CN117064919A - 鲵皮肤分泌物水解液在制备治疗牙本质敏感的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种鲵皮肤分泌物水解液在制备治疗牙本质敏感的药物中的用途。本发明提供的药物能够实现诱导牙本质表面及小管内矿化，以封闭牙本质小管；与牙本质小管周围的胶原纤维形成有效连接，增加再矿化牙本质的耐酸性；抑制口腔致龋菌生物膜形成和生长等效果。
Description
本申请要求2022年5月16日提交的中国发明专利申请CN2022105261375“鲵皮肤分泌物水解液在制备治疗牙本质敏感的药物中的应用”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种鲵皮肤分泌物水解液在制备治疗牙本质敏感的药物中的用途。
背景技术
牙本质敏感一直是困扰患者和口腔医生的临床难题。据文献报道，牙本质敏感在18-35岁年龄段的人群中，患病率约为42％。牙本质敏感是暴露的牙本质对外界刺激产生的短而尖锐的疼痛，这种疼痛不能归因于其他任何形式的牙齿缺陷或疾病。典型的刺激包括温度刺激、吹气刺激、机械性刺激、渗透压刺激和化学刺激。其中“其他任何形式的牙齿缺陷或疾病”包括龋病、牙周病、牙隐裂和牙外伤等疾病。
牙本质敏感的发病机制尚无统一定论，目前最普遍接受的理论为流体动力学说。牙本质敏感发生的解剖学基础是牙本质暴露，牙本质小管在口腔和牙髓两端开放。仅有牙本质的暴露不足以引起牙本质敏感反应，相应的牙本质小管必须开放以造成牙本质液的流动。在此基础上任何冷、热、甜、酸、机械刺激等均可导致牙本质液在牙本质小管中流动，从而激活牙髓牙本质复合体中的机械感受器，刺激神经纤维，引起疼痛。因此，牙本质小管的封闭被视为减少小管内液体流动、降低牙本质渗透性，进而缓解敏感症状的有效手段。
现有牙本质敏感的临床治疗方法包括脱敏药物治疗、激光治疗和药物+激光联合治疗。但是上述治疗方法都存在封闭表浅、易复发等问题。
牙本质仿生矿化的理论认为，牙本质矿化是以胶原纤维为模板，由非胶原蛋白(non-collagenous protein,NCP)调控实现。非胶原蛋白富含天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、磷酸化的丝氨酸(Ser)，因此其具有酸性特质，表面呈高密度负电荷，可以螯合钙离子，稳定无定型磷酸钙，并促进其向羟基磷灰石转化。但是非胶原蛋白来源有限且价格昂贵，临床应用受到了限制。
发明内容
本发明提供了一种鲵皮肤分泌物水解液在制备治疗牙本质敏感的药物中的用途。
在一些实施例中，所述药物用于促进牙本质的表面和/或牙本质小管内再矿化。
在一些实施例中，所述药物用于促进所述牙本质的表面和/或所述牙本质小管的矿物沉积。
在一些实施例中，所述药物用于封闭所述牙本质小管。
在一些实施例中，所述药物用于提高所述牙本质的耐酸性；和/或降低所述牙本质的渗透率。
在一些实施例中，所述药物能够抑制口腔致龋菌生物膜的形成和/或生长。
在一些实施例中，所述药物能够黏附于胶原纤维，所述胶原纤维位于所述牙本质的表面和/或所述牙本质小管内。
在一些实施例中，所述药物用于稳定无定型磷酸钙和/或促进胶原纤维内矿物沉积。
在一些实施例中，所述鲵皮肤分泌物水解液的浓度包括0.05-2mg/mL。
在一些实施例中，所述鲵皮肤分泌物水解液的浓度包括0.5-1mg/mL。
在一些实施例中，所述药物包括用于口腔的药物。
在一些实施例中，所述药物还包括口腔可接受的载体或赋形剂。
