CN104321073A - 包含骨桥蛋白及含钙和/或锶粒子的纳米粒子聚集体 - Google Patents

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里科·路易斯·梅尔
本特·尼瓦德
邓肯·斯图尔特·萨瑟兰
彼得·朗堡·魏谢
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Abstract

本发明涉及包括骨桥蛋白(OPN)和含钙和/或锶的一种或多种粒子的纳米粒子聚集体及其用于减少或预防生物膜生长或用于去除生物膜的用途。本发明还涉及这些纳米粒子聚集体用于治疗、缓解或预防生物膜相关疾病的用途。

Description

包含骨桥蛋白及含钙和/或锶粒子的纳米粒子聚集体
发明技术领域
本发明涉及包括骨桥蛋白(OPN)和含钙和/或锶的一种或多种粒子的纳米粒子聚集体及其用于减少或预防微生物生物膜生长或用于去除微生物生物膜的用途。本发明还涉及这些纳米粒子聚集体用于治疗、缓解或预防生物膜相关疾病的用途。
发明背景
微生物生物膜引起大量损害。细菌和真菌生物膜涉及众多人类疾病，包括细菌性心内膜炎、慢性伤口感染、植入物感染、中耳炎、龋齿、牙周炎和囊性纤维化。此外，生物膜在食品腐败和生物淤积中发挥重要作用，这两者在全世界都造成巨大的经济损失。而常规的抗生物膜方法的目的在于机械去除生物膜和/或杀死生物膜中的细菌，替代策略针对涉及微生物生物膜的形成(粘附、共聚集、生物膜成熟)的机制。微生物生物膜的有害影响仍是一个主要的全球性问题。例如，龋齿仍是最普遍的人类疾病。
WO 2005053628公开了OPN用于减少对牙齿珐琅质上斑菌生长和含骨桥蛋白配制品的用途。
延森(Jensen)等人(生物医学材料研究杂志(Journal of BiomedicalMaterial Research A)，2011年10月，第99卷，第1期)公开了包覆有OPN的羟磷灰石纳米粒子及其用于植入物包衣的用途。
奥尔特(Holt)等人(FEBS杂志276(2009)，2308-2323页)公开了使用OPN或OPN片段用于控制磷酸钙核的生长来生产磷酸钙纳米簇。
发明概述
本发明的诸位发明人已经发现，包括OPN和含钙粒子的纳米粒子聚集体在体外和体内出人意料地提供大的口服生物膜生长减少(参见例如实例6和8，以及图3和6)。这些纳米粒子聚集体在减少生物膜形成中是高效的，远远超过单独的OPN或无OPN的含钙粒子或其他型号粒子的情况。因此，通过组合OPN和含钙粒子导致改善的抗生物膜效果来得到明确的协同作用。此外，本发明人已经示出钙可以被锶代替。
因此，本发明的一个方面涉及用作一种药物的纳米粒子聚集体，其包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
本发明的另一个方面涉及用于医治、缓解和/或预防生物膜相关疾病的纳米粒子聚集体，其包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
本发明的又一个方面涉及包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜生长或用于去除微生物生物膜的用途。在本发明的一些实施例中，这种用途不是通过疗法来治疗人体或动物体。该生物膜可以是例如不与活的人或动物接触的生物膜。
本发明的一个方面涉及具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的另一个方面涉及包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙和如此的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜生长的用途。
本发明的又另一个方面涉及包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙和如此的混合物的纳米粒子聚集体的包衣组合物。
本发明的仍另一个方面涉及用作一种药物的具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的又另一个方面涉及用作用于医治、缓解或预防细菌感染的一种药物的具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的又另一个方面涉及包括纳米粒子聚集体的一种牙用配制品，其中这些纳米粒子聚集体具有化学计量式A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
一个方面涉及一种用于生产由OPN和磷酸钙形成的纳米粒子聚集体的方法，包括：
a)提供包括作为PO4 3-的磷酸盐的一种第一水溶液；其中pH在6-14的范围内；
b)提供包括Ca2+和/或Sr2+的一种第二水溶液；其中pH在6-14的范围内；
其中该第一、第二或两种水溶液都包含OPN；
c)将所述第一和第二溶液混合，由此形成包括纳米颗粒聚集体的一种悬浮液，这些纳米粒子聚集体包括1)OPN、2)磷酸锶、磷酸钙或如此的混合物，以及3)水溶性电解质；
d)任选地，从该悬浮液中去除大量的所述的水溶性电解质；
e)任选地，从水相中分离所述纳米粒子聚集体。
附图简要说明
图1A显示OPN结合至龋齿模型生物膜中的细菌。在生长期后，将生物膜在35℃下用荧光标记的OPN孵化45min。可以识别细菌，尤其链球菌的链的，尽管未使用细菌菌株。OPN对细菌表面的强亲和力将纳米粒子聚集体靶向生物膜。棒＝10μm。图1B显示含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体结合至体内生长的牙生物膜。将该生物膜在35℃下于含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体孵育30min，并用C-SNARF-4染色。这些含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体紧紧聚集在该细菌生物膜周围。棒＝20μm；
图2显示细菌生长不受OPN影响。轻链球菌(S.mitis)和内氏放线菌(A.naeslundii)生长在THB及含0.9g/l OPN的THB中。通过分光光度计法监测细菌的生长。误差棒表示标准差。显示OPN不具有杀细菌或抑制细菌作用；
图3示显示不同的药剂对龋齿模型中生物膜形成的影响，通过结晶紫染色确定。相对于1000nm的聚苯乙烯粒子、二氧化硅粒子(150nm、500nm和2000nm)、不含OPN的磷酸钙粒子聚集体和0.9g/l OPN，含OPN磷酸钙纳米粒子聚集体(HAP-OPN)强烈减少在流动细胞中形成的生物膜的量。误差棒表示标准差；
图4显示含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体(HAP-OPN)比二氧化硅粒子、聚苯乙烯粒子、溶液中的OPN和不含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体(HAP)显著结合更多结晶紫。在含OPN的纳米粒子聚集体的存在下形成的生物膜的量的结晶紫量化(在图3中示出)高估了该流动细胞中形成的生物膜的实际数量。误差棒表示标准差；
图5显示含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体减少了龋齿生物膜流动细胞模型中生长的生物膜的量。将生物膜用C-SNARF-4染色并用共聚焦显微镜成像。A：没有纳米粒子聚集体的情况下生长的生物膜。B：在生长过程中暴露于纳米粒子聚集体的生物膜。棒＝20μm；
图6示显示含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体强烈减少体内口腔生物膜生长。A：将在玻璃调和板上生长的生物膜在口内保持72h。每天执行5-6次NaCl浸渍(30-60分钟)。B：将在玻璃调和板上生长的生物膜在口内保持72h。每天用含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体执行5-6次浸渍(30-60min)。在同一时间由同一研究受试者佩戴两个玻璃调和板。棒＝20μm；
图7a-7e显示含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体缓冲了由龋齿模型的菌株在浮游培养物中生长时产生的酸；
图8a-8e显示含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体缓冲了由五种龋齿模型中的生物膜产生的酸。完成在含葡萄糖的THB上的生长后，将生物膜只与纳米粒子聚集体孵育。在暴露于纳米粒子聚集体的生物膜中，pH永不会降到5.5(珐琅质溶解的临界值)以下；
图9显示使用CuKα射线记录的X射线衍射图形。为清楚起见，已将针对个体材料的衍射图形垂直移动。对于所添加的15mg/ml的OPN量，得到纳米晶体磷灰石材料。在这个浓度以上，观察到大量非晶材料；在30和34mg/ml，在大的非晶背景散射的顶部观察到非常小的对应于纳米晶体磷灰石的衍射峰；
图10显示从图9的X射线衍射数据的里特维德优化提取的平均微晶尺寸。发现纳米晶体的形状是大致针形的，而形态长轴与与磷灰石的结晶学c轴一致。上部图显示所有数据的结果，而下部图显示在非常低浓度下观察到的对微晶尺寸的大的影响；对于12.5和15mg/ml OPN观察到的微晶尺寸的增加大概是由于混合的纳米晶体/非晶材料的形成；
