CN104350155B - 用于生产甲基丙烯酸甲酯的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了一种生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法。所述方法包括以下步骤:(i)使用Baeyer‑Villiger单加氧酶将2‑丁酮转化成丙酸甲酯,以及(ii)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。还描述了制备甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的聚合物或共聚物的方法。
Description
本发明涉及通过使用新颖的酶催化方法从2-丁酮生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,以及由此生产的聚合物或共聚物。
甲基丙烯酸(MAA)及其甲酯—即甲基丙烯酸甲酯(MMA)是化学工业中重要的单体。其主要应用在用于各种应用的塑料的生产中。最重要的聚合作用应用是铸造、成型或挤出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以生产高光学透明度塑料。此外,使用很多共聚物,重要的共聚物是甲基丙烯酸甲酯与α-甲基苯乙烯、丙烯酸乙酯和丙烯酸丁酯的共聚物。此外,通过简单的酯交换反应,MMA可以转化成其他酯,比如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯等等。
当前,MMA(和MAA)由许多化学过程生产,所述化学过程之一是成功的“α方法”,借此,MMA从酯丙酸甲酯通过与甲醛的无水反应来获得。在α方法中,丙酸甲酯通过乙烯的羰基化来生产。此乙烯原料源自化石燃料。最近,变得期望还寻求用于化学工业的可持续生物质原料的来源。因此,用于α方法的用于丙酸甲酯的替代的生物质来源将是有利的。
因此,本发明的一个目的是解决上述问题,以及提供用于生产MMA的生物学方法或部分生物学方法。
惊人地,本发明人已发现在新颖方法中施加不寻常的酶来以工业上可应用的水平形成MMA的途径,从而对关键单体提供新的且可行的基于生物的路径。
根据本发明的第一方面,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(ii)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
以上方法还可以包括从原始原料形成2-丁酮的步骤,其中术语“原始原料”包括任何能够转化成2-丁酮的基础有机化学品,比如但不限于:2-丁醇、乙偶姻、2,3-丁二醇或甲基乙烯基酮。
以上方法还可以包括使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体(比如富含CO和/或CO2的气体)发酵来产生原始原料的步骤,其中术语“原始原料”如上文中所定义。微生物可转化的气体的合适来源包括工业烟道气、合成气和重整甲烷。
以上方法还可以包括从生物质获得糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体的步骤,其中术语“生物质”在本文定义为活着或者先前活着的植物或动物物质且其可以被认为是废物或意图用于本发明所描述的用途的物质。
优选地,丙酸甲酯通过任何合适已知的化学方法或生物化学方法被处理以生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。优选地,丙酸甲酯以通过在合适的催化剂存在下与甲醛或其合适的来源反应被处理以生产甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸。通常,此反应在无水条件下发生。
用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的合适的方法包括:使丙酸甲酯与如以下规定的式I的甲醛的合适的来源,在合适的催化剂存在下、且任选地在甲醇的存在下接触:
其中R5和R6独立地选自C1–C12烃;优选地,C1–C12烷基、烯基或芳基或H;更优选地,C1–C10烷基或H;最优选地,C1–C6烷基或H;尤其甲基或H;
X为O;
n是从1到100、优选地1到10、更优选地1到5、尤其1-3的整数;
且m为1。
在特别优选的实施方案中,式I的化合物在甲醇和/或水的存在下源自 甲醛。在这种情况下,式I的化合物可以被界定为甲醛的合适来源。
为避免疑问,甲醛的合适来源包括任何可以提供甲醛来源的平衡组合物。这类组合物的实例包括但不限于甲缩醛(1,1-二甲氧基甲烷)、聚甲醛-(CH2-O)i-其中i=1到100、福尔马林(甲醛、甲醇、水)和其他平衡组合物,比如甲醛、甲醇和丙酸甲酯的混合物。
通常,聚甲醛是甲醛和甲醇的较高碳数缩甲醛CH3-O-(CH2-O)i-CH3(“缩甲醛-i”),其中i=1到100,优选地1-5,尤其1-3,或具有至少一个非甲基端基的其他聚甲醛。因此,甲醛的来源还可以是式R31-O-(CH2-O-)iR32的聚甲醛,其中R31和R32可以是相同或不同基团且至少一个选自C2-C10烷基,例如R31=异丁基,且R32=甲基。
优选地,甲醛的合适来源选自1,1-二甲氧基甲烷、甲醛和甲醇的较高碳数缩甲醛CH3-O-(CH2-O)i-CH3,其中i=2、福尔马林、或包括甲醛、甲醇和丙酸甲酯的混合物。
优选地,术语福尔马林意指甲醛:甲醇:水以按重量计为25%到65%:0.01%到25%:25%到70%的比率的混合物。更优选地,术语福尔马林意指甲醛:甲醇:水以按重量计为30%到60%:0.03%到20%:35%到60%的比率的混合物。最优选地,术语福尔马林意指甲醛:甲醇:水以按重量计为35%到55%:0.05%到18%:42%到53%的比率的混合物。
优选地,包括甲醛、甲醇和丙酸甲酯的混合物包含按重量计少于5%的水。更优选地,包括甲醛、甲醇和丙酸甲酯的混合物包含按重量计少于1%的水。最优选地,包括甲醛、甲醇和丙酸甲酯的混合物包含按重量计0.1%到0.5%的水。
用于使用甲醛将丙酸甲酯(MEP)催化转化成MMA的合适的催化剂对技术人员是已知的。一种已知的催化剂是碱性催化剂,比如载体上的碱金属催化剂,所述载体为例如二氧化硅,所述碱金属催化剂可以包括其他金属和金属化合物。合适的二氧化硅是高表面面积的多孔二氧化硅。二氧化硅的表面积可以为至少30m2g-1。优选的碱金属是铯。碱金属可以以按重量计占催化剂的1-10%的水平存在。催化剂可以包含其他金属,比如镁、 铝、铪、硼和/或锆。其他金属的量是可变的,但当其他金属以使得催化剂包含每100摩尔二氧化硅总共0.25克至25克原子的所述改性剂元素的量存在时可以获得优良的结果。
其他合适的催化剂包括混合金属氧化物(M1 wM2 xOy),其中M1是至少一个选自以下的金属:周期表的第4至第6周期中的3族或4族、周期表的第3至第5周期中的13族、或镧系中的剩余元素(即,钪、钇、镧元素、钛、锆、铪;铝、镓、铟)且M2是至少一个选自以下的金属:周期表的第5或第6周期中的5族或周期表的第4或第5周期中的15族(即,铌、钽、砷和锑);包含磷的混合金属氧化物(M1 wM2 xPyOz),其中M1是IIIb族金属,优选地为铝,且M2是IVb族金属,优选地为硅;氮化的单金属氧化物,比如氮化物Ta2O5;氮化的混合金属氧化物(M1 wM2 xNyOz),其中M1选自周期表的2、3、4、13(也称IIIA)族或14(也称IVA)族的金属且M2选自5或15(也称VA)族的金属;以及II族磷酸盐,比如羟磷灰石和正磷酸盐,特别地似棒或似针的晶体习性的钙及锶羟磷灰石;所有任选地在合适的载体比如二氧化硅或氧化铝的存在下。
使用甲醛将丙酸甲酯(MEP)催化转化成MMA或MAA通常在高温,通常在250-400℃的范围内实现。当期望的产物是酯时,反应优选地在相关醇的存在下实现,以使通过酯的水解的相应酸的形成减到最小。而且为了方便起见,常常需要以福尔马林的形式引入甲醛。因此,为了生产甲基丙烯酸甲酯,进料至催化剂的反应混合物将通常由丙酸甲酯、甲醇、甲醛和水组成。
Baeyer-Villiger氧化指将氧原子插入酮中以形成酯。在不对称酮中,此插入反应几乎完全在酮的羰基碳和最稳定的碳正离子之间发生。通常已知不对称酮的Baeyer-Villiger氧化插入具有以下适当的迁移顺序:叔烷基>仲烷基、芳基>伯烷基>甲基(March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms and Structure,第6版,第1619页)。因此,2-丁酮的Baeyer-Villiger氧化将传统上与产物乙酸乙酯有关。因此,2-丁酮的Baeyer-Villiger氧化不是技术人员将乐意选择作为经由丙酸甲酯生产甲基丙烯酸甲酯的路径的路径。然而,本发明人已发现,某些Baeyer-Villiger 单加氧酶可以以异常的方式将氧原子插入2-丁酮中,而产生不太可能的产物丙酸甲酯。
惊人地,这已经导致用于聚合物工业的甲基丙烯酸甲酯单体的不寻常且新颖的生物路径,即经由糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵成醇,及其随后氧化成2-丁酮,且因此经由异常的Baeyer-Villiger氧化获得MEP。
已知Baeyer-Villiger氧化酶对于各种生物体是常见的,所述生物体包括细菌、植物、动物、古细菌和真菌。Baeyer-Villiger氧化酶可以催化酮转化成酯。然而,所报告的那些酶仅被描述为在生物系统中作用于基于环的酮(内酯),而非直链脂肪酮。在少数已经测试了其对直链脂肪酮的活性的研究中,那些酶被报告为具有非常低的活性。
本文使用的术语“Baeyer-Villiger单加氧酶”优选地指属于EC分类1.14.13.X组的能够催化氧化反应的酶,且这类酶通常包括以下特征序列:分别处在蛋白序列的N端及中间的两个Rossman折叠蛋白序列基序(GxGxxG),以及位于折叠蛋白的环区域中的典型BVMO结合基序FxGxxxHxxxW[P/D]。
Baeyer-Villiger单加氧酶可以是野生型酶或修饰酶。此外,该酶可以按照野生型或者其修饰形式来合成。
本文使用的术语“野生型”不论关于多肽—比如酶、多核苷酸—比如基因、生物体、细胞或者任何其他物质,均指所述物质的天然存在形式。
如本文关于多肽—比如酶、多核苷酸—比如基因、生物体、细胞或者任何其他物质所使用的术语“修饰”指这种物质与野生型不同。
如本文使用的术语“微生物可转化的气体”意指可以通过微生物转化成原始原料的一种或多种气体。合适的气体是富含CO的气体,且合适的发酵被描述在US 2012/0045807A1中,其中在适当的培养基中且在对技术人员已知的条件下,用梭菌(Clostridia),比如自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、Clostridium ljundahlii和Clostridiumragsdalei使用厌氧发酵将CO转化成2,3-丁二醇。
可以生产修饰的物质的野生型物质的合适变化包括遗传材料的变化、蛋白质材料的变化。
遗传材料的变化可以包括本领域中已知的任何将致使材料不同于野生型的遗传修饰。
这类遗传修饰的实例包括但不限于:可以对包含相关基因或要被修饰的基因的多核苷酸序列进行的缺失、插入、取代、融合等等。
本发明的范围内的这类遗传修饰还可以包括任何合适的表观遗传修饰。表观遗传修饰可以包括任何影响相关遗传材料而不修饰包含相关基因或要被修饰的基因的多核苷酸序列的修饰。表观遗传修饰的实例包括但不限于核酸甲基化或乙酰化、组蛋白修饰、副突变、基因沉默等等。
蛋白质材料的变化可以包括本领域已知的任何将致使材料不同于野生型的蛋白质修饰。
这些蛋白质修饰的实例包括但不限于:裂解多肽部分,包括片段化;附接其他生物化学官能团;改变氨基酸的化学性质;改变氨基酸残基,包括保守及非保守取代、缺失、插入等等;改变多肽的键结等等;其可以对折叠以形成相关蛋白质或要被修饰的蛋白质的多肽序列来进行。
所述材料的结构变化可以包括本领域已知的任何将致使遗传材料或蛋白质材料的结构不同于野生型的结构修饰。
这类结构修饰的实例包括由以下因素引起但不限于其的修饰:与其他结构的相互作用;与溶剂的相互作用;与底物、产物、辅因子、辅酶或任何存在于合适反应中的其他化学品,包括其他多核苷酸或多肽的相互作用;四级蛋白质结构的产生;改变环境温度或pH等等,其可以对感兴趣的相关遗传材料或蛋白质材料的结构来进行。
根据以上遗传变化、蛋白质变化或结构变化的组详述的每种修饰作为对技术人员已知的广泛的可能修饰的范例被给出,且不意图限制本发明的范围。
优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶是野生型酶。更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶是源自生物体的野生型酶,其中,生物 体可以来自任何域,包括古细菌、细菌或真核生物。还更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶是源自生物体的野生型酶,其中,生物体来自植物、真菌、古细菌或细菌界。还更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶是源自细菌或真菌的野生型酶。
