CN110591984B - 可降解甲苯、二甲苯与丙烯酸水混合废水的混合菌剂及其应用 - Google Patents

可降解甲苯、二甲苯与丙烯酸水混合废水的混合菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可降解甲苯、二甲苯与丙烯酸水混合废水的混合菌剂，含有短单胞杆菌(Brachymonas sp)LM‑R和拜叶林克氏菌(Beijerinckiacase sp)LM‑W。本发明还同时提供了上述混合菌剂在同时降解含甲苯、二甲苯与丙烯酸的混合废水中的应用：将混合菌剂接种至含甲苯、二甲苯与丙烯酸的混合废水中，直至短单胞杆菌LM‑R接种量OD415nm0.2‑0.4、拜叶林克氏菌LM‑W接种量OD415nm0.1‑0.2；然后于开放体系下搅拌、pH6.0‑7.0、25‑30℃的条件下进行降解，降解时间为至少24h时。

Description

可降解甲苯、二甲苯与丙烯酸水混合废水的混合菌剂及其 应用
技术领域
本发明涉及一种降解甲苯、二甲苯与丙烯酸混合废水的混合菌剂及其在甲苯与丙烯酸混合废水处理中的应用。
背景技术
机械设备等制造加工与维修过程中，常常进行油漆喷涂作业，喷涂所用油漆往往是较稠的原料漆经甲苯和二甲苯稀释而成，油漆喷涂作业过程中，喷涂件将附着约70％所喷射的油漆，约30的油漆以雾状进入喷房的空气中，产生大量具有强烈刺激性气味的有机气体，这些气体中含有大量的甲苯、二甲苯、丙烯酸等化合物，喷涂废气中的这些物质具有很强的生物毒性、刺激性，其可能引起肺、肝、肾、血液等器官的损害，甚至产生致癌性。含上述成分的有机废气排入环境中，长期暴露于这些气体中，从业人员将会产生严重健康危害，即使轻度也会引起食欲减退及白血球下降等症状，可见对上述油漆喷涂废气的控制与处理对企业员工和周边居民的健康保护意义重大。
在油漆喷涂有机废气处理领域，水幕法是近年使用较多的一种技术，其处理原理属于吸收法，是油漆喷涂有机废气湿法处理的一种，即通过水幕来吸收喷涂有机废气中的物质。该工艺实施过程中，水幕对油漆喷涂有机废气进行吸收，形成的废水中含有大量的苯、甲苯及丙烯酸等化合物，必须经过讲解处理，达到国家标准后才能排放，由于苯、甲苯含有苯环结构，通常性质稳定，难以降解，同时丙烯酸具有较强酸性等特征，导致该类混合废水可生化性差，因此现有处理技术主要采用利用高级氧化法技术为主，包括：臭氧氧化处理技术、光催化氧化处理技术、电催化氧化技术、Fenton氧化处理技术、高压脉冲等离子处理技术等，其处理原理是利用物质的强氧化性，通过氧化反应直接将有机物转化为CO2、H2O等无机物，但其存在操作条件苛刻，运行成本偏高等问题，影响到其的广泛应用和推广，因此需寻找经济高效的替代处理技术，国外研究发现只要找到合适的耐性微生物，生化性差的有机废水仍可采用微生物技术进行处理，这类技术不但处理效果较好，而且成本也较低，无二次污染，因而微生物技术受到广泛关注，而目前我国有关微生物降解处理含甲苯、二甲苯和丙烯酸混合废水的技术研究未见报道。
2019102771815的发明《分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌LM-W及其应用》公开了保藏编号为CGMCC No.17168的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W，其用途是处理含丙烯酸废水；即，去除含丙烯酸废水中的丙烯酸。
2019102828565的发明《分离自喷漆废水底泥的短单胞杆菌LM-R及其应用》公开了保藏编号为CGMCC No.17167的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R，其用途是处理含甲苯和/或二甲苯的废水，即，去除废水中的甲苯、二甲苯。
丙烯酸具有强酸性，其对微生物的毒性远大于甲苯/二甲苯，生化性非常差，丙烯酸、甲苯与二甲苯的混合废水为油漆生产企业生产废水的核心组分，由于同时具有三者的生物毒性的叠加效应，导致现有技术中能用于去除丙烯酸的菌剂与能用于去除甲苯/二甲苯的菌剂并没有通用性，目前未见采用微生物处理技术同时高效降解去除混合废水中丙烯酸、甲苯与二甲苯的研究报道，这也成为油漆生产废水微生物处理技术发展的难点，也是目前油漆生产废水处理中以高级氧化法技术为主的核心原因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可同时降解甲苯、二甲苯与丙烯酸混合废水的混合菌剂及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种可降解甲苯、二甲苯与丙烯酸水混合废水的混合菌剂，含有短单胞杆菌(Brachymonas sp)LM-R和拜叶林克氏菌(Beijerinckiacase sp)LM-W；
