CN101352418B - 吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可用于注射和口服的盐酸吡柔比星或吡柔比星脂质纳米粒及其制备方法。它的特点是在表面活性剂的存在下，载体材料包裹盐酸吡柔比星或吡柔比星，制得粒径小、包封率高、稳定性好、毒性低的脂质纳米粒。本发明制备的脂质纳米粒能增强对癌细胞的靶向作用，提高吡柔比星对肿瘤细胞的抑杀作用，提高疗效。本发明涉及的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质纳米粒的多种制备方法，制备工艺简单，成本低廉，适合工业化大生产。

Description

吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及药品制剂领域，更具体地说涉及含有抗肿瘤活性成分盐酸吡柔比星或吡柔比星的脂质纳米粒及其制备方法。

背景技术

吡柔比星或其盐酸盐(又名：吡喃阿霉素；英文简写：THP)是1979年由日本微生物化学研究所梅泽滨夫教授等人研制开发成功的新一代蒽环类抗肿瘤抗生素，获日本化合物专利。

吡柔比星比阿霉素具有更广谱更为强烈的抗肿瘤作用，其主要机制是快速进入细胞内，嵌入DNA的双螺旋链，抑制DNA聚合酶α和β，阻止核酸合成，使肿瘤细胞中止于G₂期，不能进行细胞分裂，导致肿瘤细胞死亡。实验研究表明，吡柔比星对小鼠Lewis肺癌的转移，乳腺癌CCMT，实体瘤180、结肠癌Colon38、白血病P388等实验性肿瘤疗效显著。吡柔比星对多种肿瘤细胞作用等于或高于阿霉素，能有效的抗耐阿霉素的实验性动物肿瘤，对心脏毒性明显轻于阿霉素。吡柔比星的骨髓抑制，心脏毒性，脱发等毒性反应较阿霉素轻。与同类其它蒽环类药物多柔比星及表柔比星相比，对多数肿瘤(实体瘤、血液系统肿瘤)疗效基本相当。吡柔比星单用、联合用药或结合手术治疗，适用于多种癌症的治疗，如头颈部肿瘤、乳腺癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫癌、急性白血病和恶性淋巴瘤、肝癌、肺癌、胃癌等，是一个广谱抗肿瘤药物。但是一般的吡柔比星制剂对机体的正常组织和病灶无选择性，在治疗时，对正常组织造成伤害，因此普通吡柔比星的主要副作用表现为白细胞减少、血小板减少、贫血、恶心和呕吐等症状。

为了解决吡柔比星毒副作用大的问题，中国专利(200610081594.9、200510037263.0)发明了吡柔比星乳剂组合物以及吡柔比星脂质体，采用乳剂和脂质体的制剂形式改善吡柔比星的毒副反应。但是制备乳剂时使用大量乳化剂，增加了制剂的毒性；药物包封在脂质体中容易泄漏，稳定性比较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种性质稳定且可采用现有技术工业化生产的吡柔比星脂质纳米粒，以克服上述毒副作用大、稳定性差的问题

本发明的另一目的是提供该吡柔比星脂质纳米粒的制备方法。

本发明将吡柔比星包裹于脂质载体中，利用脂质载体的靶向性，降低药品的毒性，制成粒径小于1000nm的纳米粒又可以利用肿瘤组织的EPR效应，增加药物在肿瘤组织中的浓度，具有更好的抗肿瘤效用。

本发明所述的吡柔比星脂质纳米粒的组分含量(以重量份计)为：

吡柔比星或盐酸吡柔比星：       0.5～2份；

载体材料：                     5～100份；

表面活性剂：                   4～80份。

本发明组合物中所述的载体材料选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、卵磷脂、豆磷脂、单棕榈酸甘油酯、硬脂酸、棕榈酸、胆固醇、鲸蜡醇十六酸酯中的一种或一种以上的混合物。

本发明组合物中所述的表面活性剂选自胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠、甘油、异丙醇、泊洛沙姆108、泊洛沙姆188、吐温80、苄泽78中的一种或一种以上的混合物。

本发明所提供的吡柔比星脂质纳米粒，可通过以下方法制备：

1)称取0.5～2份的吡柔比星，5～100份载体材料溶于与水不混溶的有机溶剂中，加入到含有4～80份表面活性剂的水相中进行高速剪切(5000～30000rpm，5～300s)乳化，然后在40～70℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，200～500个大气压高压乳匀2次以上，即可得到脂质纳米粒分散体系；