野生型Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶的合适的细菌来源包括但不限于来自以下细菌属的细菌:不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短枝单胞菌属(Brachymonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、外瓶霉属(Exophiala)、短杆菌属(Brevibacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、链霉菌属(Streptomyces)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或假单胞菌属(Pseudomonas)。野生型Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶的优选的细菌来源是来自以下属的细菌:不动杆菌属或红球菌属。
野生型Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶的合适的真菌来源包括但不限于来自以下真菌属的真菌:赤霉菌属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、稻瘟菌属(Maganporthe)、柱孢属(Cylindrocarpon)、弯孢霉属(Curvularia)、德氏霉菌属(Drechslera)、酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、柱孢属(Cylindrocarpon)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。野生型Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)酶的优选的真菌来源是来自以下属的真菌:赤霉菌属、曲霉属或稻瘟菌属。
最优选的Baeyer-Villiger单加氧酶是源自以下细菌物种的野生型酶:乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB 9871或Rhodococcus jostii RHA1或红球菌属HI-31或黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)。
Baeyer-Villiger单加氧酶可以是I型、II型或O型Baeyer-Villiger单加氧酶。优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是I型Baeyer-Villiger单加氧酶。更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是选自以下酶组中之一的I型Baeyer-Villiger单加氧酶:环己酮单加氧酶(CHMO),EC编号为1.14.13.22(GenBank:BAA86293.1);苯丙酮单加氧酶(PAMO),EC编号为1.14.13.92(Swiss-Prot:Q47PU3);4-羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO),EC编号为1.14.13.84(GenBank:AAK54073.1);丙酮单加氧酶(ACMO)(GenBank:BAF43791.1);甲基酮单加氧酶(MEKA)(GenBank:ABI15711.1);环十五酮单加氧酶(CPDMO)(GenBank:BAE93346.1);环戊酮单加氧酶(CPMO)(GenBank:BAC22652.1);类固醇单加氧酶(STMO)(GenBank:BAA24454.1)。还更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是环己酮单加氧酶、4-羟基苯乙酮单加氧酶、环十五酮单加氧酶或丙酮单加氧酶,其可以选自以下酶中之一:来自乙酸钙不动杆菌NCIMB9871的环己酮单加氧酶、来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶(GenBank:CAD10801.1)、来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶(GenBank:BAH56677.1)、来自Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶(GenBank:AAR99068.1)、来自戈登氏菌属TY-5的4-羟基苯乙酮单加氧酶(Q93TJ5.1)、环十五酮单加氧酶(GenBank:BAE93346.1)或丙酮单加氧酶(Genbank:BAF43791.1)。
还更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是环己酮单加氧酶或丙酮单加氧酶,其可选自以下:来自乙酸钙不动杆菌NCIMB 9871的环己酮单加氧酶、来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶(GenBank:CAD10801.1)、来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶(GenBank:BAH56677.1)、来自Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶(GenBank:AAR99068.1)或来自戈登氏菌属TY-5的丙酮单加氧酶(Genbank:BAF43791.1)。
惊人地,本发明人已经发现环己酮单加氧酶可以使用仅5mM的2-丁酮底物的浓度以高比率生产丙酸甲酯。
因此,最优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是优选地源自以下的环己酮单加氧酶:乙酸钙不动杆菌NCIMB 9871、黄黄色杆菌(GenBank:CAD10801.1)或红球菌属HI-31(GenBank:BAH56677.1)。
最优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是源自以下细菌物种的野生型酶:乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB 9871或Rhodococcus jostii RHA1或红球菌属HI-31或黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)或Brachymonas petroleovorans。
此外,本发明人已经惊人地发现4-羟基苯乙酮单加氧酶和环十五酮单 加氧酶也可以以工业上显著的水平生产丙酸甲酯。
因此,在可选的优选实施方案中,Baeyer-Villiger单加氧酶是4-羟基苯乙酮单加氧酶或环十五酮单加氧酶。更优选地,4-羟基苯乙酮单加氧酶(Q93TJ5.1)或环十五酮单加氧酶(GenBank:BAE93346.1)。
优选地,4-羟基苯乙酮单加氧酶源自荧光假单胞菌(Pseudomonas flourescans)。
优选地,环十五酮单加氧酶源自假单胞菌属HI-70。
因此,最优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶是来自细菌物种荧光假单胞菌的4-羟基苯乙酮单加氧酶或来自细菌物种假单胞菌属HI-70的环十五酮单加氧酶。
在任一情况下,Baeyer-Villiger单加氧酶优选地选自环己酮单加氧酶、4-羟基苯乙酮单加氧酶或环十五酮单加氧酶中的一个。
任选地,本发明中使用的Baeyer-Villiger单加氧酶可以作为上述Baeyer-Villiger单加氧酶酶中一种或更多种的混合物存在。在这种情况下,Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)可以源自以任何组合或形式的以上描述的来源的任何一种或更多种。例如,Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)可以是源自细菌的BVMO酶和源自真菌的BVMO酶的混合物,其中一种酶可以是修饰酶且一种可以是野生型酶。
可选地,在另外的实施方案中,Baeyer-Villiger单加氧酶可以作为修饰酶存在。优选地,修饰的BVMO酶是其中BVMO酶的遗传物质已经从野生型改变的遗传修饰的酶。
在一个实施方案中,遗传修饰的BVMO酶可以是已经从一种或更多种上述Baeyer-Villiger单加氧酶的野生型遗传序列的部分构造以便产生嵌合体的融合蛋白。这类嵌合BVMO的优选实例包括:例如,PASTMO(PAMO和STMO的融合物)、或如由van Beek等人在Chemical Communications2012,48,3288-3290中描述的PASTMO(PAMO和CHMO的融合物)。
优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶通过以本领域已知的方式繁殖宿主生物体来生产,所述宿主生物体已经用相关核酸转化以表达所述 Baeyer-Villiger单加氧酶。合适的宿主生物体包括但不限于:细菌、真菌、酵母、植物、藻类、原生生物等等。
优选地,相关核酸在宿主生物体内的表达载体上表达。合适的表达载体包括本领域已知的任何可商购的载体,比如但不限于:噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒、福斯质粒(fosmid)、细菌人工染色体、酵母人工染色体等等。
适宜地,如以下对于细菌所讨论的,最适当的载体、转化方法以及对于在宿主生物体中表达BVMO酶所必需的所有其他相关过程适用于如本领域已知的相关宿主生物体。
优选地,宿主生物体是细菌。适宜地,因此所使用的表达载体是任何可商购的质粒,比如但不限于pBR、pUC、pBS、pBE、ColE、pUT、pACYC、pA、pRAS、pTiC、pBPS、pUO、pKH、pWKS、pCD、pCA、pBAD、pBAC、pMAK、pBL、pTA、pCRE、pHT、pJB、pET、pLME、pMD、pTE、pDP、pSR等等。更优选地,所使用的表达载体是以下可商购的质粒之一:pBAD、pCRE或pET。
任选地,表达载体可以是修饰的表达载体,其不是可商购的且已经改变,使得其定制为在宿主生物体内特定表达BVMO酶。因此,在优选的实施方案中,所使用的表达载体是基于用于在宿主细菌中表达BVMO酶的商业pBAD质粒的pCRE2质粒,如Torres Pazmino等人在ChemoBioChem10:2595-2598(2009)中所描述的。
优选地,通过本领域已知的任何合适的方法来转化宿主细菌,所述方法包括但不限于:显微注射、超声、冻融法、微穿孔(microporation)或使用化学感受态细胞。更优选地,通过电穿孔来转化宿主细菌。
合适的宿主细菌包括来自以下属的那些:链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或弧菌属(Vibrio)。优选地,宿主细菌选自埃希氏菌属。更优选地,宿主细菌是物种大肠杆菌。最优选地,宿主细菌是大肠杆菌菌株TOP10。
优选地,在表达载体上表达的相关核酸是编码Baeyer-Villiger单加氧 酶的遗传序列加上如本领域已知的在宿主细菌中实现其表达所必需的任何另外的遗传序列,比如但不限于:启动子、终止子、下游或上游效应子、抑制因子、激活子、增强子、结合辅因子、起始子(initiators)等等。
优选地,表达载体还包括编码至少一种表达标记的遗传序列。表达标记使得已经被正确转化的宿主细菌细胞能够被识别。合适的表达标记包括本领域已知的任何一个,但不限于:抗菌抗性基因、色素产生基因、色素抑制基因、代谢能力基因(metabolic capacitygene)或代谢不能基因(metabolic incapacity gene)。更优选地,表达标记是抗菌抗性基因。还更优选地,抗菌抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。因此,仅那些能够在包含氨苄青霉素的培养基上生长的细菌表达载体且已经被正确转化。
优选地,表达载体还包括编码至少一种激活子的遗传序列。激活子使得已经转化的宿主细菌细胞能够被刺激以通过与诱导物底物的相互作用在适当的时间产生BVMO酶。合适的激活子-诱导物系统包括本领域已知的任何一个,但尤其其中L-阿拉伯糖为诱导物的阿拉伯糖操纵子(ara operon)或其中诱导物为异乳糖或IPTG的乳糖操纵子。
任选地,表达载体还可以包括编码标签的遗传序列。优选地,编码所述标签的遗传序列可操作来与编码Baeyer Villiger单加氧酶酶的遗传序列一起被连续转录,使得标签与所产生的Baeyer Villiger单加氧酶酶形成融合蛋白。该标签使得所产生的BaeyerVilliger单加氧酶酶能够从宿主细菌裂解物中容易纯化。合适的标签包括本领域已知的任何一个,但不限于:His-标签、GST标签、MBP标签或抗体标签。
优选地,宿主细菌通过在如本领域已知的合适的条件下在合适的培养基中或其上培养其来生长,其中培养基可以是培养液或固定凝胶(set gel)。优选地,培养基包含营养素的来源、用于在表达标记存在下选择的选择性组分、以及诱导表达载体在细菌中表达的诱导物,其中选择性组分和诱导物对所使用的表达载体具有特异性。优选地,培养基是培养液。更优选地,培养基是Luria-Bertani培养液。
Baeyer-Villiger单加氧酶可以以本领域已知的任何合适的形式存在于以上过程的反应混合物中,比如但不限于:游离细胞提取物、合成酶或包 含在宿主生物体细胞内,并且这些Baeyer-Villiger单加氧酶可以以本领域已知的任何合适的方式位于反应混合物内,比如但不限于:在溶液中呈游离形式、保持于膜上、或结合到柱/在柱内。