如本文所使用，术语“生物相容性”是指在其预期使用的体内环境中基本无毒，并且基本不会被个体的生理系统排斥的材料。评价生物材料的生物相容性应遵循生物安全性和生物功能性两个原则，既要求生物材料具有很低的毒性，同时要求生物材料在特定的应用中能够恰当地激发机体相应的功能(例如，材料与机体环境相互作用)。在一些实施例中，所述生物相容性满足FDA的要求。体内的免疫反应和组织修复过程十分复杂，通过一种细胞或组织确定某种材料的生物相容性往往是不够的。本发明参考国际标准化组织(International Standards Organization，ISO)10993和国家标准GB/T16886的要求，通过一系列实验验证了鲵皮肤分泌物水解液对生物体具有较高的生物相容性。
如本文所使用，“生物来源的”是指源自或取自天然存在的有机体和有机体的部分。换句话说，本发明涉及的鲵皮肤分泌物冻干粉和鲵皮肤分泌物水解液并非是通过基因重组技术获得的。
如本文所使用，“药物”是指用于治疗、治愈、预防或诊断疾病或用于在其他方面增强身体或精神健康的物质。在一些实施例中，所述药物包括用于口腔的药物。在一些实施例中，所述用于口腔的药物在正常使用过程中不是为了全身施用特定治疗剂的目的而有意吞服，而是保留在口腔中用于与牙齿和/或口腔组织实现一定时间的接触。在一些实施例中，所述药物包括鲵皮肤分泌物水解液(例如大鲵皮肤分泌物水解液)。在一些实施例中，所述药物还可以包括口腔可接受的载体或赋形剂，例如安全有效的材料和用于口腔的常规添加剂(包括氟离子源、磷酸盐源、抗牙结石剂、抗牙垢剂、研磨剂、起泡剂、维生素、酶、碱金属碳酸氢盐、增稠剂、湿润剂、水、表面活性剂、调味剂、甜味剂、抗微生物剂、防腐剂、矫味剂和着色剂及其混合物)。在一些实施例中，所述鲵皮肤分泌物水解液可以被配制成合适的口腔护理制剂，进而被直接施用或附着到牙齿上(例如牙本质上)，例如洁牙剂(包括糊剂、凝胶或液体制剂，例如牙膏、漱口水)、口腔凝胶、涂覆剂、泡沫、口喷剂等。
有益效果
本发明发现，鲵皮肤分泌物水解液可以作为或配制为治疗牙本质敏感的药物。在不引入现有技术中常规再矿化剂(例如氟化物、磷酸钙再矿化产品)的条件下，将鲵皮肤分泌物水解液直接施用接触(例如涂布或以牙膏、漱口水等形式)至牙本质(特别是脱矿牙本质)表面后，鲵皮肤分泌物水解液可以通过表面酚羟基、苯环等具有黏附性能的功能基团与牙本质表面暴露的胶原纤维形成稳定黏附，并通过吸附钙磷离子在牙本质表面及小管内沉积羟基磷灰石来封闭牙本质小管，以内外兼修的方式实现牙本质敏感的治疗。除此之外，鲵皮肤分泌物水解液还具有增加再矿化牙本质的耐酸性、降低牙本质的渗透率、抑制口腔致龋菌(例如变链菌)生物膜形成和生长等效果。
本发明涉及的鲵皮肤分泌物水解液是生物来源的，换句话说，其提取自鲵皮肤分泌物(以大鲵皮肤分泌物为例，每只成年大鲵每次大约可以获取50g黏液，且可多次提取)，来源经济环保。此外，鲵皮肤分泌物水解液可以被进一步的稀释或浓缩，适用于配制成各种形式的药物(例如口腔护理制剂)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为SSAD水解液的制备流程图；
图2为制得的SSAD水解液的示意图；
图3为0.5mg/mL SSAD水解液与脱矿牙本质表面黏附稳定性的SEM图像；
图4为不同浓度的SSAD水解液处理后的牙本质的表面SEM图像；
图5为不同浓度的SSAD水解液处理1周后，再矿化牙本质的表面SEM图像；
图6为再矿化牙本质形貌表征(表面)的SEM图像；
图7为再矿化牙本质形貌表征(截面)的SEM图像；
图8为再矿化牙本质耐酸性实验的SEM图像；
图9为再矿化牙本质表面XRD表征的实验图；
图10为再矿化牙本质牙本质小管封闭效果(渗透率实验)的实验图；