短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R的保藏编号为CGMCC No.17167，拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W的保藏编号为CGMCC No.17168。
作为本发明的混合菌剂的改进：由短单胞杆菌LM-R菌液和拜叶林克氏菌LM-W菌液组成，所述混合菌剂中，所述短单胞杆菌LM-R与拜叶林克氏菌LM-W的菌落数为2:1。
本发明还同时提供了上述混合菌剂在同时降解含甲苯、二甲苯与丙烯酸的混合废水中的应用：将混合菌剂接种至含甲苯、二甲苯与丙烯酸的混合废水中，直至短单胞杆菌LM-R接种量OD415nm0.2-0.4、拜叶林克氏菌LM-W接种量OD415nm0.1-0.2；然后于开放体系下搅拌、pH6.0-7.0、25-30℃的条件下进行降解，降解时间为至少24h时。
作为本发明应用的改进，降解条件(优选条件)为：pH7.0、30℃、短单胞杆菌LM-R与拜叶林克氏菌LM-W接种量的OD415nm比为0.2:0.1。
鉴此目前未见采用微生物处理技术同时高效降解去除混合废水中丙烯酸、甲苯与二甲苯的研究报道，发明人经长期研究发现，拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W、短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R，两者之间可共存，且工作过程存在协同关系，彼此之间可利用对方的代谢中间产物，消除对方代谢的障碍及代谢中间产物的生物毒性，使有机物的降解更加有利，实现了丙烯酸、甲苯与二甲苯同步高效降解去除，基于上述研究，本发明构建了同时高效降解去除混合废水中的甲苯、二甲苯与丙烯酸水的混合菌剂及其使用方法，为油漆生产废水处理提供了成本也较低，无二次污染的微生物处理技术。
在发明中：短单胞杆菌(Brachymonas sp)LM-R和拜叶林克氏菌(Beijerinckiacase sp)LM-W均能以甲苯、二甲苯、丙烯酸3种化合物为唯一碳源生长。短单胞杆菌(Brachymonas sp)LM-R和拜叶林克氏菌(Beijerinckiacase sp)LM-W对甲苯、二甲苯或丙烯酸对3种化合物的降解率与接菌量(OD415nm)相关。在相同接种总量(OD415nm)下，本发明所设定的混合菌剂的降解率要明显高于单一菌株，增效倍数在1.14-1.47之间。短单胞杆菌(Brachymonas sp)LM-R和拜叶林克氏菌(Beijerinckiacase sp)LM-W的最佳接种量(OD415nm)比值为0.2:0.1，甲苯、二甲苯及丙烯酸各l000mg/L的混合基础培养基培养1天，甲苯、二甲苯及丙烯酸的解率分别达到99.99％，99.99％和99.98％。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1菌株LM-R、LM-W对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解率与接种量(OD415nm)的曲线关系；
图2是不同接种比例下混合菌对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解效能的影响对比图；图2的每列中，从左至右依次为甲苯、二甲苯、丙烯酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
一、LM-R菌液的制备方法为：在100mL合成培养基(C6H12O6(葡萄糖)0.2％，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.7％，KH2PO4(磷酸二氢钾)0.3％，Na3C6H5O7(柠檬酸钠)0.05％，MgSO4·7H2O(7水硫酸镁)0.01％，(NH4)2SO4(硫酸铵)0.1％，H2O 100mL)中，通过接种环加入3-4个LM-R菌落斑；之后，将接种好的合成培养基在30℃,180r/min下振荡培养，获得LM-R菌液备用。
当振荡培养1.5天时，所得的LM-R菌液的OD415nm值约为2.943，菌落含量约为3.7×108个/mL。
LM-R是保藏编号为CGMCC No.17167短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R。
上述合成培养基的制备方法为：在H2O 100mL中加入C6H12O6(葡萄糖)0.2g，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.7g，KH2PO4(磷酸二氢钾)0.3g，Na3C6H5O7(柠檬酸钠)0.05g，MgSO4·7H2O(7水硫酸镁)0.01g，(NH4)2SO4(硫酸铵)0.1g，均匀混合后常规高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)，冷却至常温。
