CN104311820B - 一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法 - Google Patents
一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法。本发明公开了非病毒药物载体技术领域的基于多糖(包括环糊精、葡聚糖、壳聚糖、普罗兰等)接枝天冬氨酸构建一系列具有低毒、高效且可降解等优异性能的功能化阳离子药物载体的方法。本方法简单易行，具有分子量可调控性；通过酰胺键的降解促进了药物的释放，通过苄基胺解实现了药物载体的功能化，并且为进行host‑gest提供了条件。通过本方法构建的阳离子药物载体在COS7、HepG2、C6、Hella、HEK293、A549等细胞中具有高于金标PEI的转染效率，具有商业化潜力。
Description
技术领域
本发明属于非病毒药物载体技术领域，特别涉及了一种基于天然多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解功能化阳离子药物载体的方法，其中包括环糊精、葡聚糖、壳聚糖、普罗兰等。
背景技术
随着人类生活水平的提高和环境污染的日益加剧，癌症和心脑血管疾病发病率越来越高，严重威胁人类的健康。基因治疗在攻克人类疾病、先天性遗传疾病以及心脑血管疾病方面起着越来越重要的作用，将成为医疗领域攻克重大疾病的主力军。基因治疗包括目的基因的寻找、基因载体的研制以及目的基因在细胞中的特异性表达三个重要方面。基因导入系统是基因治疗的核心技术，缺乏安全而高效的基因载体是目前制约基因治疗实施的主要瓶颈。
基因载体是目的基因进入靶细胞的工具，是目的基因在细胞内表达的前提和基础。应用于基因治疗的载体主要分为病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viralvector)两类。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹病毒。病毒载体可以克服细胞屏障和免疫防御机制具有较高的转染效率，但是缺乏安全性，可能引起致癌作用与自身免疫反应(unexpected immune response)和白细胞的病毒变化，严重时会造成病人多器官衰竭导致死亡。病毒载体还可能会引起插入突变的现象，从而导致宿主细胞的恶行转化，此外病毒载体携带DNA的能力有限，不利于大规模的生产。与病毒性载体相比，非病毒载体安全性高，并且具有低免疫原性。虽然其无法克服细胞内外的各种屏障，转染效率低于病毒性基因载体，但是具有能够携带大量DNA分子、容易大批量生产及费用低廉等显著优点，具有良好的发展潜力，因此基因载体领域的研究者把目光投向人工合成的非病毒载体，致力于合成转染效率高且毒性低的非病毒载体。阳离子聚合物是目前研究最广泛的人工合成非病毒载体。阳离子聚合物能够自发与带负电荷的基因通过电荷相互作用，可形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而协助基因穿过带负电的细胞膜有效避免质粒被核酸酶降解，保证目的基因顺利表达。
随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸(poly(L-Iysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(poly(amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N-二甲氛基乙酯(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate),PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有较高的转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的毒性，大大限制了它们的应用。因此，开发低毒而高效阳离子聚合物是研究非病毒基因载体的核心内容。为了降低毒性，目前一种思路是在阳离子聚合物中引入聚乙二醇(PEG)等生物相容性成份，另一种思路是多糖阳离子化，包括壳聚糖(chitosan)、环糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)、普罗兰等。但是上述报道的非病毒载体的安全性和转染效率还远远不能满足实际应用的要求。当前，已经商品化的基因载体只有脂质体lipfect2000，但其成本昂贵，无法成为癌症患者的选择，难以应用于临床治疗。