图11为SSAD诱导脱矿牙本质再矿化动物实验的实验图；
图12为CCK-8检测SSAD的细胞毒性(a为hDPSCs、b为L929、c为SSAD处理后的牙本质表面hDPSCs细胞活死染色)的实验图；
图13为SSAD抑制变异链球菌生物膜早期形成的SEM表征和MTT法检测SSAD对变异链球菌生物膜代谢活性的影响的实验图；
图14为SSAD对变形链球菌及白色念珠菌的抑菌作用的实验图；
图15为TEM表征SSAD对钙磷离子的稳定作用及诱导I型胶原纤维内矿化的作用的实验图；
图16为SSAD稳定无定型磷酸钙的作用和TEM分析SSAD-ACP复合物诱导I型胶原纤维内矿化效果的实验图；
图17为SSAD诱导脱矿牙本质再矿化动物实验的一个示例性实验流程。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例一：SSAD水解液的制备
通过图1所示的制备流程，制备SSAD水解液(也可以理解为“SSAD溶液”、“SSAD”、“大鲵皮肤粘液提取物”)。
以下为鲵皮肤分泌物水解液(以SSAD水解液为例)的示例性制备方法：
S1将二硫键还原剂和第一溶剂混合，得到第二溶剂。
合适的第一溶剂应当实质上不包含离子，例如超纯水、去离子水、注射用水、纯水等。
S2将鲵皮肤分泌物冻干粉与所述第二溶剂混合，得到第一混合液。
实际上，所述二硫键还原剂、所述第一溶剂和所述鲵皮肤分泌物冻干粉的混合顺序(即得到所述第一混合液的步骤)并没有具体限制。例如，所述第一混合液可以是所述二硫键还原剂、所述第一溶剂和所述鲵皮肤分泌物冻干粉一起加入和混合得到的，也可以是先将所述二硫键还原剂与所述第一溶剂混合、再将所述鲵皮肤分泌物冻干粉加入其中混合得到的，也可以是先将所述鲵皮肤分泌物冻干粉与所述第一溶剂混合、再将所述二硫键还原剂加入其中混合得到的，还可以是先将所述二硫键还原剂与所述鲵皮肤分泌物冻干粉混合、再将所述第一溶剂加入其中混合得到的。所述二硫键还原剂、所述第一溶剂和所述鲵皮肤分泌物冻干粉的比例可以根据实际需要进行相应的调整，本发明对此不做限定。作为示例，所述鲵皮肤分泌物冻干粉与所述二硫键还原剂的质量比可以是10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1或3:1。所述第一溶剂与所述鲵皮肤分泌物冻干粉的质量比可以是12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1或4:1。所述第二溶剂的浓度可以是大约1％-5％(具体取值可根据实际情况选为大约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，w/w％)。所述鲵皮肤分泌物冻干粉和所述二硫键还原剂的质量比的下限(最小值)可以是3:1。所述第一溶剂和所述鲵皮肤分泌物冻干粉的质量比的下限(最小值)可以是4:1。
在一些实施例中，所述鲵包括大鲵属、隐鳃鲵属、山溪鲵属、小鲵属、巴鲵属、爪鲵属、肥鲵属、拟小鲵属、北鲵属、极北鲵属中的一种或多种。皮肤是鲵的重要的呼吸器官，分布着粘液腺和颗粒腺。本发明选择中国大鲵皮肤分泌物的原因在于，其能够代表鲵这类两栖动物受刺激所分泌的粘液。电刺激和皮肤刮擦的方式可促进粘液的分泌。
S3将所述第一混合液充分水解，得到第二混合液。