二、LM-W菌液的制备方法为：在100mL合成培养基(C6H12O6(葡萄糖)0.2％，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.7％，KH2PO4(磷酸二氢钾)0.3％，Na3C6H5O7(柠檬酸钠)0.05％，MgSO4·7H2O(7水硫酸镁)0.01％，(NH4)2SO4(硫酸铵)0.1％，H2O 100mL)中，通过接种环加入3-4个LM-W菌落斑。之后，将接种好的合成培养基在30℃,180r/min下振荡培养，获得LM-R菌液备用。
当振荡培养1.5天时，所得的LM-W菌液的OD415nm值约为2.467，菌落含量约为2.3×108个/mL。
LM-W是保藏编号为CGMCC No.17168的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W。
实施例1、接种量对单一菌株降解混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的影响
在装有100mL基础培养基的三角瓶中，混合加入作为碳源的甲苯、二甲苯及丙烯酸至含量分别为1000mg/L，以此作为待处理培养基；
所述基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O 1000mL，pH7.0。
在待处理培养基中加入菌液(LM-R菌液/LM-W菌液)进行接种，直至初始菌量OD415nm值分别为0.05，0.1，0.15，0.2，0.4作为各个实验组；以不接菌为对照，在30℃,180r/min下振荡培养1天，萃取，测定降解效果。具体为：培养结束后，吸取2mL培养液，分别加入4mL、4mL、3mL的石油醚萃取3次，合并所有的萃取液，加入1.00g无水硫酸钠进行吸水，然后除去无水硫酸钠，再加入溶剂--石油醚定容至10mL，用气相色谱检测，从而获得各个实验组的菌株降解率。每个处理3个重复。
气相色谱检测条件：Agilent 6890GC(G1530N/G3172A)气相色谱仪，HP-5(30mm×0.25mm×0.25μm)色谱柱，FID检测器，检测温度110℃，柱温120℃，进样口温度120℃，柱流：1.0mL/min，分流比为1：10，载气为N2(99.999％)，进样量为1μL。
降解率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量。
所得结果如下：
含甲苯、二甲苯及丙烯酸各1000mg/L的混合培养基(待处理培养基)分别接种单一短单胞杆菌(Brachymonas sp)LM-R或拜叶林克氏菌(Beijerinckiacase sp)LM-W菌株，直至初始菌量OD415nm值为0.05,0.1,0.15,0.2,0.4，培养1天后，3种化合物(甲苯、二甲苯及丙烯酸)的降解率见图1。
由图1可以看出，菌株LM-R和LM-W对混合培养基中浓度分别为1000mg/L的甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解率随接种量的增加而增加，菌株LM-R和LM-W对甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解效率与菌液接种量OD415nm值呈正相关，相关系数(R2)分别为0.8931、0.8847、0.9132和0.9021、0.9133、0.9364。
在相同接种量下，菌株LM-W对3种化合物的降解率要高于菌株LW-R，但接种量OD415nm大于0.2时，降解率增加幅度降低，这可能是由于随着接种量的增加，微生物生长所需的碳源相对不足，微生物间相互竞争导致有效菌源相差不多，由于接种量不同，单位生物量所对应的基质量不同，反应速率会表现出差异，因此从降解效果及降解率与单一菌株菌量比值的降解率看，接种量以OD415nm值0.15或0.2为宜。
实施例2、不同接种量比例对菌株混合降解混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的影响
在装有100mL基础培养基的三角瓶中，混合加入作为碳源的甲苯、二甲苯及丙烯酸至含量分别为1000mg/L，以此作为待处理培养基；
在待处理培养基中加入由LM-R菌液和LM-W菌液组合形成的混合菌液(混合菌剂)进行接种，分别设置如下的7个实验组：
接种量OD415nmLM-R:OD415nm LM-W为：0.1:0.1、0.1:0.2、0.2:0.1、0.2:0.2、0.2:0.4、0.4:0.2、0.4:0.4，于30℃，180r·min-1条件下振荡培养1天，萃取，测定降解效果，每个处理3个重复。
OD415nmLM-R:OD415nm LM-W为0.1:0.1，即代表在待处理培养基中加入由LM-R菌液、LM-W菌液组合形成的混合菌液，直至LM-R初始菌量OD415nm值为0.1、LM-W初始菌量OD415nm值为0.1；
其余实验组依次类推。