优选地,BVMO以在相对水平的溶解氧下产生能够产生需要量的丙酸甲酯所必需的浓度存在于反应混合物中。通常,在工业情况下,每升每小时约0.01摩尔O2到0.5摩尔O2溶解到反应混合物中,所述反应混合物能够给出每升每小时约0.01摩尔丙酸甲酯到0.5摩尔丙酸甲酯。
术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。优选地,在高于或低于所述值10%内。
在一个实施方案中,Baeyer-Villiger单加氧酶作为来自表达其的细胞的细胞提取物存在于反应混合物中,其中该细胞优选地为用来生产BVMO酶的宿主细菌细胞。可以通过任何能够溶解宿主细菌细胞的合适方法来获得细胞提取物,所述方法包括但不限于:超声处理、DNA酶/溶菌酶处理、冻融处理或碱处理。
优选地,然后处理细胞提取物,以在以上过程中用作为Baeyer-Villiger单加氧酶的来源之前移除细胞碎片。可以通过本领域已知的任何合适的方法来处理细胞裂解物,所述方法包括但不限于:过滤、离心或用盐纯化以获得澄清的细胞提取物。
优选地,以上过程的反应混合物中存在另外的组分,以便允许Baeyer-Villiger单加氧酶正确发挥作用。优选地,所述另外的组分是缓冲剂或pH稳定剂、NADPH以及任选地NADPH再生剂。
任何合适的缓冲剂可以使用在反应混合物中,合适的缓冲剂包括但不限于:Tris-HCl、TAPS、N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲砷酸盐、SSC、或MES。优选地,反应混合物中的使用的缓冲剂是Tris-HCl。
可选地,可以使用pH稳定剂来控制反应混合物的pH。
优选地,缓冲剂或pH稳定剂将反应混合物维持在使BVMO酶发挥作用和/或使包括所述BVMO酶的宿主生物体生存的合适的pH下。优选地, 缓冲剂或pH稳定剂将反应混合物维持在约pH 6.5到pH 8.5之间的pH。更优选地,缓冲剂或pH稳定剂将反应混合物维持在约pH7.3和pH 7.7之间的pH。还更优选地,缓冲剂或pH稳定剂将反应混合物维持在约7.5的pH。
如关于反应混合物的pH使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,混合物的pH在高于或低于所述值10%内。
优选地,反应混合物中缓冲剂的浓度在约25mM到100mM之间。更优选地,反应混合物中缓冲剂的浓度在约40mM和60mM之间。还更优选地,反应混合物中缓冲剂的浓度为约50mM。
如关于缓冲剂的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,缓冲剂的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,NADPH以相对于BVMO的起始摩尔浓度存在于反应混合物中,使得BVMO酶由NADPH饱和。因此,优选地,NADPH以至少等于BVMO酶浓度的浓度存在于反应混合物中。
优选地,在一个实施方案中,NADPH以在约50μM到200μM之间的起始浓度存在于反应混合物中。更优选地,NADPH以在约90μM到110μM之间的起始浓度存在于反应混合物中。还更优选地,NADPH以约100μM的起始浓度存在于反应混合物中。
如关于NADPH的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,NADPH的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,NADPH再生剂以在约5μM到20μM之间的浓度存在于反应混合物中。更优选地,NADPH再生剂以在约8μM到12μM之间的浓度存在于反应混合物中。还更优选地,NADPH再生剂以约10μM的浓度存在于反应混合物中。
优选地,如果使用,NADPH再生剂以相对于BVMO的摩尔浓度存在于反应混合物中,使得BVMO由NADPH饱和。因此,优选地,如果使用, NADPH再生剂的Km至少等于BVMO对NADPH的消耗速率。
如关于NADPH再生剂的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,NADPH再生剂的浓度在高于或低于所述值10%内。
任何合适的NADPH再生剂可以使用在反应混合物中,所述NADPH再生剂为比如但不限于:亚磷酸盐脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸盐脱氢酶。适宜地,NADPH再生剂的相关伴侣底物也存在于反应混合物内,所述相关伴侣底物为比如但不限于:葡萄糖、醇、亚磷酸盐或甲酸盐。
可选地,可以将NADPH提供到反应混合物中作为与支持物共价连接的大分子辅因子,所述支持物为例如膜、树脂或凝胶。
优选地,伴侣底物以在5mM到20mM之间的浓度、更优选地以在约8mM到12mM之间的浓度、还有优选地以在约10mM的浓度存在于反应混合物中。
优选地,伴侣底物以相对于NADPH再生剂在约1:4000和1:250之间的(NADPH再生剂:伴侣底物)的摩尔浓度存在于反应混合物中。更优选地,伴侣底物以相对于NADPH再生剂在约1:1000的摩尔浓度存在于反应混合物中。
如关于伴侣底物对NADPH再生剂的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,伴侣底物对NADPH再生剂的浓度在高于或低于所述值10%内。
适宜地,底物存在于以上反应混合物中,以便开始将2-丁酮BVMO转化成丙酸甲酯。优选地,在此实施方案中,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度在约10g/L和200g/L之间。更优选地,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度在约50g/L和130g/L之间。还更优选地,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度在约90g/L和110g/L之间。
如关于底物的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,底物的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,在此实施方案中,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度为反应混合物按重量计的至少约10%;更优选地,其为反应混合物按重量计的至少约20%直到反应混合物按重量计的约80%之间。
在可选的实施方案中,Baeyer-Villiger单加氧酶可以作为合成酶存在于反应混合物中。在此实施方案中,合成酶以本领域已知的方式在体外合成,然后在用于反应混合物之前纯化。优选地,反应混合物以大体相同的浓度和比率包括如以上反应混合物中定义的相同的组分。
在另外可选的实施方案中,Baeyer-Villiger单加氧酶可以存在于宿主生物体细胞比如细菌细胞内的反应混合物中。在此实施方案中,宿主细胞以本领域已知的方式制备,然后在用于反应混合物中之前纯化。优选地,反应混合物包括如以上反应混合物中定义的缓冲剂和底物。优选地,缓冲剂以以上定义的相同的浓度和比率存在。
然而,优选地,在此实施方案中,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度小于对宿主细胞有毒的浓度限值,且对于将底物摄取到宿主细胞中为最佳。因此,优选地,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度在约0.2g/L和50g/L之间。更优选地,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度在约0.2g/L和30g/L之间。还更优选地,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度在约0.2g/L和20g/L之间。
如关于底物的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,底物的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,在此实施方案中,存在于以上反应混合物中的2-丁酮底物的浓度为反应混合物按重量计的至少约1%;更优选地,其为反应混合物按重量计的至少约2%直到反应混合物按重量计的约20%之间。
适宜地,在此实施方案中,通过存在于反应培养基中的宿主细胞的浓度来确定存在于反应混合物中的BVMO酶的浓度。优选地,存在于反应培养基中的宿主细胞的浓度为在约1g/L和100g/L之间。更优选地,存在于反应培养基中的宿主细菌细胞的浓度为在约5g/L和50g/L之间。还更优选地,存在于反应培养基中的宿主细菌细胞的浓度为在约10g/L和20g/L之间。通常,宿主细胞是细菌细胞。
适宜地,在此实施方案中,反应混合物不包括添加的NADPH或任选的NADPH再生剂以及伴侣底物,因为它们已经在宿主细胞生物化学内存在。
优选地,无论用于反应混合物中的BVMO来源的形式如何,原位产物移除系统在反应过程中与底物进料策略一起实施。已经发现,产物的移除与恒定的底物进料一起可以使产物产量增加至更高值,如Alphand等人在Trends in Biotechnology第21卷第7期2003年7月中描述的。可以实施本领域已知的任何产物移除系统和任何底物进料策略。然而,优选地,使用相同的技术,例如通过使用可以同时充当底物储存器和产物槽的载体材料来实施产物移除系统和底物进料系统。一种该技术为使用由Simpson等人Journal of MolecularCatalysis B Enzyme 16,第101-108页描述的Optipore L-493树脂。
有利地,本发明人还已经发现,在反应混合物中使用某些共溶剂可以增加丙酸甲酯产物的相对水平和/或绝对水平。
如本文使用的术语“绝对水平”指来自2-丁酮转化的在溶液中作为产物获得的丙酸甲酯的实际百分比值。如本文使用的术语“相对水平”指选择性,即来自2-丁酮转化的在溶液中作为产物获得的丙酸甲酯与在在溶液中作为产物获得的替代产物乙酸乙酯相比的百分比。
因此,优选地,以上反应混合物中包括至少一种共溶剂,合适的共溶剂包括但不限于以下之一:甲醇、2-丁醇、叔丁醇、二噁烷、丙酮或乙腈。
任选地,共溶剂在反应混合物中的作用还可以通过底物2-丁酮实现。因此,可以使用除用于底物催化所需量之外的过量的2-丁酮。
惊人地,超出这类酶转化中常规使用的那些水平的底物浓度的增加增大了BVMO的反应选择性,以相对于正常乙酸乙酯产物产生更多异常插入物和更多丙酸甲酯。惊人地,在相对于BVMO的摩尔浓度超过1000倍的过量浓度下,有通过BVMO酶的异常插入物、异常酯的形成的增加,使得乙酸乙酯产生对丙酸甲酯产生的比率被减少。因此,共溶剂/底物的浓 度为1000:1或更大mol:mol BVMO,更优选地5000:1或更大mol:mol,最优选地10000:1或更大mol:mol BVMO。最大水平将取决于特定反应但应小于使选择性和/或转化减小的浓度。在任一情况下,其通常<1000000:1mol:mol BVMO,最优选地在共溶剂/底物的摩尔浓度相对于BVMO的25000倍和125000倍之间。
有利地,本发明人已经发现,特别地,使用甲醇作为共溶剂大大增加了丙酸甲酯产物与乙酸乙酯产物相比的相对水平,并且还大大增加了丙酸甲酯越过且超过对任何其他共溶剂所观察到的增加的绝对水平。
因此,最优选地,使用的共溶剂是甲醇。
惊人地,在反应混合物中使用浓度增加的甲醇增加了BVMO的反应选择性,以相对于正常的乙酸乙酯产物产生更多异常插入物和更多丙酸甲酯。
因此,优选地,通过以上过程中的BVMO酶生产的丙酸甲酯:乙酸乙酯的比率为至少1:5,更优选地至少1:2,还更优选地至少1:1.5,最优选地至少1:0.5。
惊人地,使用浓度增加的甲醇还增加了以上过程中产生的丙酸甲酯产物的绝对水平。
因此,优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶在以上过程中以至少2%选择性的绝对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯。更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶以至少5%选择性的绝对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯。还更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶以至少9%选择性的绝对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯。
优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶以至少20%的相对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯。更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶以至少50%的相对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯。还更优选地,Baeyer-Villiger单加氧酶以至少100%的相对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯。