所述水解的温度条件包括0-8℃(优选为0-4℃)。水解时间与具体的水解温度、所述第二溶剂的浓度、鲵皮肤分泌物冻干粉的浓度等因素有关。在0-8℃的温度范围内，温度越高，水解时间相对越短；所述第二溶剂的浓度越高，水解时间相对越短；鲵皮肤分泌物冻干粉的浓度越高，水解时间相对越长。水解时间还可能跟所使用的具体二硫键还原剂种类有关。因此，水解时间可以根据实际需要进行相应的调整，本发明对此不做限定。示例性的水解时间包括2-168h，优选为12-48h。混合可以以本领域常用的混合方式进行，例如震荡混匀、涡旋混匀等。作为优选，S3可以在低温真空反应釜中进行，所述真空反应釜的真空度＜5kPa。
S4将所述第二混合液离心并收集上清液。
离心的具体条件可以根据实际需要进行相应的调整，本发明对此不做限定。示例性的离心条件包括在4℃下、以4500rpm离心10min。
S5将所述上清液装入截留分子量≤1000的透析袋中置于所述第一溶剂中充分透析，得到所述鲵皮肤分泌物水解液。所述鲵皮肤分泌物水解液的浓度可以包括5-7％。
所述透析的温度条件包括0-8℃(优选为0-4℃)。优选采用截留分子量为500或1000的透析袋。透析时间实际上与透析期间的处理方式相关，例如可以通过提高更换透析袋所处第一溶剂的次数等方式以缩短透析时间。因此透析时间可以根据实际需要进行相应的调整，本发明对此不做限定。
其中，所述二硫键还原剂包括特异性二硫键还原剂。在本发明中，“特异性二硫键还原剂”是指能够将所要还原的蛋白或多肽中分子间二硫键还原，而尽量保留分子内二硫键不被还原的二硫键还原剂。所述特异性二硫键还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)。当然，在本发明提供的鲵皮肤分泌物水解液的制备方法中，还可以搭配本领域已知的常见的蛋白变性剂/有机溶剂使用，例如维生素C、乙酸、盐酸、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、EDTA、尿素、乙醇、丙酮、盐酸胍、十二烷基硫酸钠和氢氧化钠以及蛋白酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶)。
进一步的，本发明提供的鲵皮肤分泌物水解液的制备方法还可以包括S6将所述鲵皮肤分泌物水解液浓缩，得到浓缩鲵皮肤分泌物水解液。所述浓缩鲵皮肤分泌物水解液的浓度≥10％。
示例性的浓缩方法包括将所述鲵皮肤分泌物水解液装入截留分子量≤3K的浓缩离心管中离心或将所述鲵皮肤分泌物水解液蒸发浓缩。
作为优选，上述任何步骤在真空或惰性气氛下进行。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将收集到的新鲜大鲵皮肤分泌物放入灭菌离心管中，4℃下PBS清洗离心3次，5％乙酸清洗离心1次后置于-20℃冰箱中预冻4小时。-80℃低温冷冻干燥机冷冻干燥24小时后，冷冻球磨仪粉碎至300目，分装储存于-20℃冰箱中用于后续的实验。将大鲵皮肤分泌物冻干粉、维生素C、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)、蒸馏水按质量比10:5:5:100混合反应24小时。4000rpm离心15分钟取上清液，透析24小时后，得到SSAD水解液。
图2中的a、b和c分别展示了大鲵皮肤分泌物冻干粉经TCEP处理0小时、5小时和24小时后的溶解情况。结果表明，随着TCEP处理时间的延长，大鲵皮肤分泌物冻干粉逐渐溶解于水中。
实施例二：SSAD水解液在脱矿牙本质表面的黏附效果