2)称取5～100份的载体材料溶于与水不混溶的有机溶剂中，加入到含有0.5～2份盐酸吡柔比星和4～80份表面活性剂的水相中进行高速剪切5000～30000rpm，5～300s，乳化，然后在40～70℃的水浴中于旋转蒸发仪中去除有机溶剂，200—500个大气压高压乳匀2次以上，可得到脂质纳米粒分散体系；

3)称取0.5～2份的吡柔比星、5～100份载体材料溶于有机溶剂中，40～70℃的温度下，用旋转蒸发仪减压蒸干成膜，加入含4～80份表面活性剂的水溶液，超声分散300w，10～60分钟，即得脂质纳米粒混悬体系；

4)称取5～100份的载体材料溶于有机溶剂中，40～70℃的温度下，在旋转蒸发仪上减压蒸干成膜，加入0.5～2份含盐酸吡柔比星、4～80份表面活性剂的水溶液，超声分散300w，10～60分钟即得脂质纳米粒混悬体系。

上述制备方法1)和2)中所述的与水不混溶的有机溶剂为氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、环己烷或上述一种以上溶剂的混合溶剂；3)和4)中所述的有机溶剂为氯仿、乙醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或上述一种以上溶剂的混合溶剂。

也可将本发明的吡柔比星脂质纳米粒通过冷冻干燥工艺制成固体成品；为防止干燥工艺中固体脂质纳米粒的聚集需加入支架剂或保护剂，支架剂或保护剂可以选择氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖、蔗糖中的一种或一种以上的混合物。并可重新分散于脂质纳米粒固体产品重量的2～5倍介质中形成脂质纳米粒的混悬液。

本发明的吡柔比星脂质纳米粒能够以注射或口服方式给药，其中注射方式可以为静脉输注、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，优选静脉输注方式给予患者。

本发明提供的制备方法简单易操作，用常规的工艺设备可工业规模的生产，产品质量保持稳定，可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

取体重为18～22g、性别一致的昆明小鼠，进行盐酸吡柔比星脂质纳米粒和盐酸吡柔比星注射液的毒性比较试验。试验结果表明，盐酸吡柔比星注射液：LD50＝90mg±31mg/kg；盐酸吡柔比星脂质纳米粒：LD50＝250mg±25mg/kg，说明盐酸吡柔比星脂质纳米粒的毒性明显降低。

取荷瘤小鼠比较盐酸吡柔比星注射液、吡柔比星脂质纳米粒的体内抑瘤效果。实验结果表明，吡柔比星脂质纳米粒的抑瘤率分别为78.54％，盐酸吡柔比星注射液的抑瘤率为57.45％。上述数据表明脂质纳米粒能增强吡柔比星对肿瘤细胞的抑制作用，使之具有更强的抑瘤效果。

本发明的有益效果：

本发明公开的吡柔比星脂质纳米粒，将盐酸吡柔比星或吡柔比星包裹于脂质层中制备成粒径小于1000nm的纳米粒。由于它主要能被网状内皮系统的吞噬细胞所摄取，在网状内皮细胞较丰富的器官中集中，而在心脏和肾脏中的累积量比游离药物低得多，因此能大大降低它的毒性。此外，利用肿瘤组织的EPR效应，粒径小于1000nm的纳米粒能很容易地进入肿瘤组织内部释放药物而发挥作用。所以，吡柔比星脂质纳米粒在肿瘤治疗上具有更好的作用。

本发明提供的制备方法简单易操作，用常规的工艺设备可工业规模的生产，产品质量保持稳定，可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

通过实验表明：本发明的盐酸吡柔比星脂质纳米粒和盐酸吡柔比星注射液相比，盐酸吡柔比星脂质纳米粒的毒性明显降低。并且能增强吡柔比星对肿瘤细胞的抑制作用，使之具有更强的抑瘤效果。