优选地,丙酸甲酯通过任何合适已知的化学方法或生物化学方法被处理以生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。优选地,丙酸甲酯通过在如上所述 的合适的催化剂存在下与甲醛或其合适的来源反应被处理以生产甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸。
如以上所提到的,该方法还包括从原始原料形成2-丁酮的步骤,其中术语“原始原料”包括任何能够被转化成2-丁酮的基础有机化学品,比如但不限于:2-丁醇、乙偶姻、2,3-丁二醇或甲基乙烯基酮。
因此,根据本发明的第一方面的一个实施方案,提供了一种生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)从原始原料形成2-丁酮;
(ii)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(iii)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
优选地,从原始原料形成2-丁酮的步骤包括将2-丁醇转化成2-丁酮。
因此,根据本发明的第一方面的优选实施方案,提供了一种生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)从2-丁醇形成2-丁酮;
(ii)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(iii)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
此2-丁醇向2-丁酮的转化可以为化学催化或酶催化。优选地,此转化为酶催化。更优选地,此转化由脱氢酶催化。还更优选地,此转化由EC群组编号为1.1.1.X的醇脱氢酶来催化。
优选地,醇脱氢酶是能够使丁醇脱氢的酶,比如EC编号为1.1.1.1的那些酶。更优选地,能够使丁醇脱氢的酶的醇脱氢酶源自生物体。还更优选地,能够使丁醇脱氢的脱氢酶可以源自例如以下生物体之一:巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、实蝇属物种(Anastrepha species)、燕麦(Avena sativa)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、短杆菌属物种(Brevibacterium species)、茶树(Camellia sanensis)、念珠菌属物种(Candidaspecies)、Chlamydomonas moewussi、西瓜(Citrillus lanatus)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、鹌鹑(Coturnix coturnix)、黑线仓鼠(Cricetulusgriseus)、番红花(Crocus sativas)、甜瓜(Cucumis melo)、巨大脱硫弧菌(Desulfovibriogigas)、核黄素德沃斯氏菌(Devosia riboflavina)、头状双足囊菌(Dipodascuscapitatus)、果蝇属物种(Drosophila species)、构巢裸胞壳(Emericulla nidulans)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠杆菌、眼虫属物种(Euglena species)、Flavobacterium frigidimaris、原鸡(Gallus gallus)、草莓(Fragaria ananassa)、土芽孢杆菌属物种(Geobacillus species)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、大麦(Hordeumvulgare)、克雷伯菌属物种(Klebsiella species)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromycesspecies)、赖氏菌属物种(Leifsonia species)、甲基杆菌属物种(Methylobacteriumspecies)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻(Oryza sativa)、假单胞菌属物种、红球菌属物种、酵母菌属物种、硫叶菌属物种(Sulfobulus species)、嗜热厌氧杆菌属物种(Thermoanaerobacter species)、玫瑰红嗜热菌(Thermomicrobium roseum)、嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)、栖热菌属物种(Thermus species)、小麦属物种(Triticum species)、蚕豆(Vicia fabia)、葡萄(Vitis vinifera)、玉米(Zea mays)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
在特别优选的实施方案中,醇脱氢酶是EC群组编号为1.1.1.2的热稳定的NADP依赖的醇脱氢酶。更优选地,醇脱氢酶是来自嗜热微生物的热稳定的NADP依赖的醇脱氢酶。还更优选地,醇脱氢酶是来自嗜热细菌的热稳定的NADP依赖的醇脱氢酶。最优选地,醇脱氢酶是来自细菌布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的热稳定的NADP依赖的醇脱氢酶(Swiss-Prot:P14941.1)。
优选地,醇脱氢酶与BVMO酶在宿主生物体,优选地为细菌,中共表达。因此,优选地,以上讨论的表达载体还包括编码醇脱氢酶的遗传序列以及在宿主细菌中对实现其表达所必需的任何另外的遗传序列,比如但不限于:启动子、终止子、下游或上游效应子、抑制因子、激活子、增强子、结合辅因子等等。
可选地,醇脱氢酶可以在与BVMO酶不同的载体上在宿主生物体中 表达。
有利地,已发现,醇脱氢酶还是可操作的来提供NADPH再生系统。在2-丁醇转化成2-丁酮期间,醇脱氢酶将氧化2-丁醇,从而提供容易获得的电子,以在2-丁酮转化成丙酸甲酯期间从由BVMO生产的NADP+再生NADPH。当共表达醇脱氢酶和BVMO酶两者时,闭环NADPH再生可以发生而不需要向系统外部输入NADPH再生剂。从而改良化学计量且解决由BVMO催化产生的潜在氧化还原瓶颈,这允许2-丁醇至2-丁酮至丙酸甲酯的反应作为真实的级联反应更快且更有效地进行。
优选地,在包括至少醇脱氢酶和底物2-丁醇的反应混合物中,以本领域已知的方式且在对所给出的酶为最佳的条件下进行此步骤。这类条件包括通过技术人员知识内的常规方法可推断出的最佳浓度和比率。
可选地,从原始原料形成2-丁酮的步骤可以包括乙偶姻转化成2,3-丁二醇以及2,3-丁二醇转化成2-丁酮。
因此,根据本发明的第一方面的另外优选的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)从乙偶姻形成2,3-丁二醇;
(ii)从2,3-丁二醇形成2-丁酮;
(iii)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(iv)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
这些转化可以为化学催化或酶催化。优选地,这些转化为酶催化。
更优选地,乙偶姻至2,3-丁二醇的转化由脱氢酶催化,且2,3-丁二醇至2-丁酮的转化由脱水酶来催化。还更优选地,乙偶姻至2,3-丁二醇的转化由EC群组编号为1.1.1.X的醇脱氢酶来催化,且2,3-丁二醇至2-丁酮的转化由EC群组编号为4.2.1.X的二醇脱水酶来催化。
优选地,醇脱氢酶是能够使乙偶姻脱氢的酶,比如EC群组编号为1.1.1.4或1.1.1.76的那些酶。更优选地,醇脱氢酶是能够使乙偶姻脱氢的源自生物体的酶。还更优选的,能够使乙偶姻脱氢酶脱氢的醇脱氢酶可以 源自例如以下生物体之一:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、芽孢杆菌属物种、短芽孢杆菌属物种(Brevibacillusspecies)、肠杆菌属物种(Enterobacter species)、肠球菌属物种(Enterococcusspecies)、氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、克雷伯菌属物种、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、微球菌属物种(Micrococcus species)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、假单胞菌属物种、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、酵母菌属物种、谷氨酸棒状杆菌或粘质沙雷氏菌(Seratia marcescens)。
优选地,二醇脱水酶是能够使2,3-丁二醇脱水的二醇脱水酶,比如EC群组编号为4.2.1.28的那些二醇脱水酶。更优选地,能够使2,3-丁二醇脱水的二醇脱水酶是源自生物体的二醇脱水酶。还更优选地,能够使2,3-丁二醇脱水的二醇脱水酶可以源自例如以下生物体之一:醋酸杆菌属物种(Acetobacterium species)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、黄杆菌属物种(Flavobacteriumspecies)、克雷伯菌属物种、乳杆菌属物种(Lactobacillus species)、沙门氏菌属物种或费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)。
优选地,醇脱氢酶和二醇脱水酶与BVMO酶在宿主生物体中共表达,所述宿主生物体优选为细菌。因此,优选地,以上讨论的表达载体还包括编码醇脱氢酶和二醇脱水酶的遗传序列以及在宿主细菌中对实现其表达必需的任何另外的遗传序列,比如但不限于:启动子、终止子、下游或上游效应子、抑制因子、激活子、增强子、结合辅因子等等。
可选地,醇脱氢酶和/或二醇脱水酶可以在与BVMO酶不同的载体上在宿主生物体中表达。
优选地,在包括至少醇脱氢酶、二醇脱水酶和底物乙偶姻的反应混合物中,以本领域已知的方式且在对所给出的酶为最佳的条件下进行此步骤。这类条件包括通过技术人员知识内的常规方法可推断出的最佳浓度和比率。
可选地,从原始原料形成2-丁酮的步骤可以包括乙偶姻转化成甲基乙烯基酮以及甲基乙烯基酮转化成2-丁酮。
因此,根据本发明的第一方面的另外优选的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)从乙偶姻形成甲基乙烯基酮;
(ii)从甲基乙烯基酮形成2-丁酮;
(iii)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(iv)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
这些转化可以为化学催化或酶催化。优选地,这些转化为酶催化。
更优选地,乙偶姻至甲基乙烯基酮的转化由醇脱水酶催化,且甲基乙烯基酮至2-丁酮的转化由烯酮还原酶来催化。还更优选地,乙偶姻至甲基乙烯基酮的转化由EC群组编号为4.2.1.X的醇脱水酶来催化,且甲基乙烯基酮至2-丁酮的转化由EC群组编号为1.1.1.X或1.3.1.X的烯酮还原酶来催化。
优选地,醇脱水酶是能够使乙偶姻脱水的酶,比如EC群组编号为4.2.1.53或4.2.1.43或4.2.1.3或由Jianfeng等人在Chemical Communications,2010,46,8588-8590中描述的那些酶。更优选地,醇脱水酶是能够使乙偶姻脱水的源自生物体的酶。还更优选的,能够使乙偶姻脱水的醇脱水酶可以源自例如以下生物体之一:假单胞菌属物种、脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)、巴西固氮螺菌(Azospirilliumbrasilense)、织片草螺菌(Herbaspirillium seropedicae)、Pelomonas saccharophila、根瘤菌属物种(Rhizobium species)、硫叶菌属物种、假挪威槭(Acer pseudoplatanus)、拟南芥(Arabidopiss thaliana)、黑曲霉(Aspergillus niger)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、芽孢杆菌属物种、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牛(Bos taurus)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒状杆菌、果蝇属物种、大肠杆菌、美洲牡蛎(Crassostrea virginica)、南瓜属物种(Cucurbita species)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、小家鼠(Mus musculus)、烟草属物种(Nicotianaspecies)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、家鼠属物种(Rattus species)、酵母菌属物种、沙门氏菌属物种、链霉菌属物种、玉米或野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)。