多糖广泛存在于自然界中具有无毒、极好的生物相容、生物可降解、可再生等特性，并且在免疫调节和抗病毒抗癌方面有着出色的表现，非常实用于制备药物释控体系。以天然多糖为基质，接枝阳离子聚合物仍可以保持高的转然效率。在众多的多糖骨架中，现如今研究最多的是壳聚糖、葡聚糖、环糊精、普罗兰、明胶、纤维素、淀粉等一系列多糖。葡聚糖(Dextran)作为一种多糖在免疫调节、抗辐射、调节肠胃、帮助组织结构再生或修复、促进伤口愈合及预防心脑血管和糖尿病等方面均具有突出表现，对肝炎、肿瘤、心血管、糖尿病、降血脂、抗衰老等方面均有独特的生物活性。其特有的靶向性特点，能锁定休眠期、耐药性及亚临床病灶的“残存病毒细胞”，从而“同步”减毒增效，极大限度的保障临床治疗效果。同时，葡聚糖可以快速激活机体自身的免疫监管和识别机制，从而增强它们的战斗力，使自身免疫系统达到最佳平衡状态，保持肌体的健康。普罗兰多糖(Pullulan)是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，它除了具备其他多糖所具有的优点之外，其本身带有一定的肿瘤靶性，因而近几年在广泛应用于肿瘤治疗方面的研究。环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，外侧上端(较大开口端)由C2和C3的仲羟基构成，下端(较小开口端)由C6的伯羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区。
乙二胺(Ethylenediamine，ED)无色或微黄色黏稠液体，有类似氨的气味，呈强碱性。阳离子药物载体携带DNA的能力随分子量的增大而增大，但同时毒性也在增大从而限制了转染效率。因此，发展可降解阳离子载体具有十分重大的意义。除了可生物降解的基于PLL、PAA和甲基丙烯酸酯的大分子，各种其它可降解的化合物也已经合成并用于研究基因转染。其中包括聚(氨基酸)，聚(氨基酯)和含磷基的聚合物。聚氨基酸被广泛的应用于生物医用领域，这得益于它们的低毒性，良好的生物相容性和生物降解性。特别是聚天冬氨酸，被广泛的用于制备纳米颗粒、胶束、纳米胶囊和生物膜，用来作为药物载体材料。
尽管天然多糖及聚天冬氨酸已被广泛应用于药物载体领域，有了很多研究成果，但基于天然多糖接枝聚天冬氨酸基构建可降解功能化阳离子载体目前还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于天然多糖接枝聚天冬氨酸构建可降解功能化阳离子药物载体的方法。该方法利用具有无毒、极好的生物相容、生物可降解、可再生等优良性能的包括环糊精、葡聚糖、壳聚糖以及普罗兰在内天然多糖接枝降解性能优良的聚天冬氨酸作为基体，既可以通过苄酯进行胺解、组装又可以通过环糊精空腔与其它分子进行组装，从而实现天然多糖接枝聚天冬氨酸基可降解药物载体的功能化，具有商业化潜力。
本发明的反应体系中，引发剂的合成从多糖本体开始，激活多糖本体上的官能团羟基，将乙二胺与激活的官能团反应，使得乙二胺接入到多糖本体上作为大分子引发剂的引发点，得到多糖大分子引发剂。然后通过开环聚合(ring-opening)引发天冬氨酸苄酯单体聚合得到天然多糖接枝聚天冬氨酸基体，对所得的基体或通过与各种二胺的反应形成阳离子药物载体，或与其它阳离子小分子进行组装形成功能化阳离子药物载体。功能性阳离子的引入：一是利用胺解同样的原理，直接采用或通过化学反应使带有功能性基团的物质带上胺基，转化为胺解反应。另一种是利用苄基或者引进环糊精空腔与功能性阳离子进行自组装。
本发明所述的基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法，其具体反应条件为：
1)聚合反应：该聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体组成；多糖大分子引发剂上的胺基、有机溶剂、单体之间的摩尔比为(1:0.01:10)-(1:0.07：100)反应温度为40-50℃；无水无氧环境下反应3-5天；反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，最后放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮得到多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物；
2)将步骤1)中初步得到的多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物的苄基与含两个及以上氨基的胺类化合物按摩尔比为1:8-1:14溶于二甲基亚砜或吡咯烷酮中进行胺解反应，多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物与二甲基亚砜质量比为(1:7)-(1:11)，多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物与吡咯烷酮质量比为(1:10)-(1:20)；反应温度为室温，无氧无水条件下反应10-12小时；同样反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮，然后将产物溶解在水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g，产物溶解后放入截留分子量为7000MW的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建的可降解药物载体；
