CN104370870B - 一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法，属于原花青素分离制备技术领域。本发明以半野生荔枝品种‘褐毛荔’为原料，经超声提取，固相萃取柱去糖，凝胶树脂梯度洗脱，旋转蒸发，最后得到纯度≥75%的原花青素粉末。本发明方法加工工艺简单，耗能较少。提取过程的有机溶剂可回收利用，不产生有机污染。提取过程中使用的固相萃取柱及凝胶树脂均可反复利用，节省成本。所得的原花青素粉末抗氧化性能强，因聚合度较低，易于人体吸收。本发明对于荔枝资源的合理利用，以及提高荔枝产品附加值具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，涉及一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法。
背景技术
原花青素Proanthocyanidins（PC），是一类由不同数量的儿茶素、表儿茶素或没食子酸缩合而成的特殊分子结构的生物类黄酮。原花青素具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抑菌消炎、增强心脑血管活性等多种生物活性和药理作用。目前商品化的原花青素主要来源于与葡萄籽和松树皮中。而从荔枝果肉中提取原花青素尚无报道，荔枝果肉中原花青素的提取和分离研究对于荔枝资源的合理利用，以及提高荔枝产品附加值具有重大意义。
荔枝（LitchichinensisSonn.），患子科荔枝属植物，原产我国南方地区。‘褐毛荔’是在云南发现的一个半野生品种，与普通栽培品种相比，‘褐毛荔’具有早熟、座果率高、丰产性好、耐粗放管理的特点。‘褐毛荔’果肉含有丰富的原花青素物质，鉴于原花青素多种多样的生物活性，使其具有广泛的市场前景。
现有从刺梨果肉中制备原花青素的方法，如2012年10月10日公布的公开号CN102718737A
“一种用刺梨果肉制备刺梨原花青素的方法”中，公开的方法是：以刺梨果肉为原料，经榨汁机榨汁，超滤器重复超滤除去大分子多糖与蛋白质，大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，反渗透器浓缩、真空浓缩机浓缩、喷雾干燥机130-150℃干燥，最终得到原花青素粉末。该方法主要缺点是：（1）操作步骤过多，容易造成原花青素损失；操作过程有高温步骤，容易造成原花青素发生氧化，产品质量降低。（2）制备过程使用了超滤器、反渗透器、真空浓缩机、喷雾干燥机多种耗电设备，使得制备成本升高。
发明内容
本发明的目的是针对现有原花青素原料资源有限及高效制备技术不足，提供一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法，通过以下步骤实现：
（1）将荔枝果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分，将冷冻干燥后的荔枝果肉用磨样机打磨成粉末状；所述的荔枝品种为‘褐毛荔’；
（2）以浓度为70%的甲醇溶液超声提取30min，料液比为1:8，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液；
（3）上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味的浓缩液为止；
（4）浓缩液过固相萃取柱，用5倍柱床体积的水洗去糖，5倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液45℃条件下旋蒸至粉末；固相萃取柱型号为WatersOasisHLB20cc（1g），上样及洗脱流速均为2ml/min；
（5）将得到的粉末溶于尽量少的水中，使用凝胶树脂进行梯度洗脱；凝胶树脂为SephadexLH-20，凝胶树脂装柱体积为40ml（5×40mm）或300ml(16×400mm)。梯度洗脱液分别为水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇。梯度洗脱流速为1ml/min。梯度洗脱体积为3倍柱床体积。
（6）将40、50、60、100%洗脱液45℃条件下旋蒸，得到干燥的原花青素。使用高效液相或液质确定各部分洗脱液是否为原花青素。
本发明的另一个目的是提供所述方法在从荔枝果肉中提取原花青素中的应用。
本发明以半野生荔枝品种‘褐毛荔’为原料，经超声提取，固相萃取柱去糖，凝胶树脂梯度洗脱，旋转蒸发，最后得到纯度≥75%的原花青素粉末。本方法加工工艺简单，耗能较少，不涉及高温步骤及喷雾干燥仪等高能耗设备，提取过程的有机溶剂可回收利用，不产生有机污染。提取过程中使用的固相萃取柱及凝胶树脂均可反复利用，节省成本。所得的原花青素粉末抗氧化性能强，因聚合度较低，易于人体吸收。本发明对于荔枝资源的合理利用，以及提高荔枝产品附加值具有重大意义。
附图说明
图1为褐毛荔果肉粗提物核磁共振（13C）检测图谱。
图2为褐毛荔果肉粗提物液质检测图谱。
图3（A-E）为高效液相检测图谱，检测波长为280nm，其中A为‘褐毛荔’粗提物高效液相图谱，B、C、D、E分别为40%、50%、60%、100%甲醇洗脱部分高效液相图谱。
图4（A-D）为液质检测图谱，其中A、B、C、D分别为40%、50%、60%、100%甲醇洗脱部分质谱检测图谱。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一
1、纯化材料的选择
经冷冻干燥的褐毛荔果肉，用磨样机粉碎打成细小的粉末。准确称取1g的冷冻干燥粉末，用8ml的浓度为70%的甲醇水溶液超声提取30min，8000r/min条件下离心10min，收集上清液。此步骤再重复2次后合并上清液定容至24ml。以原元花青素B2为标准液，以稀释合理倍数的上清液为待测液，用DMAC（二甲基乙酰胺）法检测待测液的元花青素含量。结果表明，32个荔枝品种中，褐毛荔原花青素含量最高（参见表1）。