优选地,烯酮还原酶是能够还原甲基乙烯基酮的酶,比如EC群组编号为1.1.1.54或1.3.1.31的那些酶,或者由Yamamoto等人在美国专利6780967中描述的那些酶。更优选地,烯酮还原酶是能够还原甲基乙烯基酮的来自生物体的酶。还更优选地,能够还原甲基乙烯基酮的烯酮还原酶可以来自例如以下生物体之一:酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Saccharomycespombe)、烟草(Nicotania tabacum)、小眼虫(Euglena gracilis)、长变胞藻(Astasialonga)、乳酸克鲁维酵母(Klyveromyces lactis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、大肠杆菌或家鼠属物种。
优选地,烯酮还原酶和醇脱水酶与BVMO酶在宿主生物体中共表达,所述宿主生物体优选为细菌。因此,优选地,以上讨论的表达载体还包括编码醇脱氢酶的遗传序列以及在宿主细菌中对实现其表达必需的任何另外的遗传序列,包括但不限于:启动子、终止子、下游或上游效应子、抑制因子、激活子、增强子、结合辅因子等等。
可选地,烯酮还原酶和/或醇脱水酶可以在与BVMO酶不同的载体上在宿主生物体中表达。
优选地,在包括至少烯酮还原酶、醇脱水酶和底物乙偶姻的反应混合物中,以本领域已知的方式且在对所给出的酶为最佳的条件下进行此步骤。这类条件包括通过技术人员知识内的常规方法可推断出的最佳浓度和比率。
如以上提及的,该方法还可包括使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体(比如富含CO和/或CO2的气体)发酵来产生原始原料的步骤,其中术语“原始原料”包括任何能够被转化成2-丁酮的基础有机化学品,比如但不限于:2-丁醇、乙偶姻、2,3-丁二醇或甲基乙烯基酮。
因此,根据本发明的第一方面的另外的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使所述糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生原始原 料;
(ii)从所述原始原料形成2-丁酮;
(iii)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(iv)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
优选地,使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生原始原料的步骤包括使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生2-丁醇。
因此,根据本发明的第一方面的另外优选的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生2-丁醇;
(ii)从2-丁醇形成2-丁酮;
(iii)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(iv)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
优选地,使糖发酵成2-丁醇为酶催化的。进行这种发酵的方法在本领域中是众所周知的,例如,美国专利号US5753474或最近在PCT申请号为WO2007/130521中描述了一种此种方法。
特别地,WO2007/130521公开了生物质、特别为可发酵糖来源的生物质的发酵的四种不同的途径(参见第59页和第60页给出的列表),其可以用于以工业规模生产2-丁醇(参见WO2007/130521的图1)。
适宜地,发酵生物体是利用碳水化合物的生物体,因此,生物质中可利用的糖通过天然途径摄取且进入埃姆登-迈耶霍夫-帕纳斯途径(Embden Myerhof-Parnas Pathway,EMP)途径、恩特纳-杜多罗夫(Entner-Douderoff)途径以及磷酸戊糖途径,这些途径是为生长提供来自碳水化合物的能量的中心代谢路径。这些途径的关键是中间体甘油醛-3-磷酸,其在呼吸产生能量期间被转化成丙酮酸酯。因此,丙酮酸酯是在大多数利用碳水化合物的生物体中产生的可容易得到的天然存在的化学品。
如WO2007/130521中描述的,可以通过使用修饰的利用碳水化合物的 生物体来实施图1中以上四种途径的任一种来使丙酮酸酯转化成2-丁醇,所述修饰的利用碳水化合物的生物体已经被遗传改造为包含适当的生物化学品。例如,可以使用途径1,途径1包含转化步骤a、b、c、d、e和f。
步骤(a)包括将两分子的丙酮酸酯转化成α-乙酰乳酸。优选地,使用EC群组编号为EC 2.2.1.6的酶来催化该反应,比如,例如:乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶。更优选地,用来催化该反应的酶是乙酰乳酸合酶。仍更优选地,其是以下乙酰乳酸合酶之一:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank:AAA22222NCBI L04470)、土生克雷伯菌(Klebsiellaterrigena)(GenBank:AAA25055NCBI L04507)或肺炎克雷伯菌(Klebisella Pneumoniae)(GenBank:AAA25079NCBI M73842)。
步骤(b)包括将α-乙酰乳酸转化成乙偶姻。优选地,使用EC群组编号为EC 4.1.1.5的酶来催化该反应,比如,例如:乙酰乳酸脱羧酶。更优选地,其为以下乙酰乳酸脱羧酶之一:枯草芽孢杆菌(GenBank:AAA22222NCBI L04470)、土生克雷伯菌(GenBank:AAA25055NCBI L04507)或肺炎克雷伯菌(GenBank:AAU43774NCBI AY22056)。
步骤(c)包括将乙偶姻转化成3-氨基-2-丁醇。优选地,使用转氨酶或还原性脱氨基酶的一般群组的酶来催化该反应,例如:可被认为是乙偶姻脱氨基酶的磷酸吡哆醛依赖的转氨酶。更优选地,磷酸吡哆醛依赖的转氨酶是氨基:丙酮酸转氨酶。还更优选地,其是来自河流弧菌(Vibrio Fluvialis)JS17的氨基:丙酮酸转氨酶(参见WO2007/130521的实施例13)。
步骤(d)包括将3-氨基-2-丁醇转化成3-氨基-2-丁醇O-磷酸酯。优选地,使用氨基醇激酶的一般群组的酶来催化该反应,例如:可以被视为氨基丁醇激酶的EC编号为2.7.1.82的ATP依赖的乙醇胺激酶。更优选地,ATP依赖的乙醇胺激酶源于假单胞菌属或欧文氏菌属(Erwinia)的物种。还更优选地,其是来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovera)菌株SCRI1043的ATP依赖的乙醇胺激酶(参见WO2007/130521的实施例14)。
步骤(e)包括将3-氨基-2-丁醇O-磷酸酯转化成2-丁酮。优选地,使用磷酸氨基醇磷酸裂解酶的一般群组的酶来催化该反应,比如,例如:可被视为磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶的磷酸吡哆醛依赖的磷酸乙醇胺磷酸裂解 酶。更优选地,磷酸吡哆醛依赖的磷酸乙醇胺磷酸裂解酶源于假单胞菌属或欧文氏菌属的物种。还更优选地,其是来自胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCRI1043的磷酸吡哆醛依赖的磷酸乙醇胺磷酸裂解酶(参见WO2007/130521的实施例15)。
步骤(f)包括将2-丁酮转化成2-丁醇。优选地,使用EC群组编号为EC1.1.1.2的酶来催化该反应,比如,例如丁醇脱氢酶或环己酮脱氢酶。更优选地,用来催化该反应的酶是丁醇脱氢酶。还更优选地,用来催化该反应的酶是以下丁醇脱氢酶之一:强烈火球菌(GenBank:AAC25556NCBI AF013169)或大肠杆菌(GenBank:NP_417484NCBI NC_000913)。
WO2007/130521还描述了可用来构造编码多种酶的质粒载体,使得途径可以在宿主生物体中表达的本领域已知的技术和程序,作为示范,途径3充分例示。
此外,相关专利申请WO2007/146377描述了多种可以用在用于工业生产2-丁醇的此方法中的丁醇耐受生物体,尤其乳杆菌属的生物体。尤其有利的丁醇耐受物种被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0510、植物乳杆菌(PN0511)、植物乳杆菌(PN0512)和亚利桑那乳杆菌(Lactobacillus arizonensis)PN0514。在本发明特别优选的实施方案中,这些特殊的丁醇耐受物种的至少一种被用作表达由WO2007/130521描述的以上途径中的任一个的宿主生物体。
优选地,使甘油向2-丁醇的发酵为酶催化的。进行此发酵的方法在本领域中是众所周知的,例如,美国专利号US8119844B2或最近在美国专利申请号US2011/207191中描述了一种此种方法。
特别地,US8119844公开了厌氧发酵商业甘油或来自工业废物的包含甘油的副产物,以使用生物体巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)来生产丁醇。
US8119844描述了,厌氧发酵在来自例如Biebel(Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology(2001)27,pp.18-26)的如本领域已知的生物反应器中,使用能够通过天然途径将甘油底物转化成2-丁醇的野生型巴氏 梭菌细菌来实施。
因此,优选地,在将甘油转化成2-丁醇的步骤中使用的细菌是野生型细菌,更优选地梭菌属的野生型细菌,还更优选地物种巴氏梭菌DSMZ 525的野生型细菌。
任选地,在将甘油转化成2-丁醇的步骤中使用的细菌可以被修饰,使得其进行这种转化的能力通过本领域已知的相关技术以有利的方式被增强或改变。
优选地,甘油底物源自工业废物的副产物,使得本发明方法的总生态影响或化石燃料使用减到最少。这类废甘油的合适来源包括但不限于:生物柴油生产、脂肪皂化、酒精饮料生产、棕榈油生产或油脂化学过程。优选地,甘油底物源自生物柴油生产。
适宜地,用来将甘油转化成2-丁醇的细菌伴随供应甘油底物被发酵,且从发酵培养基中分离2-丁醇产物。可以使用如US8119844中讨论的任何合适的发酵技术。然而,优选地,发酵培养基如US8119844的实施例中所描述的来制备,且优选地,根据US8119844中给出的实施例将发酵技术外推至工业情况,且优选地,如US8119844的第10列和第11列中所描述的来进行丁醇产物的分离。
任选地,可以存在醋酸酯以提高来自甘油的2-丁醇的产量,且任选地,可以从甘油底物中移除甲醇以提高来自甘油的2-丁醇的产量。优选地,醋酸酯以至少1g/L的浓度存在于发酵培养基中。优选地,甘油底物中甲醇的浓度为至多10g/L。从甘油底物中移除甲醇的方法在US8119844中的第8列中以及“Glycerol Preparation from Biodiesel Waste(来自生物柴油废物的甘油制备)”的实施例中描述。
优选地,通过一种或更多种生物体来进行发酵。更优选地,通过能够产生将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成2-丁醇所必需的一种或更多种酶的生物体来进行发酵。优选地,通过野生型生物体来进行发酵,所述野生型生物体天然表达相关的将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成2-丁醇所必需的一种或更多种酶。因此,更优选地,通过包括内 源性遗传序列的野生型生物体来进行发酵,所述内源性遗传序列编码将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成2-丁醇所必需的一种或更多种酶。优选地用于本发明的这类生物体的实例详述于描述这类发酵过程的上述参考文献中。
可选地,可通过遗传修饰的生物体来进行发酵,所述生物体已经被修饰来表达将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成2-丁醇所必需的一种或更多种酶。因此,优选地,重组生物体中的每个包括表达载体,该表达载体进而包括编码将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成2-丁醇所必需的一种或更多种酶的外源性遗传序列,加上在宿主生物体中实现其表达所必需的任何另外的遗传序列,比如,但不限于:启动子、终止子、下游或上游效应子、抑制因子、激活子、增强子、结合辅因子等等。
优选地,用于使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵成2-丁醇的一种或更多种宿主生物体是细菌或真菌。因此,优选地,宿主细菌或真菌还包括编码将所产生的2-丁醇自细菌细胞输出进入周围培养基的能力的遗传序列。这些遗传序列可以为内源性或外源性的。将2-丁醇输出到周围培养基的能力可以通过编码跨膜运输途径、至细胞膜的靶向途径、至细胞膜的排泄途径的遗传序列来赋予,或可以通过跨细胞膜的简单扩散梯度来赋予。