首先，发明人选取新鲜拔除的第三磨牙(患者年龄为18-30岁；牙齿无龋坏、充填物和牙体缺损；根尖孔闭合完全；无氟斑牙、四环素牙和釉质发育不良)，通过低速切割机制备牙本质片(大小为4×4×1mm)。依次使用600目、800目、1000目和2000目的碳化硅砂纸在流动水冲洗下打磨抛光牙本质片各60秒，使其表面平整，使用去离子水超声清洗。然后，打磨抛光后的牙本质片浸泡于0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)溶液中，浸泡反应30min，制备脱矿牙本质敏感模型(以开放牙本质小管口)。EDTA可以选择性地去除羟基磷灰石，使牙本质表面脱矿，同时能够保持胶原纤维的结构不发生变性。
经EDTA脱矿的牙本质表面形貌如图3a和图3b所示，可见牙本质表面胶原纤维暴露，牙本质小管开放。将脱矿牙本质片表面轻吹，使用小毛刷反复涂布0.5mg/mL SSAD水解液20s，轻吹，通过SEM观察SSAD与牙本质表面表面胶原纤维黏附效果。如图3c和图3d所示，SSAD呈球形纳米颗粒，均匀黏附在牙本质表面及牙本质小管内壁的胶原纤维周围(如箭头所示)。为了验证SSAD与胶原纤维的黏附性能，发明人将SSAD涂布处理后的牙本质片置于去离子水中超声(功率400W)荡洗1min。如图3e和图3f所示，经超声震荡处理后的胶原纤维周围仍有大量SSAD存留(如箭头所示)。这表明SSAD水解液可以与脱矿的牙本质形成稳定黏附(图3b、图3d和图3f分别为图3a、图3和图3e的放大图)。
实施例三：SSAD诱导脱矿牙本质再矿化最佳浓度筛选
发明人使用不同浓度的SSAD水解液(2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL)涂布处理脱矿的牙本质，然后通过SEM进行形貌观察。如图4所示，2mg/mL SSAD水解液在牙本质表面发生团聚，呈片状沉积，覆盖胶原纤维(图4a、图4b)。1mg/mL SSAD水解液在牙本质表面呈大小不一的颗粒分布，部分区域仍有团聚(图4c、图4d)。0.5mg/mL SSAD水解液在牙本质表面均匀分散，呈粒径均一的纳米级球形颗粒状，胶原纤维呈蓬松状态，无明显塌陷(图4e、图4f)。0.1mg/mL SSAD水解液在牙本质表面分布均匀，但形成的纳米颗粒粒径小于0.5mg/mL处理组，部分区域可见胶原坍塌(图4g、图4h)。0.05mg/mL SSAD水解液在牙本质表面无明显纳米颗粒样沉积，胶原纤维出现坍塌(图4i、图4j)。
将不同浓度SSAD水解液处理后的牙本质置于再矿化液中反应1周，通过SEM观察表面形貌。如图5所示，各处理组牙本质表面均可见矿物沉积，其中1mg/mL及0.5mg/mL SSAD水解液处理组表面矿物沉积较为明显，而后者表面矿物分布更为均匀，这可能与不同浓度SSAD在胶原表面分布的差异有关。鉴于此，选择0.5mg/mL SSAD水解液用于后续实验。
实施例四：SSAD诱导脱矿牙本质再矿化封闭牙本质小管的体外实验
为了进一步观察SSAD诱导脱矿牙本质再矿化封闭牙本质小管的效果与再矿化时间的关系，发明人将去离子水涂布处理(对照组)和0.5mg/mL SSAD涂布处理(SSAD处理组)的脱矿牙本质置于人工唾液中，通过SEM分别观察其再矿化反应1周、2周和4周的表面(图6)及截面形貌(图7)。
去离子水处理组再矿化1周后，牙本质表面无明显矿物沉积(图6的A1和B1)；再矿化2周后，牙本质表面少量矿物沉积(图6的A2和B2)；再矿化4周后，牙本质表面矿物沉积量增加，但是沉积物呈不均匀分布，且仍可见大量牙本质小管口暴露(图6的A3和B3)。从截面观察，再矿化1周(图7的A1和B1)、2周(图7的A2和B2)和4周(图7的A3和B3)的牙本质小管内，未见明显矿物沉积。