图11显示纳米粒子聚集体的作为所添加的OPN的量的函数的热重量分析(TGA)数据。为清楚起见，已将数据沿纵坐标轴移动。自25℃-200℃的质量损失被分配到水的损失上，而自200℃至550℃的损失对应于有机材料并且自550℃到1200℃的损失被分配到碳酸盐的损失上；
图12显示从图11的TGA数据中提取的水、有机物和碳酸盐的质量分数。该有机和碳酸盐质量已被标准化为干物质质量(在200℃下的残余质量)；
图13显示纳米粒子聚集体的作为所添加的OPN的量的函数的FTIR数据。为清楚起见，已将数据沿纵坐标轴移动。随着OPN浓度增加，1300、1550和1650cm-1左右的酰胺峰的强度增加，表明更多的蛋白质与高浓度合成中的粒子相关联。观察到磷酸盐(900-1200cm-1)、碳酸盐(840-890cm-1)和酰胺(1595-1720cm-1)的特异峰；并且
图14显示从获得为磷酸盐(900-1200cm-1)、碳酸盐(840-890cm-1)和酰胺(1595-1720cm-1)的峰面积的比率的IR数据对有机和碳酸盐含量进行的估计。注意与由图12中的TGA得到的结果的良好一致性。
现将在以下部分更详细地描述本发明。
发明详细说明
如上所述，本发明的一个方面涉及用作一种药物的纳米粒子聚集体，其包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
因此，这些纳米粒子聚集体中的每一个优选同时包含OPN和一种包含钙和/或锶的第一粒子。
钙优选以其+2氧化态(Ca2+)存在。同样，锶优选以其+2氧化态(Sr2+)使用。
在本发明的上下文中，短语“Y和/或X”意指“Y”或“X”或“Y和X”。以相同的逻辑，短语“n1、n2、...、ni-1、和/或ni”意指“n1”或“n2”或......或“ni-1”或“ni”或组分“n1、n2,...ni-1、以及ni”的任何组合。
如此处所用的术语“骨桥蛋白”或“OPN”意指从牛奶中获得的骨桥蛋白，包括奶中天然存在的片段或通过蛋白酶裂解的源自OPN的肽，或基因拼接、磷酸化、或糖基化变体，如可从WO 01/49741中提出的方法可获得的。该奶可以是来自任何产奶动物(如乳牛、人、骆驼、山羊、绵羊、单峰骆驼和美洲驼)的奶。然而，来自牛奶的OPN目前由于可用性是优选的。全长骨桥蛋白(fOPN)是一种酸性的、高度磷酸化的、唾液酸丰富的钙结合蛋白。fOPN结合28摩尔的磷酸盐并且每摩尔约50摩尔的钙。fOPN的等电点为约3.0。该蛋白质存在于身体的许多组织中并且发挥信号传导和调节蛋白质的作用。它是生物矿化过程中的活性蛋白。OPN由许多细胞类型(包括骨细胞、平滑肌细胞和上皮细胞)表达。
所有量基于天然牛奶OPN，但可以很容易地被校正到其活性部分或来自另一个来源的OPN的对应量。OPN或其衍生物也可以被重组制备。
OPN存在于牛奶中，以全长牛OPN(如Swiss-Prot登录号P31096的位置17-278、或与Swiss-Prot登录号P31096的位置17-278具有至少95％序列一致性的肽)的形式和以全长牛OPN(例如Swiss-Prot登记号P31096的位置17-163或与Swiss-Prot登记号P31096的位置17-163具有至少95％的序列一致性的肽)的长N末端片段的形式，参见例如比索奈特(Bissonnette)等，乳品科学杂志(Journal of Dairy Science)，第95卷第2期，2012。
在本发明的背景中，术语“序列一致性”涉及在两个氨基酸序列之间或在两个核酸序列之间(优选地是等长的)进行的一致性的定量测量。如果待比较的两个序列不是等长的，必须将它们最佳拟合地对齐。序列一致性可以被计算为
(Nref-Ndif)*100)/(Nref)，
其中Ndif是对齐时这两个序列中不一致的残基的总数，并且其中Nref是参考序列的残基的数目。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC(Ndif＝2并且Nref＝8)将具有75％的序列一致性。空位算作一个或多个特定残基的不一致，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC(Ndif＝2并且Nref＝8)将具有75％的序列一致性。可以例如使用合适的BLAST-程序，例如由国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(NCBI)，USA提供的BLASTp-算法计算序列一致性。
例如，在本发明中使用的骨桥蛋白可以是基本上纯的全长OPN，它可以是全长的OPN的基本上纯的片段，并且它可以是包括全长OPN和OPN的一个或多个片段的混合物。
本发明中使用的OPN可以是基本上纯的全长的牛OPN，它可以是全长的牛OPN的基本上纯的长N末端片段，并且它可以是包括全长的牛OPN和全长的牛OPN的长N末端片段的混合物。这种混合物可以例如包含相对于OPN的总量的5％-40％(w/w)的量的全长的牛OPN以及相对于OPN的总量的60％-95％(w/w)的量的全长的牛OPN的长N末端片段。
牛OPN典型地可以以20mg OPN/公升牛奶的浓度获得。
如由专利申请WO 01/497741A2、WO 02/28413、WO 2012/117,119或WO 2012/117,120所述的，牛OPN可以通过阴离子交换色谱法在pH 4.5下从例如酸乳清中分离。可以得到多达90％-95％的OPN纯度。
这些纳米粒子聚集体还可以含除了OPN外的其他钙结合肽。
除了OPN外，这些纳米粒子聚集体可以含选自下组的一种或多种磷肽，该组由以下各项组成：胎球蛋白A(FETUA)(Swiss-Prot登录号P02765)、富含脯氨酸的碱性磷蛋白4(PRB4)(SWISS-Prot登录号P10163)、基质Gla蛋白质(MGP)(Swiss-Prot登录号P08493)、分泌磷蛋白24(SPP-24)(Swiss-Prot登录号Q13103)、核黄素结合蛋白(Swiss-Prot登录号P02752)、整联蛋白结合唾液磷酸蛋白II(IBSP-II)(Swiss-Prot登录号P21815)、细胞外基质骨磷糖蛋白(MEPE)(Swiss-Prot登录号Q9NQ76)、牙质基质酸性磷蛋白1(OMP1)(SWISS-Prot登录号Q13316)、人β-酪蛋白、牛β-酪蛋白及其同工型或磷肽片段。
本发明的另一个方面涉及用于医治、用于缓解和/或预防生物膜相关疾病的纳米粒子聚集体，其包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
这些纳米粒子聚集体可被用于治疗人类受试者或动物受试者。
在本发明的上下文中，术语“生物膜相关疾病”涉及至少部分地由接触人体或动物体的生物膜引起的疾病。一种生物膜相关疾病例如可以包括一种细菌感染。
在本发明的一些优选的实施例中，该生物膜相关疾病是口腔疾病。
该生物膜相关疾病可以例如是龋齿、牙龈炎、和/或牙周炎。
该生物膜相关疾病可以是牙龈炎。可替代地，该生物膜相关疾病是牙周炎。该生物膜相关疾病也可以是龋齿。
在本发明的一些实施例中，该生物膜相关疾病是选自下组的一种疾病，该组由以下各项组成：细菌性心内膜炎、慢性伤口感染、植入物感染、中耳炎、和囊性纤维化，以及其组合。
这些纳米粒子聚集体可以例如用于医治、缓解和/或预防细菌感染，例如细菌性伤口感染。
本发明的一个方面可以是例如涉及到用于医治、缓解和/或预防细菌感染的纳米粒子聚集体。
该细菌感染可以例如是口腔细菌感染，如牙龈炎。因此，这些纳米粒子聚集体可以用于医治、缓解和/或预防牙龈炎。
这些纳米粒子聚集体可以用于减少或预防微生物生物膜的生长。
例如，这些纳米粒子聚集体可以用于减少或预防牙斑的形成。
此外，或替代地，为了减少或预防微生物生物膜的生长，这些纳米粒子聚集体可以用于去除微生物生物膜，例如像牙菌斑。
本发明的一个方面涉及包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜的生长的用途。
生物膜是其中细胞彼此附着在一个表面上的微生物的群落。这些粘附细胞常常嵌入胞外聚合物质的自我生成基质中。
本发明的另一个方面涉及包括OPN和磷酸锶/钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜的生长的用途。
仍另一个方面涉及包括OPN和磷酸锶的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜的生长的用途。
又另一个方面涉及包括OPN及磷酸锶和磷酸钙的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜的生长的用途。
另一个方面涉及包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙和如此的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜生长的用途。
在本发明的上下文中，纳米粒子聚集体被用以指纳米粒子的集合，其中所述纳米粒子在机械刺激(如搅拌或低功率超声处理)后不容易彼此分离。作为一个例子，OPN纳米粒子和磷酸钙纳米粒子组合以形成纳米粒子聚集体。
可以在本发明中使用不同尺寸的纳米粒子聚集体。在本发明的一些实施例中，这些纳米粒子聚集体具有至多5微米的流体动力学半径。例如，这些纳米粒子聚集体可以具有至多2微米的流体动力学半径。这些纳米粒子聚集体可以例如具有至多1微米的流体动力学半径。可替代地，这些纳米粒子聚集体可以具有至多0.7微米的流体动力学半径。