例如,在细菌的情况下,跨膜途径可以是以下的任一种:存在于革兰氏阴性细菌的膜中的I型、II型、III型、IV型、V型、VI型转运体;存在于革兰氏阳性细菌的膜中的Sec或TaT途径;革兰氏阴性细菌中的囊泡胞吐途径;或革兰氏阳性细菌中的N端加标签途径。
然而,优选地,通过简单扩散将2-丁醇产物自细菌或真菌细胞输出。
在优选的实施方案中,用于发酵步骤的生物体是植物乳杆菌、亚利桑那乳杆菌和/或巴氏梭菌。
可选地,使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵以生产原始原料的步骤可以包括使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵以生产乙偶姻。
因此,根据本发明的第一方面的另外优选的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生乙偶姻;
(ii)从乙偶姻形成2,3-丁二醇;
(iii)从2,3-丁二醇形成2-丁酮;
(iv)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(v)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
可选地,根据本发明的第一方面的另外的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生乙偶姻;
(ii)从乙偶姻形成甲基乙烯基酮;
(iii)从甲基乙烯基酮形成2-丁酮;
(iv)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(v)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
优选地,糖向乙偶姻的发酵为酶催化的。进行这种发酵的方法在本领域是众所周知的,例如,由Hespell在Current Microbiology第32卷(1996),第291-296页中描述了一种这种方法,且在欧洲专利第EP0430406B1号中还描述了另外的方法。
特别地,EP0430406B1公开了通过使用震动发酵培养将糖来源转化成高产量的乙偶姻,其中通过乳酸细菌来进行该转化。
EP0430406B1描述了,乳酸细菌可以从丙酮酸来源比如柠檬酸或葡萄糖以高水平生产乙偶姻。具体地,高水平的乙偶姻可以在添加有金属盐和铁卟啉的来源下,以震动发酵技术从乳酸细菌与糖来源的需氧发酵来产生。
因此,优选地,在将糖转化成乙偶姻的步骤中使用的细菌是野生型细菌,更优选地为野生型乳酸细菌,还更优选地为乳球菌属、明串珠菌属 (Leuconostoc)或乳杆菌属的野生型乳酸细菌,还更优选地为以下物种的野生型乳酸细菌:乳酸链球菌(Streptococcuslactis)(ATCC 11007)、乳酸乳球菌(FERM-BP-2805)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(FERM-BP-2806)、干酪乳杆菌(ATCC334)或乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)(ATCC19254)。
任选地,在将糖转化成乙偶姻的步骤中使用的细菌可以被通过本领域已知的相关技术修饰使得其进行这种转化的能力被以有利的方式增强或改变。
优选地,糖底物源自任何能够通过发酵细菌来利用的碳源。更优选地,糖底物是葡萄糖或乳糖。
适宜地,用来将糖转化成乙偶姻的细菌伴随供应糖底物被发酵,且从发酵培养基中分离乙偶姻产物。可以使用任何合适的发酵技术。然而,优选地,发酵培养基是MRS培养基,更优选地,MRS培养基如EP0430406B1的第4页第5行所描述的来制备,其可以外推至工业情况。优选地,使用的发酵技术如EP0430406B1的任一个实施例中所描述的,其也可以外推至工业情况。更优选地,使用的发酵技术是0430406B1的实施例3中描述的发酵技术。
优选地,甘油向乙偶姻的发酵为酶催化的。进行这种发酵的方法在本领域是众所周知的,例如,在上述PCT申请WO2007/130521以及更早的由Dobrogosz等人Journal ofBacteriology第84卷(1962)第716-723的出版物中描述了一种这种方法。
特别地,Dobogosz等人证明,某些生物体直接从甘油生产乙偶姻的知识早在1962年就已经存在。表3示出了乙偶姻在细菌戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)中的显著累积。
Dobrogosz描述,在需氧发酵条件下,来自科乳杆菌科(Lactobacillaceae)(或乳酸细菌)的细菌可以通过固有途径从甘油底物生产乙偶姻,所述固有途径通过关键中间体丙酮酸来进行。
因此,优选地,在将甘油转化成乙偶姻的步骤中使用的细菌是野生型细菌,更优选地为野生型乳酸细菌,还更优选地为片球菌属(Pediococcus) 或链球菌属的野生型乳酸细菌,还更优选地为物种戊糖片球菌Az-25-5/啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)或粪链球菌(Streptoccocus faecalis)B33A/10C1的野生型乳酸细菌。
任选地,在将甘油转化成乙偶姻的步骤中使用的细菌可以被通过本领域已知的相关技术修饰使得其进行这种转化的能力被以有利的方式增强或改变。
优选地,甘油底物源自工业废物的副产物,使得本发明方法的总生态影响或化石燃料使用减到最少。这类废甘油的合适来源包括但不限于:生物柴油生产、脂肪皂化、酒精饮料生产、棕榈油生产或油脂化学过程。优选地,甘油底物源自生物柴油生产。
适宜地,用来将甘油转化成乙偶姻的细菌伴随供应甘油底物被发酵,且从发酵培养基中分离乙偶姻产物。可以使用任何合适的发酵技术。然而,优选地,发酵培养基是添加有甘油底物的NYE基础培养基,更优选地,发酵培养基是如Dobrogosz的第717页描述的添加有如Dobrogosz的表3中描述的至少0.163M甘油的NYE基础培养基。优选地,所使用的发酵方法如Dobrogosz的第717页所描述,其可以外推至工业条件,其中仅甘油存在于NYE培养基中且未添加葡萄糖,适宜地维持需氧生活以便允许在甘油底物上的生长。优选地,以批次型布置实施发酵,其中将每批次发酵进行持续24小时和48小时之间的时间。
优选地,通过一种或更多种生物体来进行发酵。更优选地,通过能够生产将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成乙偶姻所必需的一种或更多种酶的生物体来进行发酵。优选地,通过野生型生物体来进行发酵,所述野生型生物体天然表达相关的将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成乙偶姻所必需的一种或更多种酶。因此,更优选地,通过包括内源性遗传序列的野生型生物体来进行发酵,所述内源性遗传序列编码将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成乙偶姻所必需的一种或更多种酶。优选地用于本发明的这类生物体的实例详述于描述这类发酵过程的上述参考文献中。
可选地,通过遗传修饰的生物体来进行发酵,所述生物体已经被修饰 来表达将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成乙偶姻所必需的一种或更多种酶。因此,优选地,重组生物体中的每个包括表达载体,该表达载体进而包括编码将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体转化成乙偶姻所必需的一种或更多种酶的外源性遗传序列,加上在宿主生物体中实现其表达所必需的任何另外的遗传序列,比如,但不限于:启动子、终止子、下游或上游效应子、抑制因子、激活子、增强子、结合辅因子等等。
优选地,用于使糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵成乙偶姻的一种或更多种宿主生物体是细菌或真菌。因此,优选地,宿主细菌或真菌还包括编码将所产生的乙偶姻自细菌细胞输出进入周围培养基的能力的遗传序列。这些遗传序列可以为内源性或外源性的。将乙偶姻输出到周围培养基的能力可以通过编码跨膜运输途径、至细胞膜的排泄途径、至细胞膜的靶向途径的遗传序列来赋予,或可以通过跨细胞膜的扩散梯度来简单赋予。
例如,在细菌的情况下,跨膜途径可以是以下的任一种:存在于革兰氏阴性细菌的膜中的I型、II型、III型、IV型、V型、VI型转运体;存在于革兰氏阳性细菌的膜中的Sec或TaT途径;革兰氏阴性细菌中的囊泡胞吐途径;或革兰氏阳性细菌中的N端加标签途径。
然而,优选地,通过简单扩散将乙偶姻产物自细菌或真菌细胞输出。
在优选的实施方案中,用于发酵步骤的生物体是乳酸乳球菌和/或戊糖片球菌。
优选地,在发酵中使用的糖是天然存在的单糖或二糖。这类糖包括但不限于:葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、木糖、果糖、古洛糖、来苏糖、甘露糖、鼠李糖、苏糖、塔罗糖、艾杜糖(iodose)、蔗糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、芸香糖、芸香酮糖(rutinulose)或木二糖。更优选地,所述糖是葡萄糖或麦芽糖。还更优选地,糖是葡萄糖、尤其D-葡萄糖。
可选地,用于发酵的糖可以作为天然存在的多糖来提供,所述多糖然后能够被发酵生物体或其他另外的酶水解以产生以上单糖和二糖。合适的多糖包括但不限于:纤维素、直链淀粉、支链淀粉、肝糖、阿糖基木聚糖、几丁质、果胶等等。
优选地,以厌氧或微需氧方式来实施通过生物体的发酵。
合适的厌氧发酵技术包括本领域通常已知的那些技术,比如但不限于:深层发酵、表面发酵、半固态发酵或固态发酵。优选地,使用的发酵技术是深层发酵,因为其易于自动操作且因此效率较高。
优选地,在如本领域已知的合适的发酵液中来实施通过生物体的发酵。优选地,发酵液包括:与水混合的糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体、生物体、丰富培养基或基本培养基加上另外的组分,所述另外的组分为比如但不限于:氮源,比如氨溶液;矿物盐,比如钙、镁、锌和铜;和微量元素,比如硒、硼、铁、锰、磷和硫;螯合剂,比如EDTA;亚铁氰化物;木炭;阳离子交换树脂;消泡剂,比如硬脂醇、棉籽油、亚麻籽油、橄榄油、蓖麻油、硅酮或磺酸盐;以及甲醇。
优选地,在发酵过程期间,将糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体底物进料到发酵培养液中以避免底物抑制酶过程。优选地,糖和/或甘油在发酵培养液内的浓度维持在至少约25g/L。更优选地,糖和/或甘油在发酵培养液内的浓度维持在约25g/L到125g/L之间。优选地,通过使用向发酵培养液中恒定进料底物来将糖和/或甘油维持在这些水平之间,其中进料浓度至少足以保持大部分宿主生物体活着,但不足以抑制产物形成。
微生物可转化的气体可以以0.1-15mol/L.hr的水平、更优选地0.2-5mol/L.hr的水平、最优选地0.3-1mol/L.hr的水平进料到发酵底物中。
本发明的发酵和BVMO催化的反应可以是连续的或分批的,优选地使用连续方法。
如关于糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,从发酵培养液中产生的产物2-丁醇或乙偶姻在原位被移除,以避免产物抑制发酵过程。因此,优选地,2-丁醇和/或乙偶姻在发酵培养液中的浓度保持在能够抑制发酵过程的水平以下,优选地在约50g/L以下,更优选地在约25g/L以下,还更优选地在约10g/L以下。
如关于2-丁醇和/或乙偶姻的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,2-丁醇和/或乙偶姻的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,小心控制氮源。优选地,氮源是氨溶液且优选地其以约0-4g/L的浓度存在于培养液中。
如关于氮源的浓度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大20%的边际限制。然而,优选地,氮源的浓度在高于或低于所述值10%内。
优选地,将培养液保存在用于工业目的的大尺寸的容器中。容器可以是在40立方米到200立方米范围内的罐或者在200立方米到900立方米容量范围内的更大的发酵罐。
优选地,保持发酵培养液无菌以停止任何外来微生物生长。
优选地,在使来自微生物的期望的产物产量最大化的最佳的温度下来进行发酵。优选地,在以下温度下来进行发酵:约20℃和50℃之间,优选地约20℃到35℃之间,最优选地约28℃-32℃之间。
如关于温度使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大10%的边际限制。然而,优选地,温度在高于或低于所述值5%内。
优选地,在对于细菌代谢最佳的pH—pH 6.5到pH 8.5下来进行发酵。更优选地,缓冲液将反应混合物维持在约pH 7.3和pH 7.7之间的pH。还更优选地,缓冲液将反应混合物维持在约7.5的pH。
