CN104372053A

CN104372053A - 一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用

Info

Publication number: CN104372053A
Application number: CN201410549291.XA
Authority: CN
Inventors: 焦绪栋; 秦松
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2014-10-16
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明涉及藻蓝蛋白类荧光蛋白质领域，具体为一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用。本发明通过将链霉亲和素合成基因、藻蓝蛋白亚基合成基因、催化酶合成基因、色基合成基因重组于同一表达质粒中，实现多基因的组合表达，通过对诱导、纯化条件的优化，制备具备稳定荧光活性的融合蛋白。采用单一质粒完成荧光活性融合藻胆蛋白的组合表达，避免了多质粒在工程菌株中的稳定性及各基因表达的不同步问题，减少发酵过程中的抗生素的使用。本发明的方法有效提高了荧光蛋白质的稳定性，同时大幅降低了藻蓝蛋白类荧光标记制剂的制作成本。在生物医学领域，尤其在荧光探针的生产方面具有良好的实用价值和应用前景。

Description

一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用

技术领域

本发明涉及藻蓝蛋白类荧光蛋白质领域，具体为一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用。

背景技术

藻胆蛋白作为荧光标记物具有以下优点：稳定性好，易保存，pH4～11光谱无明显的变化，色基多，吸光能力强，荧光量子产率高，荧光强度为荧光素的14.5倍。荧光位于橙红区(550～700nm)，背景干扰少，斯托克位移大(荧光素小于30nm，藻胆蛋白大于80nm)，等电点在pH4.7～5.3，在生理溶液中带负电荷，非特异性的吸附极少，分子表面-SH、-NH2等活性基团多，易交联等。因此，藻胆体和藻胆蛋白可制成荧光制剂，用于临床医学诊断，免疫化学和生物工程等研究领域中。目前藻胆蛋白类荧光探针的应用领域包括荧光激活细胞分类，流式细胞荧光测定，荧光免疫检测以及单分子检测等多项技术领域，但在检测可溶性抗原抗体方面，藻胆蛋白荧光探针的试剂化、商品化的程度还不是很高。

常规的藻胆蛋白类荧光探针的制备方法是化学交联，依赖藻胆蛋白类分子表面存在着的很多的赖氨酸残基，使用交联剂(如SPDP、戊二醛等)将赖氨酸残基侧链的ε-氨基与其它的生物大分子共价结合在一起，实现蛋白质分子间的共价交联。通过这种交联的方式可以制成藻胆蛋白-亲和素、藻胆蛋白-单抗、藻胆蛋白-藻胆蛋白等多种交联产物，且共价交联物仍会保留着两种交联物本身的生物学活性。如：藻红蛋白与藻蓝蛋白的共价交联物，仍会保留着这两种色素蛋白的光谱性质，再用这种交联物去标记抗体或抗原，就能同时利用这两种蛋白的光谱特性，这两种蛋白的交联体能有效的增大其荧光发射的斯托克斯位移，提高检测的灵敏度。藻胆蛋白共价交联需要较高的技术条件，要摸索简便、快捷、稳定的交联方法,使用性质温和的交联剂，并且在进行高效交联的同时，还要使交联剂对蛋白质分子的结构和功能破坏达到最小。

目前国内类似研究及专利中，均采用多质粒系统，将涉及藻蓝蛋白及藻胆色素合成与催化的多个基因克隆至不同的表达载体中，通过共转化使基因在同一菌株或不同菌株中合成。这种方法在实际操作中容易造成质粒的丢失，各基因的表达量难以实验同步控制，从而使得融合蛋白的荧光及生物活性降低或不稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用，采用单一质粒完成荧光活性融合藻胆蛋白的组合表达，避免了多质粒在工程菌株中的稳定性及各基因表达的不同步问题，减少发酵过程中的抗生素的使用。

本发明的技术方案是：

一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括如下步骤：

(1)用基因工程的方法，将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白亚基基因(cpcA)或其同源或类似基因与核心链霉亲和素基因(sa)或其同源或其他标签基因利用蛋白linker连接，与藻蓝蛋白裂合异构酶E和F编码基因(cpcE和cpcF)或其同源基因克隆至同一启动子下；将血红素加氧酶1基因(hox1)或其同源基因、藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)或其同源基因置于另一启动子下，构建表达质粒pAC；

(2)将步骤(1)所述的表达质粒pAC转入相应的宿主菌，得到工程菌株BAC；利用常规的发酵工程方法培养，利用优化的诱导条件进行重组蛋白的诱导表达，采用优化的制备方法进行融合蛋白的纯化制备；

步骤(2)的诱导条件为，诱导剂为IPTG、乳糖、半乳糖中的一种或两种以上，诱导剂的终浓度为0.1～5.5mmol/L，诱导温度为18～25℃，诱导时间为8～24h；