甚至更小的纳米粒子聚集体可以是优选的。因此，在本发明的一些优选实施例中，这些纳米粒子聚集体具有至多0.5微米的流体动力学半径。例如，这些纳米粒子聚集体可以具有至多0.4微米的流体动力学半径。这些纳米粒子聚集体可以例如具有至多0.3微米的流体动力学半径。可替代地，这些纳米粒子聚集体可以具有至多0.2微米的流体动力学半径，如至多0.1微米。
流体力学半径优选地使用动态光散射(DLS)确定。
典型地，这些纳米粒子聚集体具有至少5nm的流体动力学半径，并且优选为至少10nm。
如所述的，该第一粒子包括钙和/或锶。
在本发明的一些优选的实施例中，该第一粒子包括钙。
在本发明的一些优选的实施例中，该第一粒子包括锶。
在本发明的一些优选的实施例中，该第一粒子包括钙及锶。
该第一粒子可以例如包括一种盐(包括钙和/或锶)或甚至由其组成。
该第一粒子可以包括相对于该第一粒子的总重量的至少50％(w/w)的钙和/或锶盐。例如，该第一粒子可包括至少70％(w/w)的钙和/或锶盐。该第一粒子可以例如包括至少80％(w/w)的钙和/或锶盐。可替代地，该第一粒子可包括至少90％(w/w)、例如至少95％(w/w)的钙和/或锶盐。
该盐可以是一种含钙和/或锶以及一种合适的有机阴离子(例如处于阴离子有机聚合物的形式)的有机盐。
可替代地，该盐可以是一种含钙和/或锶以及一种适合的无机阴离子的无机盐。这种无机阴离子的非限制性实例是磷酸盐种类、硫酸盐、碳酸盐、或其混合物。因此，该无机盐可包括磷酸盐种类、硫酸盐和/或碳酸盐。
该磷酸盐种类可以是例如磷酸盐(PO4 3-)、磷酸一氢盐(HPO4 2-)、焦磷酸盐、或磷酸氢盐(P2O7 4-)。目前最优选的是，该磷酸盐种类是磷酸盐(PO4 3-)或者可替代地磷酸盐(PO4 3-)和磷酸一氢盐(HPO4 2-)的组合。
因此，在本发明的一些优选的实施例中，该第一粒子包括钙和/或锶的一种无机盐，或者甚至由其组成。
优选地，该第一粒子包括相对于该第一粒子的总重量至少50％(w/w)的钙和/或锶的无机盐。例如，该第一粒子可包括至少70％(w/w)的钙和/或锶的无机盐。该第一粒子可以例如包括至少80％(w/w)的钙和/或锶的无机盐。可替代地，该第一粒子可包含至少90％(w/w)、例如至少95％(w/w)的钙和/或锶的无机盐。
在本发明的一些优选实施例中，该第一粒子能够释放钙和/或锶。优选地当这些纳米粒子聚集体接触或接近该生物膜时发生钙和/或锶的这种释放。例如，当存在于口腔的液膜中时(例如像唾液或口腔生物膜),这些纳米粒子聚集体优选能够释放钙和/或锶。
在本发明的一些目前优选的实施例中，该第一粒子是纳米粒子，即它具有至多1微米的流体动力学半径。例如，该第一粒子的流体动力学半径可以是至多0.8微米。该第一粒子的流体动力学半径可以例如是至多0.6微米。可替代地，该第一粒子的流体动力学半径可以是至多0.4微米。
甚至更小的粒子可以是优选的，因此该第一粒子可以具有至多0.2微米的流体动力学半径。例如，该第一粒子的流体动力学半径可以是至多0.1微米。该第一粒子的流体动力学半径可以例如是至多0.05微米。可替代地，该第一粒子的流体动力学半径可以是至多0.01微米。
典型地，该第一粒子的流体动力学半径为至少3nm，优选是至少5nm。
在本发明的一些优选实施例中，这些纳米粒子聚集体的至少一些包含一种单一的第一粒子，一个或多个OPN分子结合至该第一粒子。这些纳米粒子聚集体的第一粒子例如可以被单层的OPN包围。这样的纳米粒子聚集体的实例可在奥尔特(Holt)(FEBS杂志；第276卷；2308-2323页；2009)等人中找到。
在本发明的一些优选实施例中，这些纳米粒子聚集体的至少一些包括一种第二粒子，并且甚至可能进一步包括与该第一粒子相同类型的粒子。因此，这样的纳米粒子聚集体是更复杂的结构，除了多个OPN分子之外，各自包含含钙和/或锶的多个粒子。
在本发明的一些优选的实施例中，该第一粒子包括磷酸钙，或者甚至基本上由其组成。例如，该第一粒子可包括相对于该第一粒子的重量至少50％(w/w)的磷酸钙总量。该第一粒子可以例如包括相对于该第一粒子的重量至少60％(w/w)、例如至少70％(w/w)或甚至至少80％(w/w)的磷酸钙总量。可替代地，该第一粒子可包括相对于该第一粒子的重量至少90％(w/w)的磷酸钙总量。该第一粒子的剩余部分可以例如是来自用以制备该第一粒子的钙与磷酸盐的来源的杂质。
该第一粒子可以例如具有化学计量式：
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·(H2O)n；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；并且其中n＝0-10；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的另一个方面涉及具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
在本发明的上下文中，术语“空缺”应被理解为矿物中的一个点缺陷。矿物晶体固有地具有不完整性，常被称为“晶体缺陷”。其中一个原子从晶格格位中的一处缺失的缺陷被称为“空缺”缺陷。
在一个实施例中，A’是Ca。
在另一个实施例中，A’是Sr。
在又另一个实施例中，A’是Ca和Sr的混合物。
在一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、K、Rb、Cs、Mg、Zn、Ba、空缺及其混合物。
在另一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、K、Mg、Zn、Ba、空缺及其混合物。
在仍另一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、K、空缺及其混合物。
在又另一个实施例中，B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物。
在又另一个实施例中，C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、空缺及其混合物。
在一个实施例中，(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比是2.5以上，例如5以上，例如10以上，例如15以上，例如20以上，例如25以上，例如30以上，例如35以上，例如40以上，例如45以上，例如50以上，例如100以上，例如200以上，例如300以上，例如400以上，例如500以上，例如1000以上，例如10,000以上，例如20,000以上，例如50,000以上，例如100,000以上。
在又另一个实施例中，A’是Ca和Sr的混合物；其中Ca和Sr之间的比率在1:1000至1000:1的范围内，例如在1:900至900:1的范围内，如1:850或850:1，例如在1:800至800:1的范围内，如1:750或750:1，例如在1:700至700:1的范围内，如1:650或650:1，例如在1:600至600:1的范围内，如1:550或550:1，例如在1:500至500:1的范围内，如1:450或450:1，例如在1:400至400:1的范围内，如1:350或350:1，例如在1:300至300:1的范围内，如1:250或250:1，例如在1:200至200:1的范围内，如1:150或150:1，例如在1:100至100:1的范围内，如1:75或75:1，例如在1:50至50:1的范围内，如1:25或25:1，例如在1:15至15:1的范围内，如1:10或10:1，例如在1:5至5:1的范围内，如1:5或5:1，例如在1:2.5至2.5:1的范围内，如1:2.5或2.5:1，如1:1。
在一个实施例中，X在0-9的范围内，例如在0-8的范围内，例如在0-7的范围内，例如在0-6的范围内，例如在0-5的范围内，例如在0-4的范围内，例如在0-3的范围内，例如在0-2的范围内，例如在0-1的范围内。
在另一个实施例中，X在0-9.5的范围内，例如在0.1-9.0的范围内，如0.2，例如在0.3-8.5的范围内，如0.4，例如在0.5-8.0的范围内，如0.6，例如在0.7-7.5的范围内，如0.8，例如在0.9-7.0的范围内，如1.0，例如在1.1-6.5的范围内，如1.2，例如在1.3-6.0的范围内，如1.4，例如在1.5-5.5的范围内，如1.6，例如在1.7-5.0的范围内，如1.8，例如在1.9-4.5的范围内，如2.0，例如在2.1-4.0的范围内，如2.2，例如在2.3-3.5的范围内，如2.4，例如在2.5-3.5的范围内，如3.0。
在一个实施例中，Y在0-5的范围内，例如在0-4的范围内，例如在0-3的范围内，例如在0-2的范围内，例如在0-1的范围内。
在另一个实施例中，Y在0-4.5的范围内，例如在0.1-4.0的范围内，如0.2，例如在0.3-4.0的范围内，如0.4，例如在0.4-4.0的范围内，如0.5，例如在0.6-4.0的范围内，如0.7，例如在0.8-4.0的范围内，如0.9，例如在1.0-3.5的范围内，如1.2，例如在1.3-3.5的范围内，如1.4，例如在1.5-3.5的范围内，如1.6，例如在1.7-3.5的范围内，如1.8，例如在1.9-3.5的范围内，如2.0，例如在2.1-3.0的范围内，如2.2，例如在2.3-3.0的范围内，如2.4，例如在2.5-3.0的范围内。