如关于pH使用的术语“约”指示高于或低于所述值最大10%的边际限制。然而,优选地,pH在高于或低于所述值5%内。
优选地,搅动发酵培养液;优选地,剧烈搅动发酵培养液。搅动允许糖底物围绕生物体均匀循环且增加糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体 摄取到生物体中,以用于转化成期望的产物。可以通过本领域已知的任何合适的方法实现搅动,例如:气升技术、挡板、Rushton叶片或圆盘式涡轮、开放涡轮式叶轮或船舶叶轮。
如以上提及的,方法还可以包括从生物质获得糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体的步骤,其中术语“生物质”在本文定义为活着的或以前活着的植物或动物物质,且其可以被视为废物质或意图如本发明所描述来使用的物质。
因此,根据本发明的第一方面的另外的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)从生物质获得糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体;
(ii)使所述糖或甘油发酵来产生原始原料;
(iii)从所述原始原料形成2-丁酮;
(iv)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(v)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
优选地,使用的生物质包括大量的碳水化合物,尤其优选的是为葡萄糖来源的碳水化合物,比如,但不限于:淀粉、纤维素、肝糖、阿糖基木聚糖、几丁质或果胶。
可选地,使用的生物质包括大量的脂肪,尤其优选的是为甘油来源的脂肪或油,尤其甘油三酸酯。合适的甘油三酸酯包括任何容易从植物或动物来源得到的油或脂肪。这类油和脂肪的实例包括:棕榈油、亚麻籽油、菜籽油、猪油、黄油、鲱鱼油、椰子油、植物油、葵花籽油、蓖麻油、大豆油、橄榄油、可可脂、酥油、鲸脂等等。
生物质可以包括一种或更多种不同的生物质来源。合适的生物质来源的实例如下:原始木材、能源作物、农业残留物、食物废物和工业废物或共产物。
原始木材生物质来源可以包括但不限于:木片、树皮、碎片、原木、锯屑、木屑颗粒或木块(briguettes)。
能源作物生物质来源可以包括但不限于:短期轮作的矮树林或森林;非木质的草地,比如芒草、大麻、柳枝稷、芦苇或黑麦;农作物,比如糖、淀粉或油作物;或水生植物,比如微型或大型藻类及野草。
农业残留物可以包括但不限于:谷壳、稻草、玉米秸杆、面粉、谷粒、家禽粪便、肥料、泥浆或青贮饲料。
食物废物可以包括但不限于:皮/外皮、外壳、荚、果核、籽/果仁、动物或鱼的不可食用部分、来自果汁和油提取物的浆、来自酿造的废麦糟或啤酒花、家用厨房废物、猪油或油或脂肪。
工业废物可以包括但不限于:包括托盘(pallets)的未经处理的木材、处理过的木材、包括MDF/OSD的木材复合物、木材叠层、纸浆/撕碎物/废物、包括纤维/纱线/流出物的纺织物、或污水污泥。
在其中糖是期望的一个优选的实施方案中,优选地,所使用的生物质是一种木质纤维素来源或不同木质纤维素来源的混合物。更优选地,所使用的生物质是一种木质纤维素能源作物或木质纤维素能源作物的混合物。还更优选地,所使用的木质纤维素能源作物富含源自基础糖比如葡萄糖或麦芽糖的碳水化合物,但相对容易以高速率生长,比如短期轮作草。最优选地,所使用的生物质是芒草。
在其中甘油是期望的另一优选的实施方案中,优选地,所使用的生物质是一种甘油三酸酯来源或甘油三酸酯来源的混合物。更优选地,所使用的生物质是油或脂肪的混合物的一种或更多种。还更优选地,所使用的油或脂肪容易源自动物和/或蔬菜废物。最优选地,所使用的生物质是棕榈油。
任选地,可以使用以上列出的生物质的任一种的混合生物质来源,使得一起生产糖和甘油。
优选地,通过从原始生物质产生水解产物而从生物质来获得糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体。优选地,水解产物包含多种糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体以及其他副产物或细胞碎片。优选地,水解产物在用作用于发酵的糖/甘油/气体底物之前经历多种纯化步骤,这类纯化步骤包括但不限于:过滤、离心和化学清洗。
优选地,从生物质获得的水解产物中包含的糖是天然存在的单糖或二糖。这类糖包括但不限于:葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、木糖、果糖、古洛糖、来苏糖、甘露糖、鼠李糖、苏糖、塔罗糖、艾杜糖(iodose)、蔗糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、芸香糖、芸香酮糖(rutinulose)或木二糖。更优选地,所述糖是葡萄糖或麦芽糖。还更优选地,糖是葡萄糖、尤其D-葡萄糖。
优选地,通过以下方法来从原始生物质产生水解产物:比如,但不限于机械撕裂、研磨、压碎、挤制、化学处理—比如酸/碱活动、汽蒸或水解,以便从碳水化合物和甘油三酸酯分别释放糖和/或甘油。这对于生物质的木质来源可能特别需要,其中必须分解纤维素和木质素的大生物聚合物以达到简单的糖。一旦水解产物已分离且中和,则其优选地然后与水、丰富培养基或基本培养基混合以产生基础形式的发酵培养液。
最优选地,总是使水解产物经受去离子化以移除任何微量重金属,所述重金属可以充当要用于发酵步骤中的生物体的酶抑制剂。
可选地,可以在与以上方法的发酵步骤同时而不是在其之前来从生物质产生水解产物,比如通过意指“同步糖化与发酵”的术语“SSF”所知的。
根据本发明的第一方面的特别优选的实施方案,提供生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)从生物质获得糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体;
(ii)使所述糖和/或甘油和/或微生物可转化的气体发酵来产生2-丁醇;
(iii)从所述2-丁醇转化成2-丁酮;
(iv)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将所述2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(v)处理所生产的丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
根据本发明的第二方面,提供制备甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的聚合 物或共聚物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)根据本发明的第一方面制备甲基丙烯酸甲酯或其衍生物;
(ii)将(i)中制备的甲基丙烯酸甲酯任选地与一种或更多种共聚单体聚合,以产生聚合物或其共聚物。
有利地,如果并非所有单体残留物都源自除化石燃料以外的可再生生物质来源,这类聚合物将具有可观的部分。
在任一情况下,优选的共聚单体包括:例如单烯属不饱和羧酸及二羧酸及其衍生物,比如酯、酰胺和酐。
特别优选的共聚单体是丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸二甲氨乙酯、二缩三丙二醇二丙烯酸酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、异氰酸酯,包括甲苯二异氰酸酯和p,p′-二苯甲烷二异氰酸酯、丙烯腈、丁二烯、丁二烯与苯乙烯(MBS)及ABS,条件是在(i)中的所述酸单体或(ii)中的所述酯单体与所述共聚单体中的一种或更多种的任何给定共聚作用中,所述以上共聚单体中的任一种不为选自以上(i)或(ii)中的甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯的单体。
当然还可能使用不同共聚单体的混合物。共聚单体自身可以或可以不通过如来自以上(i)的单体的相同的方法来制备。
根据本发明的第三方面,提供从根据本发明的第二方面的方法形成的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)均聚物或共聚物。
有利地,本发明提供用于从生物来源生产MMA及其衍生物的方法,所述方法通过使用Baeyer-Villiger单加氧酶来以工业可用的水平催化脂肪酮2-丁酮向丙酸甲酯的异常转化。
本文包含的所有特征可以与以上方面的任一个来组合,以允许形成2- 丁酮以用于使用BVMO酶来将其转化成丙酸甲酯的任何组合。
为了更好地理解本发明,且显示可以如何实行本发明的实施方案,现在将通过示例的方式参考以下附图和实施例,其中:
图1示出不同浓度的2-丁酮被5μM CHMO的转化率。每个反应在室温下在1mL包含100uM NADPH和10mM Na2HPO3的pH 7.5的50mM Tris-HCl中持续24小时。
实施例1—2-丁酮向丙酸甲酯的BVMO转化
化学品及酶
所有化学品为分析级且从Sigma Aldrich获得。表达来自不动杆菌属NCIMB 9871的环己酮单加氧酶(CHMO,EC1.14.13.22)并纯化,与热稳定的亚磷酸盐脱氢酶(PTDH,EC1.20.1.1)的N端融合,以用于辅因子再生,如上所述。
生物催化方案
在15ml耐热玻璃试管中进行转变。反应体积(1ml)包含在pH 7.5的50mM Tris-HCl中的5mM 2-丁酮、100uM NADPH、10mM Na2HPO3和5μM CHMO。在24℃在轨道式震动(200rpm)下培育混合物。为测定转化率,使用0.5ml包含作为内标物的0.1%均三甲苯(1,3,5-三甲基苯)的1-辛醇来萃取1ml反应体积。通过涡旋1min,然后离心步骤(5000rpm)持续10min来萃取样品。移出有机层,用MgSO4干燥且放置在气相色谱分析(GC)小瓶中。在装配有ATTM-5柱的Shimadzu GC仪器(Grace Discovery Sciences)上发生GC分析。使用以下温度曲线来分离组分:40℃下6min,然后以每分钟20℃增加至250℃。在相同环境下进行不含酶且具有不同量的底物(2-丁酮)和产物(丙酸甲酯、乙酸乙酯)的空白反应,且该空白反应用来准备用于产物鉴定和转化确定的校准曲线。
GC分析
以下的表1详述了化合物通过GC然后用1-辛醇+0.1%均三甲苯从pH7.5的50mMTris-HCl中萃取的分离时间(AT-5柱,5mM所有化合物)。可以通过GC来可靠地分离所有三种化合物(1种底物和2种产物)。
表1.化合物在GC分离之后的滞留时间(RT)。用1-辛醇+0.1%均三甲 苯从pH 7.5的50mM Tris-HCl中萃取5mM的所有化合物且在Heliflex AT-5GC柱上运行。
化合物 | RT(min) |
2-丁酮 | 3.3 |
乙酸乙酯 | 3.5 |
丙酸甲酯 | 3.7 |
均三甲苯 | 10.85 |
溶剂(1-辛醇) | 12.4 |
丙酸甲酯的合成
以下表2详述了2-丁酮通过CHMO向乙酸乙酯和丙酸甲酯的转化。通过CHMO融合伴侣PTDH来进行辅因子再生(1)。明显地,24小时后形成工业显著量的丙酸甲酯。
表2.5mM 2-丁酮通过5μM CHMO的转化率。反应在室温下在1mL包含100uM NADPH和10mM Na2HPO3的pH 7.5的50mM Tris-HCl中持续24小时。通过GC进行产物鉴定和确定。
产物 | 转化率(%) |
乙酸乙酯 | 40 |
丙酸甲酯 | 10 |
使用以上针对表2中CHMO所述的方法来测试另外的BVMO酶对2-丁酮向丙酸甲酯的转化。表3示出了筛选包括CHMO的十种BVMO酶A-J的结果。对于BVMO酶、CPDMO和HAPMO,20小时后形成工业显著量的丙酸甲酯。
表3.100mM 2-丁酮通过5μM CHMO的转化率。反应在24℃下在1mL包含100uM NADPH和10mM Na2HPO3的pH 7.5的50mM Tris-HCl中持续20小时。通过GC进行产物鉴定和确定。实例K是使用过氧化氢的2-丁酮的对照。
实施例2-2-丁酮向丙酸甲酯的BVMO转化的底物效应
图1示出,较高的底物浓度产生更多期望的异常产物。例如:与5mM2-丁酮一起培育产生比率为5:1的乙酸乙酯:丙酸甲酯,且与1000mM 2-丁酮一起培育产生1.5:1的比率。
实施例3-10
共溶剂对2-丁酮转化的影响
测试多种共溶剂对在不动杆菌属DSM 17874CHMO与2-丁酮的反应中形成的产物的比率的影响。如在先前的实施例中,观察到200mM 2-丁酮对此比率具有积极效果。特别地,增加2-丁酮的浓度导致形成更多丙酸甲酯,这改良了乙酸乙酯:丙酸甲酯比率。在此浓度(200mM)下测试许多共溶剂。如从表4中可以看到,200mM甲醇具有显著效应,使该比率完全有利于丙酸甲酯地逆转。在这些条件下,形成多于乙酸乙酯的丙酸甲酯。测试的其他共溶剂也显示积极效果。二噁烷、2-丁醇、丙酮和乙腈都对该比率具有显著的积极效果。
表4.不同共溶剂对在5mM 2-丁酮通过不动杆菌CHMO的转化中形成的产物比率的影响。转化在24℃下在1ml pH 7.5的50mM Tris-HCl中进行持续18hr。酶浓度为8μM。
实施例11-13
还研究了共溶剂对总转化量的影响且在表5中突出显示。在某些情况(二噁烷、丙酮&乙腈)下形成显著较多的丙酸甲酯而形成较少的乙酸乙酯。