LM-R：LM-W按不同比例混合下，混合菌株对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解率存在较大差异(图2)，但总体趋势随接种总量的增加而增加，其中以比例为(0.2:0.1)对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解率最大，分别为99.99％、99.99％和99.98％。在接种比例(0.1:0.1)、(0.1:0.2)、(0.2:0.1)之间，混合菌株LM-R和LM-W对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解率随接种总量的增加而明显加快，在1天内的降解率由79.23％、78.51％、77.28％增至99.99％、99.99％增至99.98％，增加量分别为20.76％、21.48％和22.47％；之后，当LM-R和LM-W混合菌株接种比例为(0.2:0.2)、(0.4:0.2)、(0.2:0.4)、(0.4:0.4)时，混合菌株对3种化合物降解速率随接种总量的增加而增加的幅度不如之前那么明显，原因是3种化合物几乎全部被降解掉之故。可见合适比例的混合菌加入后可快速和高效降解掉混合废水中的甲苯、二甲苯及丙烯酸，实现废水的净化。
实施例3、不同接种比例下混合菌对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的理论降解率及增幅作用
为了更清楚的了解菌株LM-R和LM-W共存时对3种化合物降解是否存在协同作用，采用下式计算混合菌的理论降解率：PM＝1-(1-A1)(1-A2)(1-A3)(1-A4)……(1-AM)，式中PM表示不同比例下混合菌的理论降解率，A1，A2，A3，A4……AM指各单一菌株在不同接种量下的降解率，同时计算增幅作用，增幅作用＝混合菌的实际降解率/混合菌的理论降解率。当增幅作用大于1时，菌株LM-R和LM-W存在协同作用，当增幅作用小于1时，LM-R和LM-W存在拮抗作用，当增幅作用小于1时，菌株LM-R和LM-W存在加和作用，相关结果见表1。
表1、不同接种比例下混合菌对合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的实际、理论降解率及增幅作用
Figure BDA0002253048630000061
由表1可知，混合菌处理对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸增效倍数在1.14-1.47之间，增幅倍数大致随接种总量的增加先增加后降低的变化趋势，较低接种总量对3种化合物降解的增效作用明显，其中以接种比例(0.2:0.1)增效倍数最大，分别为1.50、1.47和1.44，较高接种总量的增幅作用有所下降，这可能是较高接种总量时微生物间相互竞争底物导致有效菌源降低之故。由表1可知，所有比例的菌株LM-R与LM-W混合接种，其对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解增效倍数均大于1，说明混合菌株对3种化合物的降解具有协同作用，这是因为混合菌酶系含量丰富，为对方提供生长所需的条件或消除对方代谢的障碍，使有机物的降解更加有利，结合接种总量、增效倍数和降解效率发现，菌株LM-R和LM-W的最佳混合接种量比值为0.2:01。
实施例4、混合菌剂对降解混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的动力学分析
在含甲苯、二甲苯及丙烯酸酯各1000mg/L的混合培养基(待处理培养基)分别对单一菌株LM-R、LM-W接种菌液至初始OD415nm0.3，混合菌接种量比值OD415nmLM-R:OD415nmLM-W＝0.2:0.1于30℃,180r/min条件下振荡培养，采用一级动力学模型对分别培养2、4、6、8、10、12、14、16、18h混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸残留量(Ct)和时间(t)进行拟合，降解动力学方程为Ct＝C0×e-kt(其中C，为t时间3种化合物残留量，C0为样品的初始浓度，K为降解速率常数)，半衰期T1/2＝ln2/K，分析菌株LM-R和LM-W混合对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解动力学过程。