在一个实施例中，Z在0-2的范围内，例如在0-1的范围内。
在另一个实施例中，Z在0-1.9的范围内，例如在0.1-1.9的范围内，如0.2，例如在0.3-1.9的范围内，如0.4，例如在0.5-1.9的范围内，如0.6，例如在0.7-1.9的范围内，如0.8，例如在0.9-1.9的范围内，如1.0，例如在1.0-1.8的范围内，如1.1，例如在1.2-1.7的范围内，如1.3，例如在1.4-1.6的范围内，如1.5。
在一个实施例中，B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、H2O、空缺及其混合物。
在另一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、H2O、空缺及其混合物。
在又另一个实施例中，B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、H2O、空缺及其混合物；并且A选自下组，该组由以下各项组成：Na、H2O、空缺及其混合物。
在又另一个实施例中，B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、H2O、空缺及其混合物；并且A选自下组，该组由以下各项组成：K、H2O、空缺及其混合物。
在一个实施例中，m在1*10-10至0.25的范围内，例如在1*10-10至0.20的范围内，如在1*10-10至0.15的范围内，例如在1*10-10至0.10的范围内，如在1*10-10至0.09的范围内，例如在1*10-10至0.08的范围内，如在1*10-10至0.07的范围内，例如在1*10-10至0.06的范围内，如在1*10-10至0.05的范围内，例如在1*10-10至0.04的范围内，如在1*10-10至0.03的范围内，例如在1*10-10至0.02的范围内，如在1*10-10至0.01的范围内。
在又另一个实施例中，m在1*10-10至0.30的范围内，例如在1*10-9至0.20的范围内，如在1*10-8至0.15的范围内，例如在1*10-7至0.10的范围内，如在1*10-6至0.09的范围内，例如在1*10-5至0.08的范围内，如在1*10-4至0.07的范围内，例如在0.001至0.06的范围内，如在0.002至0.05的范围内，例如在0.003至0.04的范围内，如在0.005至0.03的范围内，例如在0.006至0.02的范围内，如在0.007至0.01的范围内。
在仍另一个实施例中，m在0.00016至0.011、例如0.00016至0.009、例如0.0009至0.0035、例如0.0018至0.003的范围内。
在另一个实施例中，n在0-100的范围内，例如在0.01-100的范围内，如0.05，例如在0.1-90的范围内，如0.2，例如在0.3-85的范围内，如0.4，例如在0.5-80的范围内，如0.6，例如在0.7-75的范围内，如0.8，例如在0.9-70的范围内，如1.0，例如在1.2-65的范围内，如1.4，例如在1.6-60的范围内，如1.8，例如在2.0-55的范围内，如2.2，例如在2.4-50的范围内，如2.4，例如在2.6-45的范围内，如2.8，例如在3.0-40的范围内，如3.2，例如在3.4-35的范围内，如3.6，例如在3.8-30的范围内，如4.0，例如在4.2-25的范围内，如4.4，例如在4.6-20的范围内，如4.8，例如在5.0-15的范围内，如5.2，例如在5.4-14的范围内，如5.6，例如在5.8-13的范围内，如6.0，例如在6.2-12的范围内，如6.4，例如在6.6-11的范围内，如6.8，例如在7.0-10的范围内，如7.2，例如在7.4-9的范围内，如7.6，例如在7.8-8.8的范围内，如8.0。
本发明的仍另一个方面涉及用作一种药物的具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的又另一个方面涉及用作用于医治、缓解或预防细菌感染的一种药物的具有化学计量式A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
在一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Zn、空缺及其混合物。
在另一个实施例中，B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、H2O、空缺及其混合物。
在又另一个实施例中，C选自下组，该组由以下各项组成：F、H2O、空缺及其混合物。
在又另一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、H2O、空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B是(CO3)并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10并且m>0。
在一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、H2O、空缺及其混合物，并且X＝0-2；其中B是(CO3)并且Y＝0-1；其中C选自下组，该组由以下各项组成：H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10并且m>0。
在一个实施例中，A选自下组，该组由以下各项组成：Na、Zn、H2O、空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10并且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比是2.5以上。
在另一个实施例中，这些纳米粒子聚集体是非晶的。该第一粒子可以例如是基本上非晶的。
可替代地，该第一粒子可以基本上是晶体。
在另一个实施例中，这些纳米粒子聚集体包含与羟基磷灰石的X射线衍射图形相匹配的晶体材料。
在本发明的上下文中，术语“纳米晶体”应被理解为晶体材料，其中这些纳米晶体的至少一个维度小于100nm。
在仍另一个实施例中，这些纳米粒子聚集体包含与羟基磷灰石的X射线衍射图形相匹配的晶体材料，并且所述晶体材料是纳米晶体。
在一个实施例中，这些纳米粒子聚集体包含与羟基磷灰石的X射线衍射图形相匹配的晶体材料，并且所述晶体材料是纳米晶体；其中所述纳米晶体具有各向异性的微晶尺寸，而结晶学c-轴与这些微晶的最大形态轴一致。
在另一个实施例中，这些纳米粒子聚集体包含与羟基磷灰石的X射线衍射图形相匹配的晶体材料，并且所述晶体材料是以下意义上的纳米晶体，这些纳米晶体的至少一个维度小于90nm，如小于80nm，如小于70nm，如小于60nm，例如小于50nm，如小于40nm，例如小于30nm，例如小于20nm，例如小于10nm。
诸位发明人已经看到以下指征，本发明的纳米粒子聚集体特别适合用于预防或破坏包含OPN结合细菌中的一个或多个种类的生物膜。
在本发明的一些实施例中，该生物膜包含具有至少50个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。例如，该生物膜可以包含具有至少100个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。该生物膜可以例如包含具有至少200个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。可替代地，该生物膜可以包含具有至少400个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。
细菌菌株的OPN结合能力是根据赖登(Rydén)等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，184，331-336(1989)使用从牛奶中分离的全长OPN来测量的。
在本发明的一些优选的实施例中，该生物膜包含具有至少800个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。例如，该生物膜可以包含具有至少2,000个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。该生物膜可以例如包含具有至少10,000个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。可替代地，该生物膜可以包含具有至少50,000个OPN分子/细胞，例如像至少100,000个OPN分子/细胞或者甚至至少500,000个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。
该生物膜可以例如包含具有至少1,000,000个OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。