SSAD处理组再矿化1周的牙本质表面，可见少量散在分布的早期矿物沉积颗粒分布在SSAD周围(图6的C1和D1)；再矿化2周时，牙本质表面及小管内矿物沉积量增多，而且分布均匀(图6的C2和D2)；再矿化4周时，牙本质小管口被均匀分布的纳米矿物封闭(图6的C3和D3)。从截面观察，SSAD处理组的再矿化牙本质小管内可见矿物沉积，且随再矿化时间延长，小管内沉积物逐渐增多，变密，充满牙本质小管内壁(图7的C1-C3和D1-D3)。上述实验说明，SSAD可以诱导牙本质表面及牙本质小管内形成矿物沉积，封闭牙本质小管。
进一步地，发明人选取去离子水处理组和0.5mg/mL SSAD处理组再矿化4周的牙本质样本，经6％柠檬酸浸泡处理1分钟，超声荡洗5分钟后，进行SEM观察，探究SSAD的耐酸性能(图8)。去离子水处理组的牙本质表面及小管内均无明显矿物存留(图8a、图8b和图8c)；SSAD处理组在牙本质表面及小管内均可见大量矿物存留(图8d、图8e和图8f)。上述实验说明，SSAD处理组牙本质表面沉积的矿物质与牙本质结合紧密，具有更优的耐酸性。
通过XRD(X射线衍射)分别对未脱矿牙本质、EDTA脱矿后牙本质以及去离子水和0.5mg/mL SSAD处理后再矿化4周的牙本质进行表征(图9)。如图9所示，再矿化后的牙本质表面形成了羟基磷灰石晶体，且SSAD处理组表面沉积的羟基磷灰石晶体结晶度更高。
通过渗透率实验装置(示意图如图10a所示)，检测再矿化牙本质的牙本质小管封闭效果。将EDTA脱矿的牙本质样本的导水率作为最大渗透率(100％)，再矿化后牙本质样本的渗透率按该导水率的百分比表示。如图10b所示，去离子水处理组再矿化4周，牙本质渗透率为82.9％，柠檬酸处理后，渗透率升高为88.8％。而0.5mg/mL SSAD处理组再矿化4周，牙本质渗透率为21.1％，柠檬酸处理后，渗透率升高为38.5％。上述实验说明，SSAD处理组再矿化牙本质可以实现牙本质小管封闭，降低牙本质小管渗透率。
实施例五：SSAD诱导脱矿牙本质再矿化动物实验
SSAD诱导脱矿牙本质再矿化动物实验的示例性实验流程如图17所示。为了模拟口腔环境中牙本质的再矿化效果，本实验将牙本质片制备成边缘光滑的椭圆形，大小约4mm×3mm，厚度为1mm(图11a)，打孔后通过钢丝固定在SD大鼠的切牙和第一磨牙之间，如图11b所示。对照组脱矿牙本质片在口内再矿化4周后，SEM观察表面形貌可见牙本质小管口仍呈开放状态(图11c)，剖面观可见牙本质小管内未见明显矿物沉积(图11d)。0.5mg/mL SSAD水解液处理组牙本质片在大鼠口腔内再矿化4周后，牙本质表面可见封闭物(图11e)，牙本质小管口内及小管深部可见封闭物(图11f)。通过EDS(X射线能谱仪)检测分析，牙本质小管内封闭物的钙磷含量比为2.16(图11g、图11h)，高于天然羟基磷灰石中的钙磷比1.67。
实施例六：SSAD对细胞活力的影响
通过CCK-8评估不同浓度SSAD对hDPSCs(human dentalpulp stem cells，人牙髓干细胞)的细胞毒性。实验结果如图12a所示，除2mg/mL SSAD组，其余各组SSAD与hDPSCs细胞培养24小时后的细胞相对存活率都大于85％。
将L929细胞培养至对数生长期，于96孔板中铺板，每孔细胞数为5000个，在5％CO2环境、37℃培养24小时。在每孔中分别加入不同浓度梯度的SSAD水解液，浓度分别为：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL，设置不含SSAD水解液的孔为对照组，每组设置6个复孔，每孔加入细胞悬液100μL，放入细胞培养箱中，继续培养24小时；通过CCK-8检测试剂盒检测各组细胞相对活力。如图12b所示，SSAD水解液浓度为2mg/mL时，相对于对照组，细胞存活率为66.9％(P<0.01)，浓度为1mg/mL时，细胞相对存活率为89.5％(P<0.05)。浓度低于0.5mg/mL各浓度实验组，细胞存活率与对照组无统计学差异。说明浓度小于1mg/mL的SSAD水解液对L929细胞有良好的生物安全性。