混合菌株对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解动力学结果见表2，实验数据的拟合结果较好，混合菌株对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解率的相关系数(R2)在0.9873-0.9937之间，故可认为用一级动力学方程来描述混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸在基础培养基中的降解过程。通过计算得出混合菌的降解速率分别为0.0750、0.0744、0.0726h-1，半衰期分别为9.25、9.31、9.55h，可见混合菌更有对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解具有高效性，应用潜力大，其高效性是混合菌株协同作用的结果。
表2、混合菌株混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解的动力学参数
Figure BDA0002253048630000071
实施例5、混合菌株对不同浓度的混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解特征
含甲苯、二甲苯及丙烯酸各100、500、1000、3000、5000mg/L的基础培养基，按如下接种量混合加入LM-R和LM-W两种菌液，接种量OD415nmLM-R:OD415nm LM-W为：0.2:0.1，于30℃，180r/min条件下振荡培养1天，萃取，测定降解效果，每个处理3个重复。
表3、对不同浓度的混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解特征
Figure BDA0002253048630000072
Figure BDA0002253048630000081
LM-R和LM-W按最佳比例混合(OD415nmLM-R:OD415nm LM-W为：0.2:0.1)下，混合菌株对混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的降解适应浓度范围较大，从表3可知，对甲苯、二甲苯及丙烯酸各1000mg/L以内的混合废水中，经过1天以后，三种化合物基本被降解，其中甲苯、二甲苯及丙烯酸各1000mg/L的废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解率分别达到99.99％、99.99％和99.98％，之后随着甲苯、二甲苯及丙烯酸浓度的增加，经过1天处理，降解率有所下降，但对甲苯、二甲苯及丙烯酸各5000mg/L的混合废水，废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸降解率分别达到83.11％、82.98％和83.27％，可见合适比例的混合菌加入可快速有效的降解混合废水中的将高浓度的甲苯、二甲苯及丙烯酸，实现含甲苯、二甲苯及丙烯酸废水的净化。
实验1、某上海延锋汽车饰件系统有限公司喷涂车间处取得的含甲苯、二甲苯及丙烯酸各的混合废水，经检测，该混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的原始含量分别为1080mg/L，1353mg/L及2534mg/L；先按照常规pH调节方式调节混合废水pH至7.0；然后于开放体系下(敞开状态)搅拌、控制温度为30℃，选用如下表4所述的接种量，处理24小时后，混合废水中甲苯、二甲苯及丙烯酸的剩余含量如下表4所示。
表4
Figure BDA0002253048630000082
Figure BDA0002253048630000091
由表4可知，混合菌株按OD415nmLM-R:LM-W＝0.2：0.1接种处理中，混合废水中的甲苯、二甲苯及丙烯酸降解率分别在99.99％、99.99％及99.98％以上，综合降解效率及接种菌量的经济投入分析，可知混合菌株按OD415nmLM-R:LM-W＝0.2：0.1接种为优选比例。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.混合菌剂在同时降解含甲苯、二甲苯与丙烯酸的混合废水中的应用，其特征在于：
混合菌剂由短单胞杆菌LM-R菌液和拜叶林克氏菌LM-W菌液组成，所述混合菌剂中，所述短单胞杆菌LM-R与拜叶林克氏菌LM-W的菌落数为2:1，短单胞杆菌（Brachymonas sp.）LM-R的保藏编号为CGMCC No. 17167，拜耶林克氏菌（Beijerinckia sp.）LM-W的保藏编号为CGMCC No.17168；
将混合菌剂接种至含甲苯、二甲苯与丙烯酸的混合废水中，直至短单胞杆菌LM-R接种量OD415nm0.2-0.4、拜叶林克氏菌LM-W接种量OD415nm0.1-0.2；然后于开放体系下搅拌、pH6.0-7.0、25-30℃的条件下进行降解，降解时间为至少24小时。
2.根据权利要求1所述的应用 ，其特征在于：所述降解条件为： pH7.0、30℃、 短单胞杆菌LM-R与拜叶林克氏菌LM-W接种量的 OD415nm为 0.2:0.1。
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