例如，该生物膜可以包含选自下组的一种或多种细菌或者甚至由其组成，该组由以下各项组成：链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、放线菌属、乳酸菌属、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、拟杆菌属、李斯特氏菌属、弯曲杆菌属、艾肯氏菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属及其组合。
在牙龈炎的情况下，该生物膜典型地包含以下细菌中的一种或多种：伴放线菌聚集菌、福赛斯拟杆菌、直肠弯曲杆菌、啮蚀艾肯菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌和/或齿垢密螺旋体。
在龋齿的情况下，该生物膜典型地包含以下细菌中的一种或多种：口腔链球菌、汗毛链球菌、轻链球菌、血链球菌和内氏放线菌。
除了OPN结合细菌之外，该生物膜还可以包含不具有或低结合至OPN的细菌。
一个方面涉及包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防由链球菌属和/或放线菌属形成的细菌生物膜的用途。
本发明的另一个方面涉及包括OPN和磷酸锶/钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防由链球菌属和/或放线菌属形成的细菌生物膜的用途。
仍另一个方面涉及包括OPN和磷酸锶的纳米粒子聚集体用于减少或预防由链球菌属和/或放线菌属形成的细菌生物膜的用途。
又另一个方面涉及包括OPN以及磷酸锶和磷酸钙的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防由链球菌属和/或放线菌属形成的细菌生物膜的用途。
另一个方面涉及包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙和如此的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防由链球菌属和/或放线菌属形成的细菌生物膜的用途。
又另一个方面涉及包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防链球菌属和/或放线菌属的细菌黏附的用途。
许多问题与美容地和治疗地护理牙齿相联系发生，如牙齿生物膜形成(斑)、归因于细菌产物的牙齿染色、牙结石(牙石)龋齿形成、牙根管感染以及牙周疾病。
牙菌斑是一种积聚在口腔中的硬组织(牙)上的复杂的生物膜。尽管牙生物膜留存着超过500个细菌物种，但定殖遵循管制模式，最初的定殖者粘附到珐琅唾液薄膜，随后通过细菌共粘附进行二次定殖。众所周知的是，一系列的链球菌属物种和放线菌属物种属于早期定殖者。因此重要的是控制这些细菌的粘附和随后的生物膜形成。多种粘附素和受体参与细菌向唾液包覆的表面的粘附、细菌共聚集、细菌-基质相互作用，并促进生物膜发育并且最后促进疾病如龋齿、牙髓感染和牙周疾病。
一个方面涉及包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防口腔生物膜的生长的用途。
当用于治疗、预防或减少口腔生物膜时，优选的是这些纳米粒子聚集体被口服给药。还优选的是，这些纳米粒子聚集体以适于口服给药的配制品存在。
本发明的另一个方面涉及包括OPN和磷酸锶/钙的纳米粒子聚集体用于减少或预防口腔生物膜的生长的用途。
仍另一个方面涉及包括OPN和磷酸锶的纳米粒子聚集体用于减少或预防口腔生物膜的生长的用途。
又另一个方面涉及包括OPN以及磷酸锶和磷酸钙的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防口腔生物膜的生长的用途。
另一个方面涉及包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙和如此的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防口腔生物膜生长的用途。
仍另一个方面涉及包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙和如此的混合物的纳米粒子聚集体用于减少或预防口腔生物膜粘附的用途。
在一个实施例中，包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的另一个方面涉及通过向受试者给予如此处所定义的纳米粒子聚集体来医治、缓解和/或预防动物或人受试者的生物膜相关疾病的方法。
本发明的一个方面涉及如此处所定义的纳米粒子聚集体用于减少、去除和/或预防口臭的用途。
本发明的一个另外的方面涉及通过向受试者给予如此处所定义的纳米粒子聚集体来减少或预防微生物生物膜在动物或人类受试者体内或体上生长的方法。
如上所述，待处理、减少或预防的生物膜可以例如是一种口腔生物膜，在此情况下，口服给予这些纳米粒子聚集体是优选的。
该动物受试者可以例如是家养动物，如家养哺乳动物、家养的鱼或家禽。
本发明的一个另外的方面涉及通过向受试者给予如此处所定义的纳米粒子聚集体来减少、去除和/或预防动物或人类受试者的口臭的方法。这些纳米粒子聚集体优选地是被口服给予的。
本发明的又一个方面涉及包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜生长的用途。在本发明的一些实施例中，需要的是，这种用途不是通过疗法来治疗人体或动物体。
该生物膜理论上可以是此处提及的任何生物膜，并且可以例如包含以下细菌中的一种或多种：链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、放线菌属、乳酸菌属、凝聚杆菌属、拟杆菌属、李斯特氏菌属、弯曲杆菌属、艾肯氏菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属。
然而，在本发明的一些实施例中，以上用途不是通过疗法来治疗人体或动物体。该生物膜可以是例如不与活的人或活的动物接触的生物膜。
本发明的又另一个方面涉及包括如此处所定义的纳米粒子聚集体的一种牙用配制品。
该牙用配制品可以例如包括具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
该牙用配制品可以是任何洁齿剂或口腔卫生中具有相关性的相关产品，例如牙粉、牙胶、牙漆、牙用漱口剂、口腔喷雾剂或口香糖。
在一个实施例中，该牙用配制品处于牙膏、牙粉、牙胶、牙漆、牙用漱口剂、口腔喷雾剂或口香糖的形式。
如WO 2005/053,628中披露的，骨桥蛋白的量通常在约50mg OPN和约1500mg骨桥蛋白/kg牙用配制品之间，而且更小的量也有效果。可以使用更高的量，但效果不会被实质上增加。有用的量是每千克100-1000mgOPN，优选200-500mg，并且最优选约350mg。更高的量大概不会给出更好的结果，并且因此不建议使用，因为OPN是一种相当昂贵的成分。出人意料地，本发明的发明人已显示包含OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体对减少或预防微生物生物膜的生长具有协同效果。因此，本发明减少了骨桥蛋白/kg牙用配制品的有效量。
在本发明的上下文中，术语“口腔生物膜生长”是指在口腔硬组织和软组织(口腔粘膜、舌、齿面)上的生物膜生长和在口腔中的插入材料(植入物、正畸托架、以及恢复性材料，如填料、牙冠和假牙)上的生物膜生长。
本主题发明的优选组合物是如已经以牙膏、牙漆、牙胶和牙粉的形式提到的。这种牙膏和牙胶的组分包括以下中的一种或多种：牙齿研磨剂(从约10％至约50％)、表面活性剂(从约0.5％至约10％)、增稠剂(从约0.04％至约0.5％)、湿润剂(从约0.1％至约3％)、调味剂(从约0.04％至约2％)、甜味剂(从0.1％至约3％)、着色剂(从约0.01％至约0.5％)和水(从2％至45％)。
除非另外说明，形成本发明的组合物或产品的部分的组分的百分比是相对于该组合物或产品的总重量的重量百分比。
龋齿控制剂可包含从0.001％至约1％的包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体。抗结石剂包含从约0.1％至约13％的包括OPN和磷酸钙的纳米粒子聚集体。
当然，牙粉基本上不含所有液体组分。
本主题发明的其他优选的组合物是牙用漱口剂，包括口腔喷雾剂。此类漱口剂和口腔喷雾剂的组分典型地包括以下中的一种或多种：水(从约45％至约95％)、乙醇(从约0％至约25％)、湿润剂(从约0％至约50％)、表面活性剂(从约0.01％至约7％)、调味剂(从约0.04％至约2％)、甜味剂(从约0.1％至约3％)、以及着色剂(从约0.001％至约0.5％)，包括纳米粒子聚集体(包括OPN和磷酸钙)的抗龋齿剂(从约0.001％至1％)以及一种抗结石剂(从约0.1％至约13％)。
申请的第三个方面是处于一般地说具有不同组成的口香糖配制品。
锶(Sr)已经被报道促进骨形成并已被批准用于治疗骨质疏松症。
仍另一个方面涉及包括如此处所定义的纳米粒子聚集体的包衣组合物。
该包衣组合物可以例如包含具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
该包衣组合物可以例如包括纳米粒子聚集体，这些纳米粒子聚集体包含OPN和磷酸钙。
该包衣组合物可与骨病、骨折或植入物相联系使用。
一个方面涉及根据本发明的包衣组合物在对医疗设备进行包覆中的用途。
另一个方面涉及包括如此处所定义的纳米粒子聚集体的一种食品或饮料产品。