通过细胞活死比染色(图12c)可见，不同浓度SSAD处理后的牙本质表面有大量活细胞(呈绿色荧光)，仅可见少量死细胞(呈红色荧光)。
实施例七：SSAD的抑菌性能
SSAD对变异链球菌及白色念珠菌的抑菌作用的实验流程如图14a所示。不同分子量SSAD与变形链球菌共培养24h后，进行菌落形成单位平板计数，可见空白组有大量菌落生长，SSAD各组均无菌落形成(图14b)。
本实施例进一步研究了0.5mg/mL SSAD水解液在变异链球菌生物膜形成中的早期抑制作用。接种变异链球菌S.mutans UA159菌悬液10μL于10mL脑心浸液(BHI)培养基中，37℃条件下兼性厌氧培养14-16小时，以1:20增菌2.5-3小时。革兰染色后显微镜镜下观察，判断菌液无污染。
选取在临床上收集的新鲜离体牙，使用硬组织切片机垂直于牙长轴进行切割，制备1mm±0.1mm厚度的牙本质片样本。使用高速涡轮机将牙本质片进一步切割为5mm×5mm大小。用600目、800目、1000目及2000目SiC砂纸湿打磨牙本质片各60秒。去离子水超声清洗10分钟，重复2次。将牙本质片浸泡于0.5M的EDTA溶液(PH 7.4)中30分钟。使牙本质脱矿，牙本质小管暴露，以建立脱矿牙本质模型，去离子水超声清洗10分钟，重复2次。将以上样本置于紫外光下光照，以消毒灭菌。
SSAD水解液经0.22μm滤器过滤后使用。
将脱矿牙本质片样本随机分为两组。第一组(空白对照组)：气枪轻吹牙本质表面，用小毛刷蘸取去离子水，涂布牙本质表面20秒，自然干燥备用。第二组(SSAD处理组)：气枪轻吹牙本质表面，用小毛刷蘸取0.5mg/mL SSAD水解液，涂布牙本质表面20秒，自然干燥备用。将对照组及SSAD水解液处理组牙本质片正面朝上(处理过的一面为正面)，置于24孔板中。使用含1％蔗糖的BHI液体培养基，将变异链球菌的菌液的浓度调整为2×107CFU/mL。每孔加入1mL菌液，37℃厌氧条件下培养24小时。取出孔板，用无菌PBS轻柔漂洗，去除牙本质片表面未粘附的细菌，转移至新的24孔板中，用于后续实验检测。
扫描电镜下观察生物膜形貌，在变异链球菌生物膜中(图13a)，SSAD水解液对细菌及胞外基质产生具有抑制作用。SSAD水解液处理的牙本质表面(图13a-b、图13a-d)生物膜缺乏网状交联结构，菌体团簇减少，细菌排列疏松，细菌的数量及胞外基质均少于对照组(图13a-a、图13a-c)。
采用MTT法检测牙本质片表面生物膜的代谢活性，如图13b可见，相较于对照组，SSAD水解液处理组表面生物膜活性明显降低(P<0.05)。
实施例八：SSAD诱导脱矿牙本质再矿化的机制
如图16a所示，钙磷溶液混合后，迅速形成沉淀。加入SSAD的钙磷溶液可以保持均匀稳定的悬液2周，不发生沉淀。这表明SSAD可能具有稳定无定型磷酸钙(ACP)的作用。
矿化前，重组的I型胶原纤维的TEM图像如图16b所示。实验表明SSAD-ACP复合物能够诱导I型胶原纤维内矿化。
本实施例以单层重组I型胶原为模型，进一步评估0.5mg/mL SSAD水解液对胶原纤维矿化的作用：
①单层重组I型胶原制备：取I型鼠尾胶原溶液(3mg/mL)，去离子水稀释至0.05mg/mL，取5μL滴在300目透射电镜专用镍网上，置于氨水密闭环境中自组装4小时，取出镍网，置于37℃恒温水浴锅中继续孵育12小时，获得重组I型胶原。用去离子水轻柔漂洗，至漂洗液PH为中性。滤纸吸干多余水分，正面朝下置于0.05wt％戊二醛中，室温条件下交联反应1小时，随后用去离子水轻柔漂洗，去除多余戊二醛。经醋酸铀负染，室温静置，自然干燥，TEM镜下观察。