2、本发明从褐毛荔果肉中提取原花青素的方法及步骤
将冷冻干燥后的‘褐毛荔’果肉粉末30g置于240ml70%甲醇溶液中超声提取30min，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液。上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味，浓缩液过WatersOasisHLB20cc（1g）固相萃取小柱（1个），100ml的水洗去糖，100ml的甲醇洗脱。甲醇洗脱液45℃条件下旋蒸，得棕色干燥粉末0.26g，经过核磁共振（13C）（参见图1）和质谱检测（参见图2），证明次粗提物富含原花青素类物质。将0.26g粉末溶于1ml水中，使用SephadexLH-20凝胶树脂进行梯度洗脱，柱床体积为40ml（5×40mm）。梯度洗脱液分别为水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇各120ml。HPLC检测后（参见图3），将含有原花青素的40、50、60、100%洗脱液45℃条件下旋蒸，共得到富含原花青素的粗提物152.0mg，质谱共鉴定出32种原花青素，聚合度为2-6（参见表2和图4）,纯度为76.9%。
实施例二
将冷冻干燥后的‘褐毛荔’果肉粉末200g置于1600ml70%甲醇溶液中超声提取30min，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液。上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味，浓缩液过WatersOasisHLB20cc（1g）固相萃取小柱（6个），每个小柱用100ml的水洗去糖，100ml的甲醇洗脱。甲醇洗脱液45℃条件下旋蒸，得棕色干燥粉末2.5g。将2.5g粉末溶于5ml水中，使用SephadexLH-20凝胶树脂进行梯度洗脱，柱床体积为300ml（16×400mm）。梯度洗脱液分别为水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇各900ml。HPLC检测后将含有原花青素的40、50、60、100%洗脱液45℃条件下旋蒸，共得到富含原花青素的粗提物837.8mg，聚合度为2-6，纯度为81.8%。
实施例三
将冷冻干燥后的‘褐毛荔’果肉粉末300g置于1800ml70%甲醇溶液中超声提取30min，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min。取上清液。此步骤重复3次，合并上清液。上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味，浓缩液过WatersOasisHLB20cc（1g）固相萃取小柱（10个），每个小柱用100ml的水洗去糖，100ml的甲醇洗脱。甲醇洗脱液45℃条件下旋蒸，得棕色干燥粉末3.2g。将3.2g粉末溶于10ml水中，使用SephadexLH-20凝胶树脂进行梯度洗脱，柱床体积为300ml（16×400mm）。梯度洗脱液分别为水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇各900ml。高效液相检测后将含有原花青素的40、50、60、100%洗脱液45℃条件下旋蒸，共得到富含原花青素的粗提物1737.5mg，聚合度为2-6，纯度为84.2%。
Claims (4)
1.一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）将荔枝果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分，将冷冻干燥后的荔枝果肉用磨样机打磨成粉末状；
（2）以浓度为70%的甲醇溶液超声提取30min，料液比为1:8g/mL，使用高速离心机8000r/min条件下离心10min，取上清液，此步骤重复3次，合并上清液；
（3）上清液在45℃条件下旋蒸至无甲醇气味的浓缩液为止；
（4）浓缩液过固相萃取柱，用5倍柱床体积的水洗去糖，5倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液45℃条件下旋蒸至粉末；
（5）将得到的粉末溶于水中，使用凝胶树脂进行梯度洗脱；凝胶树脂为SephadexLH-20，凝胶树脂装柱体积为40mL或300mL，梯度洗脱液分别为水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇，梯度洗脱流速为1mL/min，梯度洗脱体积为3倍柱床体积；
（6）将40%、50%、60%、100%甲醇的洗脱液45℃条件下旋蒸，得到干燥的原花青素，使用高效液相或液质确定各部分洗脱液为原花青素。
2.根据权利要求1所述的一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法，其特征在于，步骤（1）所用的荔枝的品种为‘褐毛荔’。
3.根据权利要求1所述的一种从荔枝果肉中提取原花青素的方法，其特征在于，步骤（4）中固相萃取柱型号为WatersOasisHLB20cc，上样及洗脱流速为2mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法在从荔枝果肉中提取原花青素中的应用。
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