该食品或饮料产品例如可包括具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的一个目的是改善表面上生物膜的减少。
一个方面涉及包括一个主体部分和一个表面区域的一种产品；其中一个第一表面区域包衣被包覆在所述表面区域的至少一个第一部分上；所述第一表面区域包衣包括如此处所定义的纳米粒子聚集体。
该第一表面区域包衣可以例如包括具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
在一个实施例中，该表面区域包括选自下组的一种材料，该组由以下各项组成：金属、金属氧化物、无机材料、有机材料和聚合物。
在另一实施例中，该表面区域是带正电荷的。
在又另一个实施例中，该表面区域是带负电荷的。
在另一个实施例中，该表面区域是不带电荷的。
在本发明的上下文中，术语“抗生物膜剂”应被理解为预防和/或减少微生物粘附到表面，和/或预防和/或减少微生物生物膜的形成，和/或瓦解和/或破坏微生物生物膜。
本发明的一个方面涉及包括以下各项的一种抗生物膜剂：a)OPN和b)含钙和/或锶的一种第一粒子。
该抗生物膜剂可以例如包括以下的纳米粒子聚集体，这些纳米粒子聚集体包括a)OPN和b)磷酸锶、磷酸钙或如此的混合物。
该抗生物膜剂可以例如包括具有化学计量式
A’10-XAX(PO4)6-YBY(OH)2-zCz·OPNm·(H2O)n的纳米粒子聚集体；其中A'选自下组，该组由以下各项组成：Ca、Sr及其混合物；其中A选自下组，该组由以下各项组成：Li、Na、K、Rb、Cs、Be、Mg、Zn、Ba、H2O，空缺及其混合物，并且X＝0-9；其中B选自下组，该组由以下各项组成：(CO3)、(SO4)、(HSO4)、(HPO4)、(H2PO4)、H2O、空缺及其混合物，并且Y＝0-5；其中C选自下组，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、(CO3)、H2O、空缺及其混合物，并且Z＝0-2；其中n＝0-10且m>0；其中(PO4)和(HPO4)之间的摩尔比在2.5以上。
本发明的另一个方面涉及一种用于生产由OPN和磷酸钙形成的纳米粒子聚集体的方法，包括：
a)提供包括作为PO4 3-的磷酸盐的一种第一水溶液；其中pH在6-14的范围内；
b)提供包括Ca2+和/或Sr2+的一种第二水溶液；其中pH在6-14的范围内；
其中该第一、第二或两种水溶液都包含OPN；
c)将所述第一和第二溶液混合，由此形成包括纳米颗粒聚集体的一种悬浮液，这些纳米粒子聚集体包括1)OPN、2)磷酸锶、磷酸钙或如此的混合物，以及3)水溶性电解质；
d)任选地，从该悬浮液中去除大量的所述的水溶性电解质；
e)任选地，从水相中分离所述纳米粒子聚集体。
在本发明的上下文中，术语“水溶液”应被理解为包括至少50％w/w水的一种液体物质。
在本发明的上下文中，术语“悬浮液”应被理解为一种包含足够大以沉降的固体粒子的多相流体。
在本发明的上下文中，术语“电解质”应被理解为包含以下自由离子的物质，这些自由离子使该物质导电。在本发明中，该电解质必须是可溶于水的。
在一个实施例中，该悬浮液的水相的pH在7以上，例如在7.4-14.0的范围内，如7.6以上，例如在7.8-13.5的范围内，如8.0以上，例如在8.5-13.0的范围内，如9.0以上，例如在9.5-12.5的范围内，如10.0以上，例如在10.5-12.0的范围内，如11.0以上。
在一个实施例中，该过程进一步包括步骤d)。
在另一个实施例中，该过程进一步包括步骤d)，其中该分离是通过透析进行。
在本发明的上下文中，术语“透析”应被理解为通过半透膜的孔凭借其不相等的扩散速率从溶解的小维度离子或分子(类晶体)分离悬浮的胶粒。
在一个实施例中，该过程进一步包括步骤e)。
在另一个实施例中，骨桥蛋白在该第一和第二水溶液中的总浓度在2.5mg/ml以上，例如在3-1000mg/ml范围内，如5mg/ml以上，例如在10-500mg/ml范围内，如12mg/ml以上，例如在15-100mg/ml范围内，例如18mg/ml以上，例如在20-50mg/ml范围内，如25mg/ml以上，例如在30-45mg/ml范围内，如35mg/ml以上。
在一个实施例中，该过程进一步包括步骤f)将所获得的纳米粒子聚集体进行灭菌。
在另一个实施例中，该过程进一步包括步骤f)，其中该灭菌步骤是通过加热进行。
在又另一个实施例中，该过程进一步包括步骤f)，其中该灭菌步骤是通过加热到80℃并将这一水平的温度保持1小时或更长时间进行的。
本发明人已经发现，骨桥蛋白的浓度存在约33wt％干质量的一个上限(即指通过在200℃下干燥获得的质量)，其中似乎没有更多的骨桥蛋白被包括在这些纳米粒子聚集体中。这设置了约20mg/l的添加的OPN量。因此，在一个实施例中，骨桥蛋白在该第一和第二水溶液中的总浓度在2.5-35mg/ml的范围内。然而，这种限制可根据不同的水溶性电解质的浓度变化。
在一个实施例中，该骨桥蛋白只存在于该第一水溶液中。
在另一实施例中，该骨桥蛋白只存在于该第二水溶液中。
在另一个实施例中，该骨桥蛋白存在于该第一和第二水溶液两者中。
在一个实施例中，步骤c)是在5-80摄氏度的范围内、例如在10℃-50℃范围内、如在20℃-40℃范围内、如在22℃-28℃范围内的温度下进行的。
在一个实施例中，该第一，第二或两种水溶液包括一种Ca/Sr结合荧光染料。这些溶液中的另外的Ca/Sr结合染料将导致荧光(如果是荧光染料)或着色纳米粒子聚集体。
应注意，本发明的多个方面之一的内容中所描述的多个实施例和特征还适用于本发明的多个其他方面。
在本申请中引用的全部专利和非专利参考文件通过引用以其全文结合在此。
现将在以下非限制性实例中更详细地描述本发明。
实例
实例1：纳米粒子聚集体的合成
为了合成纳米粒子聚集体，使用了以下方法
1)以等量体积制备三种水溶液，一种包含0.36M Na3PO4(通过制备为0.36M NaH2PO4和0.72M NaOH的一种溶液方便地制成)，第二种包含0.6M CaCl2，并且第三种包含所希望的OPN的最终量的三倍。
2)首先将该CaCl2和OPN溶液混合，并且然后添加Na3PO4溶液。这种混合产生了浑浊胶样悬浮液。该胶样结构在磁力搅拌器搅拌下分解。使用专门设计的温度控制水浴将该溶液在25℃搅拌24h。
3)在24h后，将该溶液转移到透析袋中，以去除过量的NaCl。在一个容器中进行24h透析，该容器包含100倍的溶液体积的水，将其通过磁力搅拌器缓慢搅拌。在透析12h后改变该容器水。
4)在透析之后，将这些纳米粒子聚集体以4800rpm离心并用水洗涤两次。
5)在洗涤后，在分析之前，将这些纳米粒子聚集体在60℃下干燥。
通过在25℃下反应(上述步骤2)获得以下讨论的结果；该反应同样可以很好地在其它温度(更高和更低)下进行。在升高的温度下，反应更快。也使用K3PO4作为磷酸盐源执行合成。该反应也可以用较低(较高)浓度的试剂以随后较小(较高)的产率来完成。
产生具有不同量的OPN的样品。合成包含0，0.001，0.0025，0.01，0.025，0.1，0.25，1.0，2.5，5.0，10.0，12.5，15.0，20.0，25.0，30.0和34.0mg/mL的样品(总共17个不同浓度)。
用如上所述的添加12.5mg/ml的OPN量来合成用于生物膜试验的纳米粒子聚集体，其中具有以下改变：透析储液具有pH和0.9wt％NaCl。在24h透析后，将所得到的悬浮液进行灭菌(通过将该悬浮液在密闭容器中在80℃下加热1h)。上述步骤4)和5)在用于生物膜试验的纳米粒子聚集体的生产中被省略。
这些纳米粒子聚集体由XRD、FTIR和TGA表征。对于XRD和FTIR测量，在测量之前将这些干燥的粒子研磨成细粉。在Rigaku SmartLab上以Bragg-Brentano设置测量XRD。这些测量的参数是：6-120°2θ，步长0.02，4°/min。进行两次扫描并对每个样品取平均值。图9显示合并后的数据的所选择部分。对所有具有足够结晶度的样品进行里特维德(Rietveld)优化。具有20mg/ml或更高OPN含量的样品未被优化，因为这些样品具有使里特维德优化变得复杂的高的非晶含量。对进行了里特维德优化的样品提取所选择的参数并示于图10中。在Nicolet 380FT-IR，Smart Orbit(热电公司(Thermo electron corporation))上进行FTIR。就在测量之前将样品在60℃进行干燥。为每个单独光谱适配背景并减去。可以在图13中看到校正数据。进行特征峰的整合用于在这些样品的磷酸盐(1200-900cm-1)、碳酸盐(890-840cm-1)和有机物含量(1720-1595cm-1)之间进行比较。FTIR矿物：有机物和矿物：碳酸盐峰比率之间的比较示于图14中。
使用Ar和O2气氛在Netzsch STA 449C(NETZSCHGeratebau GmbH，塞尔布，德国)上记录TGA数据。TGA数据示于图11中，而提取的质量损失示于图12中。