附图说明

图1：本发明实施例15中电镜下观察纳米粒图片。

图2：本发明实施例19中体外释放曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1：

取20mg的吡柔比星、100mg硬脂酸溶于20ml二氯甲烷中，作为有机相，100mg泊洛沙姆108加入50ml水中作为水相，将有机相加到水相中进行高速剪切(6000rpm，100s)乳化，然后在60℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，300个大气压高压乳匀5次，即可得到脂质纳米粒分散体系。其平均粒径为120nm，占80％，全部粒子均在250nm以下，粒径分布狭窄，表明脂质纳米粒大小较为均一，该纳米粒悬液可在室温下稳定数天并在4℃下稳定12个月，贮存期间观察不到沉淀和吡柔比星的降解。

实施例2：

取10mg的吡柔比星、800mg卵磷脂溶于60ml氯仿中，作为有机相，250mg苄泽78加入80ml水中作为水相，将有机相加到水相中进行高速剪切(10000rpm，160s)乳化，然后在65℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，500个大气压高压乳匀10次，即可得到脂质纳米粒分散体系。其平均粒径为80nm，占80％，全部粒子均在140nm以下，粒径分布窄，表明脂质纳米粒大小较为均一，该纳米粒悬液可在室温下稳定数天并在4℃下稳定12个月。

实施例3：

取15mg的吡柔比星、600mg单硬脂酸甘油酯溶于50ml环己烷中，作为有机相，200mg胆酸钠加入100ml水中作为水相，将有机相加到水相中进行高速剪切(6000rpm，50s)乳化，然后在45℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，200个大气压高压乳匀4次，即可得到脂质纳米粒分散体系。其平均粒径为300nm，占70％，全部粒子均在500nm以下。该纳米粒悬液可在室温下稳定数天并在4℃下稳定12个月。

实施例4：

取900mg的双硬脂酸甘油酯溶于150ml环己烷与二氯甲烷(1：4)的混合溶剂中，加入到含有15mg盐酸吡柔比星和500mg去氧牛磺胆酸钠的水相200ml中，进行高速剪切(12000rpm，15s)乳化，然后在60℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，400个大气压高压乳匀8次，可得到脂质纳米粒分散体系。测得的平均粒径为300nm。

实施例5：

取80mg的单棕榈酸甘油酯溶于80ml氯仿与乙醚(3：2)的混合溶剂中，加入到含有15mg盐酸吡柔比星和50mg泊洛沙姆188的水相120ml中，进行高速剪切(8000rpm，10s)乳化，然后在60℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，400个大气压高压乳匀10次，可得到脂质纳米粒分散体系。测得的平均粒径为500nm。

实施例6：

称取10mg的吡柔比星、100mg鲸蜡醇十六酸酯溶于120ml的二氯甲烷中，40℃的温度下，用旋转蒸发仪减压蒸干成膜，加入50mg含吐温—80的水溶液100ml，超声分散(300w，40分钟)即得脂质纳米粒混悬体系。测得的平均粒径为500nm。

实施例7：

称取6mg的吡柔比星、100mg豆磷脂溶于150ml的乙酸乙酯中，40℃的温度下，用旋转蒸发仪减压蒸干成膜，加入80mg含牛磺胆酸钠的水溶液150ml，超声分散(300w，10分钟)即得脂质纳米粒混悬体系。测得的平均粒径为650nm。

实施例8：

称取18mg的吡柔比星、40mg棕榈酸溶于80ml的乙醇：二氯甲烷＝1：3的混合溶剂中，60℃的温度下，用旋转蒸发仪减压蒸干成膜，加入100mg含异丙醇：甘油＝3：2的水溶液120ml，超声分散(300w，30分钟)即得脂质纳米粒混悬体系。测得的平均粒径为750nm。

实施例9

称取200mg胆固醇：豆磷脂＝1：4的混合载体，溶于100ml的丙酮中，60℃的温度下，用旋转蒸发仪减压蒸干成膜，加入20mg盐酸吡柔比星和100mg泊洛沙姆108的水溶液80ml，超声分散(300w，30分钟)即得脂质纳米粒混悬体系。测得的平均粒径为550nm。

实施例10

称取120mg豆磷脂溶于100ml的丙酮中，60℃的温度下，用旋转蒸发仪减压蒸干成膜，加入10mg盐酸吡柔比星和100mg苄泽78的水溶液，超声分散(300w，30分钟)即得脂质纳米粒混悬体系。测得的平均粒径为550nm。