步骤(2)的蛋白纯化制备方法为，冰浴超声破碎、硫酸铵分级沉淀，蛋白亲和层析柱纯化。

所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，融合蛋白质分子量为33kDa，具备荧光活性。

所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，BAC摇瓶培养和重组蛋白的诱导表达具体过程如下：

按照常规摇瓶培养条件，添加不同碳源，将BAC培养至对数生长前期；分别添加终浓度为0.2、1mmol/L的诱导剂，18～37℃、100～350rpm诱导表达8h，收集细胞，观察细胞沉淀的颜色变化。

所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，摇瓶培养的培养基中添加占所述培养基重量0.4％甘油或1％葡萄糖，选择28℃时，加入终浓度为5.5mmol/L乳糖的诱导剂。

所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，重组蛋白质的纯化制备过程如下：

重组蛋白含有组氨酸标签，使用镍亲和层析柱进行蛋白纯化；将BAC诱导表达后，用变性缓冲液：20～50mM的Tris-HCl缓冲液，8M的尿素Urea，pH7.3～8.3，0.15M(mol/L)的NaCl，余量为PBS磷酸缓冲盐液，进行破碎，室温破碎15～30min，离心，上清液经0.45μm的滤膜过滤后，用镍柱进行亲和纯化；经SDS-PAGE分析，纯化后的重组蛋白用10L的0.1M的TAKARA磷酸盐缓冲液，4℃梯度透析48h；纯化后的重组蛋白质只有一条目的带，大小与预期一致。

所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的应用，该藻蓝蛋白类荧光蛋白质应用于生物医学领域，尤其应用于荧光探针的生产方面。

本发明的设计思想是：

本发明利用生物工程菌株稳定生产具有生物素结合能力和荧光活性的融合链霉亲和素的藻蓝蛋白α亚基的方法，通过将链霉亲和素合成基因、藻蓝蛋白亚基合成基因、催化酶合成基因、色基合成基因重组于同一表达质粒中，实现多基因的组合表达，通过对诱导、纯化条件的优化，制备具备稳定荧光活性的融合蛋白。将链霉亲和素和藻蓝蛋白融合表达，在理论上说，融合后的蛋白质包含链霉亲和素-生物素系统的生物信号放大功能和藻胆蛋白的荧光特性，从而避免常规的化学交联，为开发绿色、安全、无污染的新型免疫荧光探针提供条件。

本发明的优点及有益效果是：

本发明的方法有效提高了荧光蛋白质的稳定性，同时大幅降低了藻蓝蛋白类荧光标记制剂的制作成本。在生物医学领域，尤其在荧光探针的生产方面具有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1.表达质粒pAC构建酶切鉴定电泳图谱。其中：1、DNA Marker；2、pAC质粒经BamHl酶切后的片段，箭头所指为目的条带。

图2.目的蛋白诱导SDS-PAGE图。其中：1、蛋白marker；2、BAC诱导后菌体超声破碎后沉淀中的蛋白质；3、BAC诱导后菌体超声破碎后的上清液中的蛋白质；4、BAC诱导后的菌体总蛋白质；5、未经诱导的BAC总蛋白质，箭头所指为目的蛋白质。

图3.纯化后的重组蛋白SDS-PAGE图。其中：1、蛋白marker；2、BAC诱导后的菌体总蛋白质；3、纯化后的目的蛋白质。

图4.融合蛋白AC的荧光发射光谱图。

具体实施方式

在具体实施方式中，本发明利用生物工程菌株稳定生产具有生物素结合能力和荧光活性的融合链霉亲和素的藻蓝蛋白α亚基的方法，采用基因工程的方法，将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白亚基基因(cpcA)或其同源或类似基因与核心链霉亲和素基因(sa)或其同源或其他标签基因利用蛋白linker连接，与藻蓝蛋白裂合异构酶E和F编码基因(cpcE和cpcF)或其同源基因克隆至同一启动子下；将血红素加氧酶1基因(hox1)或其同源基因、藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)或其同源基因置于另一启动子下，构建表达质粒pMAC。

将所述的表达质粒pAC转入相应的宿主菌(如：大肠杆菌BL21(DE3))，得到工程菌株BAC。利用常规的发酵工程方法培养，利用优化的诱导条件进行重组蛋白的诱导表达，采用优化的制备方法进行融合蛋白的纯化制备。所述的诱导条件，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、乳糖、半乳糖中的一种或两种以上，诱导剂的终浓度为0.1～5.5mmol/L(mM)，诱导温度为18～25℃，诱导时间为8～24h。所述的融合蛋白质分子量为33kDa，具备荧光活性，在荧光分子探针的开发方面具有良好的应用前景。