XRD数据显示，所有具有小于20mg/ml OPN的样品都形成晶体材料。在20mg/ml以及以上，观察到非常大量的非晶材料。在30和34mg/ml处，在非晶散射的顶部观察到小峰。晶体材料的衍射峰比实验性拆分显著更宽，反映了这些晶体材料是纳米晶体。高达并包括15mg/ml OPN的X射线衍射数据被里特维德优化模型化，来提取平均的纳米微晶尺寸的信息。这些纳米晶体在尺寸上是各向异性的并且是具有与结晶学c-轴一致的形态长轴的针形。提取的微晶尺寸示于图10中。在非常低的OPN含量时，在两个形态学方向上都存在微晶尺寸的快速下降(图10中的底部图)，在此之后这些尺寸几乎保持恒定达～1mg/ml的OPN含量，在此之后它再次降低至10mg/ml的OPN含量。对于12.5和15mg/ml，这些粒子聚集体包含比对于10mg/ml的更大的纳米晶体，但背景和峰高之间的比较显示，在这些样品中存在大量的非晶材料。通过TGA测量评估的水、有机组分和碳酸盐的含量示于图11中。质量损失报告于图12中；对应于有机物和碳酸盐含量的质量损失被校正为干质量(即通过水初次损失后残余的质量进行标准化)。水含量在所有情况下都低于15wt％。对于非晶化合物(～10wt％)的情况比对于非晶体材料的情况显著更大。对于纳米晶体材料，在3.1+0.12OPN之后观察到随OPN含量线性增加的水含量，其中OPN是以mg/ml添加的OPN。分别地，碳酸盐含量对于纳米晶体来说是～2.4干燥wt％并且对于非晶材料是4.8干燥wt％。有机含量随添加至10mg/ml OPN而增加，12.5和15mg/ml显示较小的有机含量；在高浓度下，有机物含量在～33干燥wt％处饱和。FTIR证实了如在图13和14中显示的以上观察。
实例2：龋齿模型生物膜的生长
在试验中使用了以下的人口腔细菌隔离种群：口腔链球菌SK248、汗毛链球菌HG594、轻链球菌SK24、血链球菌SK150和内氏放线菌AK6。将生物体有氧地培养在血琼脂(SSI，哥本哈根，丹麦)上，并在35℃转移到THB(罗斯(Roth)，卡尔斯鲁厄，德国)直至试验使用之前的对数生长期中期到晚期。
用1/10THB(pH 7.0)预处理流动细胞(ibiTreat，μ-玻片VI，Ibidi，慕尼黑，德国)。将在550nm处调节到0.4的光密度(对应于2-5*109细胞/ml)的细菌培养物按以下顺序依次接种到流动通道中：1.口腔链球菌SK248(S.oralis SK248)；2.内氏放线菌AK6(A.naeslundii AK6)；3.轻链球菌SK24(S.mitis SK24)；4.汗毛链球菌HG594(S.downei HG594)；5.血链球菌SK150(S.sanguinis SK150)。将0.4ml的每种生物体通过硅胶管在输入端口使用无菌针(BD Microlance，27G，德洛格达，爱尔兰)进行注射，并用硅胶(道康宁(Dow Corning)，威斯巴登，德国)将注入孔进行密封。注射后，将该流动停止30min，以允许细菌粘附。在注入下一个生物体之前，通过10min的流动去除非粘附性生物体。在接种程序之后，在由蠕动泵(华盛百得(Watson Marlow)205U，威明顿市，马萨诸塞州，美国)提供的1/10THB(pH 7.0)的恒定流动(250μl/min；28.3mm/min)下，使生物膜在35℃下生长26h。
实例3：在龋齿模型生物膜中OPN至细菌的结合
根据制造商说明书(英杰(Invitrogen)，措斯楚普自治市(Taastrup)，丹麦)将OPN用荧光素标记。在生长期后，将生物膜在35℃在100μl的标记的蛋白质中孵育45min，并使用488nm激光线和500-550nm带通滤波器成像。将XY分辨率设定为0.1μm/像素并且Z分辨率对应于1艾里单位(0.8μm光学切片厚度)(图1A)。
实例4：含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体至体内生长的牙生物膜的结合
体内生长的牙生物膜是从牙齿表面用无菌刮匙刮下并收集在玻璃调和板(4x 4x 1mm)上。将该玻璃调合板上下翻转，并且将该生物膜与含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体在35℃孵育30min。在用0.9％NaCl洗涤后，将该生物膜用靶向该生物膜和纳粒聚集体中的细菌的30μMC-SNARF-4(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，布隆德比，丹麦)染色。将具有63x油镜、1.4数值口径(普朗复消色差透镜)的蔡司(Zeiss)LSM510META(耶拿，德国)用于图像采集。以543nm激光线(250-300μW)退出探针并在576-608nm间隔内监测荧光发射(META检测器)，该针孔设置为2艾里单位(1.6μm光学切片厚度)。图片为364x 364像素(143x143μm2)的尺寸，并以像素停留时间18μs，线平均值2，0.4μm/像素(变焦1)，12位的强度分辨率(图1B)获得。
实例5：OPN对浮游培养物中的细菌生长的影响
将细菌转移到THB或含26.5μmol/l OPN的THB中。将100μl的等分试样转移到96孔板(扎尔施泰特(Sarstedt)，牛顿，NC，USA)并用分光光度计(BioTek PowerWave XS2，巴德夫里德里希斯哈尔(Friedrichshall)，德国)测量550nm处OD。一式三份进行试验，并再重复一次(图2)。
实例6：含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体对龋齿模型中生长的生物膜的影 响
使生物膜如上所述地生长，并在生长过程中(接种程序之后3h、9h和24h)用含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体处理三次。将从实例1中得到的纳米粒子聚集体悬浮液剧烈晃动，设置沉淀10min，并且从该悬浮液的顶部吸出0.4ml。该吸出的悬浮液具有大约3％(w/v)的纳米粒子聚集体含量。然后将流动停止，并将该吸出的包括纳米粒子聚集体的悬浮液注入如所述的用于细菌接种物的通道。在孵育一小时后，再次开始流动。对照处理是以相同的方式用不含骨桥蛋白的磷酸钙纳米粒子聚集体、不同尺寸的二氧化硅粒子(100nm，500nm和2000nm直径；在0.9％NaCl中3.5％(w/v)；西格玛-奥德里奇，布隆德比，丹麦)、聚苯乙烯粒子(1000nm直径；蒸馏水中3.5％(w/v)，西格玛-奥德里奇)、以及溶解的OPN(0.9％NaCl中0.9g/l)进行的。用0.9％NaCl孵育的通道充当阴性对照。针对每个实验设置，使六个重复生物膜生长。在生物膜生长后，将THB从流动通道通过用纸尖法吸取去除。将这些通道用蒸馏水冲洗，再干燥并用100μl的2％的结晶紫溶液染色1h。然后将通道再次用蒸馏水洗涤，干燥，并在30min过程中添加120μL 100％乙醇(西格玛-奥德里奇，布隆德比，丹麦)以将该生物膜脱色。此后，将100μL的这些染色的乙醇溶液稀释1:8，转移至96孔板(扎尔施泰特，牛顿，NC，USA)中，并用分光光度计(BioTekPowerWave XS2，巴德夫里德里希斯哈尔(Friedrichshall)，德国)测量585nm处光密度。将空的流动通道以相同的方式进行处理并用于背景减除(图3)。
图3示显示不同的药剂对龋齿模型中生物膜形成的影响，通过结晶紫染色确定。相对于1000nm的聚苯乙烯粒子、二氧化硅粒子(150nm、500nm和2000nm)、不含OPN的磷酸钙粒子聚集体和0.9g/l OPN，含OPN磷酸钙纳米粒子聚集体(HAP-OPN)强烈减少在流动细胞中形成的生物膜的量。
因此，实例6提供统计显著的证据，表明通过使用结合到含钙粒子的OPN获得了协同的抗生物膜效果。
实例7：含OPN磷酸钙纳米粒子聚集体的结晶紫结合
将100μl含OPN磷酸钙纳米粒子聚集体注入流动细胞(ibiTreat，μ-玻片VI，Ibidi，慕尼黑，德国)，并设置干燥过夜。将流动通道用结晶紫染色15min，用PBS洗涤两次，干燥，并填充120μl 100％乙醇持续15min。将100μL的这些染色的乙醇溶液稀释1:64，转移到96孔板中，并在585nm测量光密度。将不含骨桥蛋白的磷酸钙纳米粒子聚集体、二氧化硅粒子(500nm直径；在0.9％NaCl中3.5％(w/v))、聚苯乙烯粒子(1000nm直径；蒸馏水中3.5％(w/v))、溶解的OPN(0.9％NaCl中0.9g/l)和0.9g/l NaCl充当对照。一式三份进行试验(图4)。
实例8：含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体对体内口腔生物膜形成的影响
使口腔生物膜生长在特制的具有1200砂砾表面粗糙度的玻璃调和板(4x 4x 1mm)(门泽尔(Menzel)，布伦瑞克，德国)上。将玻璃调合板安装嵌入单独设计的独特的口内装置的颊翼中。两名志愿者将口内装置保持72h，除了刷牙过程中、摄入水之外的食物或液体以及纳米粒子聚集体浸渍过程中。将该装置的一侧每天在实例1中制备的含0.9％NaCl和大约3％(w/v)纳米粒子聚集体的悬浮液中浸渍5-6次(30-60min)。同时将该装置的另一侧浸渍在0.9％NaCl中并充当阴性对照。在72h后，将玻璃调合板去除并在共聚焦显微镜分析之前将生物膜用C-SNARF-4染色(图6)。
图6示显示含钙的含OPN的纳米粒子聚集体强烈减少体内口腔生物膜生长。A：将在玻璃调和板上生长的生物膜在口内保持72h，每天进行5-6NaCl浸渍(30-60分钟)。B：将玻璃调和板上生长的生物膜在口内保持72h。
因此，实施例8证实在实例6中所观察到的抗生物膜作用也存在于体内。
实例9：含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体对浮游细菌培养物的pH的影响