②单层重组I型胶原矿化反应：分别取0.5mg/mL SSAD水解液或去离子水5μL滴于步骤①中负载I型胶原的镍网表面，室温静置干燥，将镍网正面朝下，置于仿生再矿化液中，分别于反应6小时、12小时和24小时取出镍网，于去离子水中轻柔漂洗，自然干燥后，于TEM镜下观察。
通过TEM观察不同时间点SSAD水解液处理组与对照组重组I型胶原矿化效果。如图15a所示，矿化处理前的胶原纤维经醋酸铀负染后，可见清晰横纹结构(白色箭头所示)。如图15b所示，再矿化反应6小时，对照组矿化液中钙磷离子，在溶液中呈晶体颗粒形态(白色箭头所示)。胶原纤维再矿化反应12小时和24小时均无明显差异，胶原纤维电荷强度较低，溶液中可见羟基磷灰石晶体颗粒(图15d、图15f)。再矿化反应6小时，SSAD水解液处理组溶液中钙磷离子呈无定型态(图15c的白色箭头所示)，未见明显晶体颗粒形成，再矿化反应12小时可见矿物晶体向胶原纤维周围聚集(图15e)，再矿化24小时可见胶原纤维电荷强度有增强，溶液中可见大量羟基磷灰石晶体颗粒(图15f)。说明SSAD水解液能够稳定钙磷离子呈无定型态，并诱导钙磷向胶原表面聚集，促进胶原纤维内形成矿物沉积。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
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Claims (10)
1.鲵皮肤分泌物水解液在制备治疗牙本质敏感的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于促进牙本质的表面和/或牙本质小管内再矿化。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物用于促进所述牙本质的表面和/或所述牙本质小管的矿物沉积。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物用于封闭所述牙本质小管。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述牙本质的耐酸性；和/或降低所述牙本质的渗透率。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物能够抑制口腔致龋菌生物膜的形成和/或生长。
7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物能够黏附于胶原纤维，所述胶原纤维位于所述牙本质的表面和/或所述牙本质小管内。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于稳定无定型磷酸钙和/或促进胶原纤维内矿物沉积。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述鲵皮肤分泌物水解液的浓度包括0.05-2mg/mL，可选地包括0.5-1mg/mL。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包括用于口腔的药物。
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Legal Events
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