实施例11

取实施例2制备的脂质纳米粒分散体系，加入5g乳糖和2.5g甘露醇，加水稀释至100ml，经0.22μm的微孔滤膜过滤，置冷冻干燥机内冷冻干燥，-40℃预冻4小时，随后真空启动，按-30℃3小时，-10℃3小时，4℃1小时的升温程序升温，制备冻干粉针。使用前加冻干粉重量的2.5倍水分散配成脂质纳米粒混悬液注射使用。

实施例12

取实施例3制备的脂质纳米粒分散体系，加入5g葡萄糖、1g海藻糖和4g蔗糖，加水稀释至120ml，经0.22μm的微孔滤膜过滤，置冷冻干燥机内冷冻干燥，-40℃预冻3小时，随后真空启动，按-30℃2小时，-10℃2小时，4℃2小时的升温程序升温，制备冻干粉针。使用前加冻干粉重量的3倍水分散配成脂质纳米粒混悬液供注射使用。

实施例13

取实施例5制备的脂质纳米粒分散体系，加入3g阿拉伯胶和5g木糖醇，加水稀释至150ml，经0.22μm的微孔滤膜过滤，置冷冻干燥机内冷冻干燥，-40℃预冻3小时，随后真空启动，按-30℃2小时，-15℃4小时，0℃2小时的升温程序升温，制备冻干粉针。使用前加冻干粉重量的2倍水分散配成脂质纳米粒混悬液供注射使用。

实施例14

取实施例8制备的脂质纳米粒分散体系，加入5g山梨醇和4g果糖，加水稀释至200ml，经0.22μm的微孔滤膜过滤，置冷冻干燥机内冷冻干燥，-40℃预冻3小时，随后真空启动，按-20℃2小时，-5℃2小时，40℃2小时的升温程序升温，制备冻干粉针。使用前加冻干粉重量的2.5倍水分散配成脂质纳米粒混悬液供注射使用。

实施例15

取实施例2中所述的吡柔比星固体脂质纳米粒进行理化性质研究。

取吡柔比星脂质纳米粒混悬液适量，加水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，在透射电镜下观察纳米粒形态并拍摄照片。另取吡柔比星脂质纳米粒样品，加水稀释到适量，用激光散射粒度测定仪在温度25℃，波长633.0nm条件下的粒径。电镜下观察纳米粒呈类球形实体粒子，且粒径均匀，无聚集粘联现象发生。见图1。实验测得的吡柔比星粒径分布较窄，其平均粒径为80nm，占80％，全部粒子均在140nm以下，表明脂质纳米粒大小较为均一。

实施例16

取实施例1的吡柔比星脂质纳米粒加适量蒸馏水稀释，制成1mg/ml的溶液，在4℃，25℃和37℃放置，于6、12、18、24、30、36天离心收集沉淀，用HPLC法测定吡柔比星含量。

测定结果见表1。

表1：吡柔比星终浓度

 

	0天	6天	12天	18天	24天	30天	36天
								4℃	1	0.99	0.99	0.99	0.98	0.98	0.97
25℃	1	0.98	0.98	0.97	0.93	0.89	0.85
								37℃	1	0.97	0.9	0.85	0.78	0.7	0.56

结果表明，吡柔比星固体脂质纳米粒在4℃放置一个月，含量基本不变；在室温条件下存放两周，含量基本不发生改变；在37℃放置6天，浓度仅下降3％左右，放置12天，浓度变化10％，在环境温度不高于37℃的情况下，该纳米粒能保持12天的稳定性，表明吡柔比星固体脂质纳米粒稳定性好。

实施例17

取实施例7的脂质纳米粒进行刺激性或溶血性实验。

家兔股四头肌注射吡柔比星脂质纳米粒、放血处死后，观察注射部位肌肉组织变化情况。配制2％的兔红细胞悬液，加入吡柔比星脂质纳米粒，观察其对红细胞的影响。

结果表明，吡柔比星脂质纳米粒的家兔肌肉刺激性反应在2级以下。吡柔比星脂质纳米粒在观察时间内无溶血凝聚现象，说明吡柔比星脂质纳米粒适宜静脉、皮下注射给药。

实施例18

吡柔比星脂质纳米粒包封率测定

包封率通过葡聚糖凝胶柱层析法测定。层析条件为：Sephadex—G50柱(16cm×2cm)，洗脱液为蒸馏水，流速1mL/min，室温下层析。移取纳米粒混悬液0.5mL上柱，以柱层析条件洗脱，每3mL收集1次，被包封药物量采用高效液相色谱测定。