使细菌培养物生长在THB中直至对数生长期中期，洗涤两次并转移至无菌的唾液。将OD调节为1.0(550nm)，添加0.4％葡萄糖(w/w)，并将1ml细菌悬浮液与1ml含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体或1ml 0.9％NaCl混合。测量pH持续20h。一式两份进行试验，并再重复一次(图7a-7e)。
实例10：含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体对龋齿模型生物膜中的pH的影 响
如上所述进行接种程序。然后使生物膜在35℃在250μL/min的流速下在1/10稀释的THB上生长8h。到那个时候，稳定的薄生物膜已经形成。然后将介质改变为不含碳水化合物的牛肉膏(萨劳(Scharlau)，巴塞罗那，西班牙)，并且流速降低到50μL/min，以最小化流动细胞中的剪切力。改变介质后1h、12h和17h，注入HAP-OPN粒子并如上所述的将其与这些生物膜孵育1h。将对照通道与0.9％NaCl孵育。
该计量比率的PH敏感性探针C-SNARF-4的共聚焦显微镜校准：将具有30μM的浓度的包含C-SNARF-4的HEPES缓冲液(50mM；以0.1个pH单位步长调节至pH 4.5-8.5)在流动通道中成像。将具有63x油镜、1.4数值口径(普朗复消色差透镜)的蔡司(Zeiss)LSM 510META(耶拿，德国)用于图像采集。以543nm激光线(250-300μW)退出探针并同时在576-608nm(绿色)和629-661nm(红色)间隔内监测荧光发射(META检测器)，该针孔设置为2艾里单位(1.6μm光学切片厚度)。图片为364x364像素(143x 143μm2)的尺寸，并以像素停留时间18μs，线平均值2，0.4μm/像素(变焦1)，12位的强度分辨率获得。对于每个第三pH值，对未染色的HEPES缓冲液(50mM，pH 8.5)进行测量用于背景减除。此外，将葡萄糖(20％w/v)和乳酸(20％w/v)的未染色溶液、1/10稀释的THB(pH 7)、无菌唾液、PBS(pH 7.4，西格玛-奥德里奇，布隆德比，丹麦)、未经处理的生物膜和HAP-OPN粒子悬浮液用相同的显微镜和激光设置进行成像。在波长范围576-608nm和629-661nm中这些对照中的任一种都未发射自身荧光信号。
对于比率计算，在每个图像中定义100×100像素的区域并使用LSM采集软件测定平均值和标准差。随后，根据等式(1)、(2)和(3)计算针对每一PH值的比率R、标准差sR和平均值的标准误差SR：
(1) R = g - b g r - b r
(2) s R = 1 ( ( r - b r ) 2 ) 1 / 2 ( s g 2 + s bg 2 + ( g - b g ) 2 ( r - b r ) 2 ( s r 2 + s br 2 ) ) 1 / 2
(3) S R = 1 ( 100 2 ) 1 / 2 ( s R 2 ) 1 / 2
g、r、sg和sr是在各自的绿色和红色图像中定义的100x 100像素区域内的平均值和标准差。bg、br、sbg和sbr是这些背景图像的对应值。R的所得到值描绘在MATLAB(迈斯沃克(MathWorks)，马萨诸塞州的，US)中，并适配于函数：
(4) pH = ln ( - 1.6546 R - 1.7469 - 1 ) 1 ( 2.3981 ) + 5.9799
进行两次测量，并证明是高度可重复的。
生物膜pH成像：使三种生物膜平行生长，其中之一用如上所述的含OPN的磷酸钙纳米粒子聚集体进行处理。
此后，将生物膜用无菌唾液洗涤两次并添加C-SNARF-4至30μM的浓度。将流动细胞转移到显微镜，将其用XL培养箱(PeCon，埃尔巴赫(Erbach)，德国)保持在37℃，并在该生物膜的最底层获取基线pH值图像。随后，在这三个通道中的两个中，将不含葡萄糖的唾液替换为含0.4％(w/v)葡萄糖和30μM C-SNARF-4的唾液溶液。在这三种生物膜中的每种中，在随机选择的16个显微视野中获得pH图像。在LSM软件中标示XY位置，并且在添加葡萄糖之后60min，以相同顺序将相同的显微视野进行再次成像。对于背景减除，在543nm激光关闭下获取图像。该显微镜和激光设置与校准测量的那些相同。进行五个独立的试验重复(图8a-8e)。

Claims (25)

1.用作一种药物的纳米粒子聚集体，其包括a)骨桥蛋白(OPN)和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
2.用于医治、缓解和/或预防生物膜相关疾病的纳米粒子聚集体，其包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
3.根据权利要求2所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜相关疾病包括细菌感染。
4.根据权利要求2或3所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜相关疾病是口腔疾病。
5.根据权利要求4所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜相关疾病是龋齿。
6.根据权利要求4或5所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜相关疾病是牙龈炎。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜相关疾病是牙周炎。
8.根据权利要求2或3所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜相关疾病是选自下组的一种疾病，该组由以下各项组成：细菌性心内膜炎、慢性伤口感染、植入物感染、中耳炎、囊性纤维化、及其组合。
9.根据权利要求2所述的纳米粒子聚集体，用于医治、缓解和/或预防细菌感染，例如细菌性伤口感染。
10.用于减少或预防微生物生物膜生长或用于去除微生物生物膜的纳米粒子聚集体，其包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子。
11.根据权利要求10所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜是牙菌斑。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜包含具有至少50OPN分子/细胞的OPN结合能力的细菌。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该生物膜包含选自下组的一种或多种细菌或者甚至由其组成，该组由以下各项组成：链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、放线菌属、乳酸菌属、凝聚杆菌属、拟杆菌属、李斯特氏菌属、弯曲杆菌属、艾肯氏菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属及其组合。
14.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子包括钙。
15.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子包括锶。
16.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子包括钙和锶。
17.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子包括钙和/或锶的一种无机盐。
18.根据权利要求17所述的纳米粒子聚集体，其中该无机盐包括一种磷酸盐种类、硫酸盐、和/或碳酸盐。
19.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子包括至少50％(w/w)磷酸钙。
20.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子能够释放钙和/或锶。
21.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其中该第一粒子是纳米粒子。
22.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其包括与该第一粒子相同类型的一种第二粒子。
23.根据以上权利要求中任一项所述的纳米粒子聚集体，其具有至多5微米的流体动力学半径。
24.包括a)OPN和b)一种包含钙和/或锶的第一粒子的纳米粒子聚集体用于减少或预防微生物生物膜生长或用于去除微生物生物膜的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中该生物膜包含选自下组的一种或多种细菌或者甚至由其组成，该组由以下各项组成：链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、放线菌属、乳酸菌属、凝聚杆菌属、拟杆菌属、李斯特氏菌属、弯曲杆菌属、艾肯氏菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属及其组合。
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