰基荧光素(FITC)与硬脂胺化学嫁接物的油酸单甘酯纳米结构脂质载体进行肺癌A549细胞的转运研究。含有异硫氰基荧光素与硬脂胺化学嫁接物的油酸单甘酯纳米结构脂质载体通过以下方法制备：精密称取27mg脂质材料(油酸与单甘酯的比例分别为：1/9)和4.5mg异硫氰基荧光素与硬脂胺化学嫁接物，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到FITC标记油酸单甘酯纳米结构脂质载体的分散液。所得到FITC标记油酸单甘酯纳米结构脂质载体的分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。所得分散液用于肺癌A549细胞转运研究。
取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO2，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×105个细胞的密度接种于24孔培养板内，24孔培养板中的细胞贴壁生长后，加入FITC标记的油酸单甘酯纳米结构脂质载体(终浓度为100μg·mL-1)，孵育1，2，4，12，24h后，用PBS冲洗细胞3次，荧光倒置显微镜观察并拍照，结果显示在载体与A549细胞共孵育一小时后就可在细胞内观察到荧光，其中载体与A549细胞共孵育4和24小时后的结果分别见图3a和3b。
3)负载紫杉醇含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的抗肿瘤疗效
以肺癌A549细胞为模型，负载紫杉醇的油酸单甘酯纳米结构脂质载体给药系统的抗肿瘤疗效通过给药系统与细胞共孵育后的IC50值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTT Assay)测定。于24孔板预培养24h细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的空白含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的混悬液；不同浓度的紫杉醇溶液(溶剂为Cremophor：无水乙醇1∶1(V/V))和不同浓度的负载紫杉醇含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的混悬液，并设对照孔，每组重复3次；孵育48小时后，每孔加入MTT溶液60μL孵育4小时后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO500μL，终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(1)式计算细胞存活率：
所测定的空白油酸单甘酯纳米结构脂质载体、紫杉醇溶液和负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的IC50值结果见表2
结果表明含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体为低毒性载体材料，紫杉醇经含10％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体包封后可提高6.9倍左右的抗肿瘤疗效。
实施例3：负载紫杉醇含20％油酸的单甘脂纳米结构载体的制备与应用
1)负载紫杉醇含20％油酸的单甘脂纳米结构载体的制备
分别精密称取30mg脂质材料(油酸与单甘酯的比例为：2/8)和1.5mg紫杉醇，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到20％油酸含量的单甘酯纳米结构脂质载体分散液。所得到纳米结构脂质载体分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。即得到负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体。
所制备得到的负载紫杉醇含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的粒径、表面电位和药物包封率等理化性质见表1。
负载紫杉醇含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的药物体外释放，通过以下方式实现：取离心得到的纳米结构脂质载体沉淀再分散到50mL PH7.4PBS(内含2M水杨酸钠)中，漩涡振荡3min，使纳米粒分散均匀，放入37℃水浴恒温振荡器中恒温振荡，振荡频率为60次·min-1。间隔一定时间(0、1、2、4、8、12、24、48h)吸取分散液1mL，20000r·min-1离心15min，上清液用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC测定续滤液中的药物浓度，其结果参见图1。
2)含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的肺癌A549细胞转运
本发明采用含有异硫氰基荧光素(FITC)与硬脂胺化学嫁接物的油酸单甘酯纳米结构脂质载体进行肺癌A549细胞的转运研究。含有异硫氰基荧光素与硬脂胺化学嫁接物的油酸单甘酯纳米结构脂质载体通过以下方法制备：精密称取27mg脂质材料(油酸与单甘酯的比例分别为：2/8)和4.5mg异硫氰基荧光素与硬脂胺化学嫁接物，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解。以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中。在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到FITC标记油酸单甘酯纳米结构脂质载体的分散液。所得到FITC标记油酸单甘酯纳米结构脂质载体的分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加0.1％泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0。所得分散液用于肺癌A549细胞转运研究。
取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO2，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×105个细胞的密度接种于24孔培养板内，24孔培养板中的细胞贴壁生长后，加入FITC标记的油酸单甘酯纳米结构脂质载体(终浓度为100μg·mL-1)，孵育1，2，4，12，24h后，用PBS冲洗细胞3次，荧光倒置显微镜观察并拍照，结果显示在载体与A549细胞共孵育一小时后就可在细胞内观察到荧光，其中载体与A549细胞共孵育4和24小时后的结果分别见图4a和4b。
3)负载紫杉醇含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的抗肿瘤疗效
以肺癌A549细胞为模型，负载紫杉醇的油酸单甘酯纳米结构脂质载体给药系统的抗肿瘤疗效通过给药系统与细胞共孵育后的IC50值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTT Assay)测定。于24孔板预培养24h细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的空白含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的混悬液；不同浓度的紫杉醇溶液(溶剂为Cremophor∶无水乙醇1∶1(V/V))和不同浓度的负载紫杉醇含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体的混悬液，并设对照孔，每组重复3次；孵育48小时后，每孔加入MTT溶液60μL孵育4小时后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO500μL，终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(1)式计算细胞存活率：
所测定的空白油酸单甘酯纳米结构脂质载体、紫杉醇溶液和负载紫杉醇油酸单甘酯纳米结构脂质载体的IC50值结果见表2。
结果表明含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体为低毒性载体材料，紫杉醇经含20％油酸的单甘酯纳米结构脂质载体包封后可提高14.3倍左右的抗肿瘤疗效。
Claims (3)
1.一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体，其特征是：负载抗肿瘤药物紫杉醇，其脂质材料由单甘酯和液态脂质组成，液态脂质占脂质材料的5-20％，紫杉醇为含药固体脂质纳米粒的3.1％-3.6％，粒径为481～532nm。
2.根据权利要求1所述的一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体，其特征是：液态脂质选用油酸。
3.根据权利要求1所述的一种具有高效抗肿瘤活性的纳米结构脂质载体，其特征是：通过以下步骤实现：
精密称取30mg脂质材料和1.5mg紫杉醇，置于3mL无水乙醇中，水浴70℃溶解，以蒸馏水为分散相，置70℃水浴中，在400r·min-1机械搅拌条件下，将有机相注入30mL分散相中，搅拌5min，得到负载紫杉醇的纳米结构脂质载体分散液，所得到负载紫杉醇的纳米结构脂质载体分散液用3mol·L-1HCl溶液调节pH至1.2，以20000r·min-1离心10min，沉淀加w/v为0.1％的泊洛沙姆再分散后，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至7.0，即得目的产物。
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