表5.不同共溶剂对2-丁酮通过不动杆菌属CHMO向乙酸乙酯和丙酸甲酯的转化的影响。将无共溶剂的转化设定为100%。如通过校准曲线确定的,无共溶剂的反应的绝对转化为4.1mM乙酸乙酯和0.9mM丙酸甲酯。转化在24℃下在1ml pH 7.5的50mM Tris-HCl中进行持续18hr。酶浓度为8μM,2-丁酮浓度为5mM。
*未确定相对转化率,因为2-丁酮是底物且添加200mM显然不允许计算合理的相对转化率。
为报偿在共溶剂存在下底物和产物的不同萃取效率,此处使用共溶剂来重新进行校正以排除任何显著差异。
实施例14-16
一组新颖BVMO的纯化&筛选其以用于2-丁酮的转化。
已经实现几种不同BVMO的过表达和纯化,且在表6中概述。将基因全部克隆到pCRE3C亚磷酸盐脱氢酶融合载体中且在大肠杆菌TOP10中表达。通过将培养温度限制到17℃,获得RmCHMO和XfCHMO的显著可溶过表达。获得BpCHMO的显著可溶过表达。纯化方案包括在具有以下添加剂的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中通过超声处理制备无细胞提取物:10%甘油、0.5mM二硫苏糖醇、100mM NaCl和25mM咪唑。
表6.一组新颖BVMO的纯化以及2-丁酮的转化。此表中包括来自不动杆菌属的CHMO作为参考。其他BVMO都如上所述表达且纯化。所有经纯化的BVMO蛋白质的产量范围在每100ml培养物(Terrific Broth)10mg和 20mg蛋白质之间。转化在24℃下在具有100mM 2-丁酮的1ml pH 7.5的50mM Tris-HCl中进行持续18hr。在此实验中,酶浓度各不相同:8μMAcCHMO&XfCHMO、10μM RmCHMO。由于用于转化的亚磷酸盐浓度是限定的(25mM),因此当确定转化率时使用此值(即,100%转化率=25mM丙酸甲酯)。
AcCHMO:来自不动杆菌属NCIMB 9871的环己酮单加氧酶;XfCHMO,来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶;RmCHMO,来自红球菌属菌株HI-31的环己酮单加氧酶。
通过离心澄清细胞提取物且在4℃下与Ni2+-琼脂糖树脂一起培育持续2hr。用相同的缓冲液洗涤柱材料,之后将纯蛋白质洗脱为浓缩的黄色级分(或者为富含酶的情况下的浅色带)且通过凝胶过滤脱盐。
安慰地,所有经纯化的CHMO展示对2-丁酮相似的活性,将其转化成丙酸甲酯和丙酸乙酯,且所有经纯化的CHMO具有当增加2-丁酮的浓度时所形成的产物的比率向有利于丙酸甲酯移动的相同特征。不同CHMO对丙酸甲酯具有相似转化量,但形成的产物的比率不相同。
如将领会,某些实例显示了使用不同的BVMO酶来生产丙酸甲酯或乙酸乙酯。在这些实例中,有利地示出特定的BVMO酶优于乙酸乙酯来生产丙酸甲酯。然而,所测试的BVMO酶的某些显示根本不转化,或者仅转化成乙酸乙酯。有利地,本发明人还已经发现了在异常转化中有惊人活性的BVMO酶。在本发明的此优选特征中,可以将不显示向丙酸甲酯转化的BVMO酶描述为比较实例,即实例A、B、D、E和H-J。
关注涉及所有文章和文件,这些文章和文件与同本申请有关的说明书同时提交或者在其之前提交,并且这些文章和文件与本说明书一起向公众检查公开,且所有这类文章和文件的内容通过引用并入本文。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合结合,其中这类 特征和/或步骤的至少某些互相排斥的组合除外。
除非另外明确说明,本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的每个特征可以通过用作相同、等效或相似目的的可选的特征替代。因此,除非另外明确说明,公开的每个特征仅是一系列通用的等效或相似特征的一个实例。
本发明不受任何前述实施方案细节的限制。本发明扩展至本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任何一个新颖的特征,或本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖组合,或者扩展至如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖组合。
Claims (24)
1.一种生产甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使用Baeyer-Villiger单加氧酶将2-丁酮转化成丙酸甲酯,以及
(ii)处理所生产的所述丙酸甲酯以获得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物;
其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶选自环己酮单加氧酶、4-羟基苯乙酮单加氧酶或环十五酮单加氧酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述丙酸甲酯通过在合适的催化剂存在下与甲醛或其合适的来源反应被处理以生产甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是野生型酶,并且其中所述野生型Baeyer-Villiger单加氧酶的细菌来源是来自以下细菌属的细菌:不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短枝单胞菌属(Brachymonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、外瓶霉属(Exophiala)、短杆菌属(Brevibacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、链霉菌属(Streptomyces)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或假单胞菌属(Pseudomonas)。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是源自以下细菌物种的野生型酶:乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB 9871或Rhodococcus jostii RHA1或红球菌属HI-31(Rhodococcus sp.HI-31)或黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)或Brachymonas petroleovorans。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是选自以下酶组之一的I型Baeyer-Villiger单加氧酶:环己酮单加氧酶(CHMO),EC编号为1.14.13.22;4-羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO),EC编号为1.14.13.84;环十五酮单加氧酶(CPDMO)。
6.根据权利要求5所述的方法,其中环己酮单加氧酶(CHMO)是GenBank:BAA86293.1;4-羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO)是GenBank:AAK54073.1;并且环十五酮单加氧酶(CPDMO)是GenBank:BAE93346.1。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶选自以下酶之一:来自乙酸钙不动杆菌NCIMB 9871的环己酮单加氧酶、来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶、来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶、来自Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶、4-羟基苯乙酮单加氧酶或环十五酮单加氧酶。
8.根据权利要求7所述的方法,其中来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶是GenBank:CAD10801.1;来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶是GenBank:BAH56677.1;来自Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶是GenBank:AAR99068.1;4-羟基苯乙酮单加氧酶是GenBank:Q93TJ5.1并且环十五酮单加氧酶是GenBank:BAE93346.1。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是选自以下的环己酮单加氧酶:来自乙酸钙不动杆菌NCIMB 9871的环己酮单加氧酶、来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶、来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶或来自Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶。
10.根据权利要求9所述的方法,其中来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶是GenBank:CAD10801.1;来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶是GenBank:BAH56677.1并且来自Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶是GenBank:AAR99068.1。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是环己酮单加氧酶。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是源自以下的环己酮单加氧酶:乙酸钙不动杆菌NCIMB 9871、黄黄色杆菌或红球菌属HI-31。
13.根据权利要求12所述的方法,其中来自黄黄色杆菌的环己酮单加氧酶是GenBank:CAD10801.1;以及来自红球菌属HI-31的环己酮单加氧酶是GenBank:BAH56677.1。
14.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是源自荧光假单胞菌(Pseudomonas flourescans)的4-羟基苯乙酮单加氧酶。
15.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶是源自假单胞菌属HI-70(Pseudomonas sp.HI-70)的环十五酮单加氧酶。
16.根据权利要求1或2所述的方法,其中在以上方法的反应混合物中包括至少一种共溶剂,其中所述共溶剂选自以下之一:甲醇、2-丁醇、叔丁醇、二噁烷、丙酮或乙腈。
17.根据权利要求16所述的方法,其中使用的所述共溶剂是甲醇。
18.根据权利要求16所述的方法,其中共溶剂/底物的浓度是1000:1或更大mol:mol的Baeyer-Villiger单加氧酶。
19.根据权利要求11所述的方法,其中通过所述Baeyer-Villiger单加氧酶产生的丙酸甲酯:乙酸乙酯的比率是至少1:5。
20.根据权利要求11所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶以至少2%选择性的绝对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯,其中术语“绝对水平”指来自2-丁酮转化的在溶液中作为产物获得的丙酸甲酯的实际百分比值。
21.根据权利要求11所述的方法,其中所述Baeyer-Villiger单加氧酶以至少20%的相对水平将2-丁酮转化成丙酸甲酯,其中术语“相对水平”指选择性,即来自2-丁酮转化的在溶液中作为产物获得的丙酸甲酯与在溶液中作为产物获得的替代产物乙酸乙酯相比的百分比。
22.一种制备甲基丙烯酸甲酯或其衍生物的聚合物或共聚物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)根据权利要求1到21中任一项所述的方法制备甲基丙烯酸甲酯或其衍生物;
(ii)使(i)中制备的甲基丙烯酸甲酯任选地与一种或更多种共聚单体聚合,以生产其聚合物或共聚物。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述共聚单体是单烯属不饱和羧酸及二羧酸及其衍生物,包括酯、酰胺和酐。
24.根据权利要求22或23所述的方法,其中所述共聚单体选自:丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸二甲氨乙酯、二缩三丙二醇二丙烯酸酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、异氰酸酯,包括甲苯二异氰酸酯和p,p′-二苯甲烷二异氰酸酯、丙烯腈、丁二烯、丁二烯-苯乙烯、丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯以及丙烯腈-丁二烯-苯乙烯。
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