本发明中，所述的终浓度是指：加入某种物质形成溶液后，所述得该物质的最终浓度。

下面通过附图和实施例对本发明进一步详细描述。

实施例1：基因工程菌株的构建

根据国际基因数据库中的信息，参照中国发明专利：一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法(公开号：CN101838661A)，克隆用于表达质粒构建的各种基因。将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白亚基基因(cpcA)、核心链霉亲和素基因(sa)、藻蓝蛋白裂合异构酶E和F编码基因(cpcE和cpcF)克隆至同一启动子下；将血红素加氧酶1基因(hox1)或其同源基因、藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)或其同源基因置于另一启动子下，构建表达质粒pAC，经过常规酶切检测和测序分析，质粒构建正确(图1)。将pAC转入宿主菌BL21(DE3)中，得到基因工程菌株BAC。经过常规基因检测和测序验证，各种基因在质粒中正确连接。

藻蓝蛋白类脱辅基蛋白亚基基因(cpcA)、藻蓝蛋白裂合异构酶E和F编码基因(cpcE和cpcF)、血红素加氧酶1基因(hox1)，藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)来自Synechocystis sp.PCC6803，核心链霉亲和素基因(sa)参照GeneBankKF378616.1合成制得。

实施例2：BAC摇瓶培养和重组蛋白的诱导表达

按照常规摇瓶培养条件，添加不同碳源，将BAC培养至对数生长前期。分别添加终浓度为0.2、1mmol/L的诱导剂，18～37℃、100～350rpm诱导表达8h，收集细胞，观察细胞沉淀的颜色变化。由表1可知，培养基中添加占所述培养基重量0.4％甘油(或1％葡萄糖)，选择28℃时，加入终浓度为5.5mmol/L乳糖的诱导剂时，目的蛋白的表达量最好。但SDS-PAGE分析发现重组蛋白大部分以包涵体形式存在沉淀中(图2)。

表1 不同种类和浓度的诱导剂对目的蛋白表达的影响

温度(℃)	诱导剂	含量(mmol/L)	碳源添加	菌体的颜色
					37	IPTG	0.2	--	黄色
37	IPTG	1	0.4％甘油	浅蓝
					37	乳糖	5.5	--	蓝色
28	IPTG	0.2	0.4％甘油	浅蓝
					28	IPTG	0.2	1％葡萄糖	浅蓝
28	乳糖	5.5	--	蓝色

实施例3：重组蛋白质的纯化制备

重组蛋白含有组氨酸标签，使用镍亲和层析柱进行蛋白纯化。具体操作步骤为：将BAC诱导表达后，用变性缓冲液(20～50mM的Tris-HCl缓冲液，8M(mol/L)的尿素Urea，pH7.3～8.3，0.15M(mol/L)的NaCl，余量为PBS磷酸缓冲盐液)破碎，室温破碎15～30min，离心，上清液经0.45μm的滤膜过滤后，用镍柱进行亲和纯化。经SDS-PAGE分析，纯化后的重组蛋白用10L的0.1M的磷酸盐缓冲液(TAKARA)，4℃梯度透析48h。纯化后的重组蛋白质只有一条目的带，大小与预期一致(图3)。

实施例4：重组蛋白的活性测定

利用荧光分光光度计，测试其荧光发射光谱。由图4可知，融合蛋白在625nm光激发下，在640nm处的有最大荧光发射峰，表明制备的链霉亲和素与藻蓝蛋白亚基具备一定的荧光活性。

实施例结果表明，本发明的方法采用单一质粒完成荧光活性融合藻胆蛋白亚基的组合表达，避免了多质粒在工程菌株中的稳定性及各基因表达的不同步问题，减少发酵过程中的抗生素等选择压力的使用。优化后的诱导条件和蛋白纯化制备方法进一步降低了该类荧光蛋白质的生产成本，提高了生产效率，具有较好的应用前景。

Claims

1.一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.按照权利要求1所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于，融合蛋白质分子量为33kDa，具备荧光活性。

3.按照权利要求1所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于，BAC摇瓶培养和重组蛋白的诱导表达具体过程如下：

4.按照权利要求3所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于，摇瓶培养的培养基中添加占所述培养基重量0.4％甘油或1％葡萄糖，选择28℃时，加入终浓度为5.5mmol/L乳糖的诱导剂。

5.按照权利要求1所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于，重组蛋白质的纯化制备过程如下：

重组蛋白含有组氨酸标签，使用镍亲和层析柱进行蛋白纯化；将BAC诱导表达后，用变性缓冲液：20～50mM的Tris-HCl缓冲液，8M的尿素Urea，pH 7.3～8.3，0.15M(mol/L)的NaCl，余量为PBS磷酸缓冲盐液，进行破碎，室温破碎15～30min，离心，上清液经0.45μm的滤膜过滤后，用镍柱进行亲和纯化；经SDS-PAGE分析，纯化后的重组蛋白用10L的0.1M的TAKARA磷酸盐缓冲液，4℃梯度透析48h；纯化后的重组蛋白质只有一条目的带，大小与预期一致。

6.一种权利要求1所述的生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的应用，其特征在于：该藻蓝蛋白类荧光蛋白质应用于生物医学领域，尤其应用于荧光探针的生产方面。