包封率＝(M包/M总)×100％。

M包表示被纳米粒包封的药物量，M总表示固体脂质纳米粒制剂中的总含药量。

测定结果见表2。

表2：包封率测定数据

 

样品	包封率(％)	载药量(％)
			实施例6	90.16	5.12
实施例9	89.45	5.48
			实施例10	84.58	5.00

实施例19

实施例13所述的盐酸吡柔比星脂质纳米粒冻干制剂体外释药研究。

取盐酸吡柔比星脂质纳米粒冻干制剂适量(相当于盐酸吡柔比星5mg)，精密加入蒸馏水5ml溶解后，转入经处理后的透析袋中，系紧透析袋两端，悬置在盛有含30％乙醇水溶液100ml的小杯中，介质温度为37±0.5℃，转速为50rpm。在不同时间内定量取1ml释药介质，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，采用高效液相色谱测定盐酸吡柔比星的浓度，并计算累计释放百分率。体外释放曲线见图2。

结果表明，在释放条件下，前10小时释药速率较快，随后释放速度减慢，经过48小时药物释放约80％。

实施例20

使用实施例7中所述的制剂评价吡柔比星脂质纳米粒和盐酸吡柔比星注射液的体内抑瘤效果。

将前肢腋皮下接种H22肿瘤后约10天、肿瘤实体长至重约1g时的荷瘤小鼠随机分为空白给药对照组、盐酸吡柔比星注射液组、吡柔比星脂质纳米粒组，尾静脉注射剂量分别为4mg/kg的吡柔比星，1次/天，连续5天。末次给药后4h同时处死，剖取实体瘤，称瘤重，计算抑瘤率。按抑瘤率＝(1—给药后小鼠平均瘤重/空白对照组小鼠平均瘤重)×100％计算。抑瘤率分别为78.54％(吡柔比星脂质纳米粒)，57.45％(盐酸吡柔比星注射液组)。上述数据表明脂质纳米粒能增强吡柔比星对肿瘤细胞的抑制作用，使之具有更强的抑瘤效果。

实施例21

利用实施例5中所述的制剂评价盐酸吡柔比星脂质纳米粒的毒性试验。

取体重18～22g性别一致的昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，一次静脉注射盐酸吡柔比星脂质纳米粒，组间剂量按等比级数排列，比值1:0.8观察并记录给药10d内各组动物的反应和死亡率，用简化机率单位法计算LD，其95％的可信限为：

盐酸吡柔比星注射液      LD50＝90mg±31mg/kg，

盐酸吡柔比星脂质纳米粒  LD50＝250mg±25mg/kg。

实验结果表明，盐酸吡柔比星脂质纳米粒的LD50值大于盐酸吡柔比星注射液，它的毒性明显降低。

Claims (6)

1.一种盐酸吡柔比星或吡柔比星的脂质纳米粒，以重量份数计，由下述配方组成：

吡柔比星或盐酸吡柔比星：0.5～2份；

载体材料：              5～100份；

表面活性剂：            4～80份；

所述载体材料选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、卵磷脂、豆磷脂、单棕榈酸甘油酯、硬脂酸、棕榈酸、胆固醇、鲸蜡醇十六酸酯中的一种或多种；

所述表面活性剂选自胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠、甘油、异丙醇、泊洛沙姆108、泊洛沙姆188、吐温80、苄泽78中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述的脂质纳米粒的粒径小于1000nm。

3.如权利要求1所述的脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

称取5～100份的载体材料溶于与水不混溶的有机溶剂中，加入到含有0.5～2份盐酸吡柔比星和4～80份表面活性剂的水相中进行高速剪切5000～30000rpm，5～300s，乳化，然后在40～70℃的水浴中用旋转蒸发仪去除有机溶剂，200-500个大气压高压乳匀2次以上，得到脂质纳米粒分散体系。

4.根据权利要求3所述的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的与水不混溶的有机溶剂为氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、环己烷中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，进一步向所得的脂质纳米粒混悬或分散体系中加入支架剂或保护剂，采用冷冻干燥将脂质纳米粒制成固体制品。

6.根据权利要求5所述的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的支架剂或保护剂选自氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖、蔗糖中的一种或多种。

Images