步骤1)中各组分加入顺序为：先将多糖大分子引发剂和单体分别溶于有机溶剂，然后混合进行聚合反应。
所述的多糖大分子引发剂的结构式如下：
R为多糖的羟基被取代后的骨架结构，F为含两个及以上氨基的胺类化合物，n＝1-40；多糖为分子量6000-25000的葡聚糖、分子量为900-1200的环糊精、分子量为4000-20000的壳聚糖、分子量为8000-20000的普罗兰；所述的单体为天冬氨酸β-苄酯N-羰基内酸酐；所述的有机溶剂选自亚砜类、酰胺类、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、正己烷中的一种或几种。
所述的酰胺类为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺；所述的亚砜类为二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、二己基亚砜。
所述的含两个及以上氨基的胺类化合物为乙二胺、二亚乙基三胺。
当有机溶剂为二甲基亚砜时，聚合反应体系中不包括二氯甲烷。
当反应体系中加入二氯甲烷时，有机溶剂为体积比为1:1的酰胺类有机溶剂与二氯甲烷的混合溶剂。
当多糖大分子引发剂为环糊精大分子引发剂时得到的基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建的可降解药物载体，与线性聚天冬氨酸β-苄酯按照环糊精与线性聚天冬氨酸β-苄酯的苯环摩尔比5:1-1:1的摩尔比例放入玻璃试管中，缓慢加热震荡，直到没有不溶物，随油浴缓慢降至室温，冷冻干燥即可得自组装的产物。
有益效果：本发明利用天冬氨酸苄酯与三光气进行合环反应形成天冬氨酸β-苄酯N-羰基内酸酐单体(BLA-NCA)单体，然后利用多糖大分子引发剂引发单体开环聚合反应形成多糖接枝聚天冬氨酸基聚合物，进一步阳离子功能化得到系列多糖接枝天冬氨酸基阳离子功能化药物载体，数均分子量(Mn)从10000-80000，分子量分布窄，分布指数(Mw/Mn)1.4-1.9。该反应平稳，易于调控，并可根据需要制备出多种不同分子量系列的、窄分子量分布的可降解阳离子功能化多糖药物载体，并且其储存稳定性好，在4℃及以下保持干燥冷藏放置几天或几个月后仍可保持原有性能。该多糖阳离子基因载体在HepG2、Hela、C6、Cos7、HEK293等细胞中具有高于国际上已经投入商业化使用的脂质体lipfeCt2000的转染效率，更重要的是其降解性能良好，具有远远低于金标PEI的毒性，使用方法简单，具有商业化潜力。
附图说明
图1为转染效率图；R-PAsp-ED为实施例2得到的多糖接枝聚天冬氨酸基可降解阳离子药物载体。
图2细胞内毒性图；PEI为金标，R-PAsp-ED为实施例2得到的多糖接枝聚天冬氨酸基可降解阳离子药物载体。
图3降解图；R-PAsp-ED-3为实施例2得到的多糖接枝聚天冬氨酸基可降解阳离子药物载体的降解图。
具体实施方式
实施例1
首先将接入胺基引发点的α-环糊精引发剂溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷＝1:1(体积比)中，将单体天冬氨酸β-苄酯N-羰基内酸酐按比例加入，在氮气保护下，于室温反应5天。用水沉淀冻干得到星状环糊精接枝聚天冬氨酸基聚合物备用。
然后利用原子转移自由基聚合(ATRP)制备低分子量的PDMAEMA，4mL的DMAEMA和摩尔比为1:1.2:1.5的α-溴代异丁酸乙酯(0.35mL)，溴化亚铜，N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺在磁力搅拌作用下加入一个装有12mL的甲醇/水混合液(3/1,v/v)50mL的反应瓶中，通入氮气鼓泡7分钟以除去体系中的氧气，之后加入溴化亚铜，开始反应。聚合反应在氮气氛围下室温下反应8小时。之后加入200mL四氢呋喃以终止反应，将蓝色的聚合物溶液通过一个短的中性氧化铝的柱子以除去其中的引发剂混合物。之后将聚合物溶液旋蒸除去过量的溶剂，之后将得到的聚合物粗产物通过透析的方法提纯，冷冻干燥得到纯净的低分子量PDMAEMA聚合物。之后将得到的聚合物溶解于DMF中，得到0.1g/mL的聚合物溶液，后加入过量的NaN3，在搅拌的条件下室温反应2天。反应液加入正己烷中沉淀聚合物，真空干燥除去正己烷，然后用透析的方法提纯聚合物，冷冻干燥得到末端为-N3基的低分子量PDMAEMA的固体。之后将该聚合物溶解于四氢呋喃中，加入2倍摩尔比的三苯基磷，室温下搅拌过夜。之后加入5mL的去离子水，继续反应12小时。旋蒸除去四氢呋喃，过滤除去沉淀物，加水透析24个小时，冷冻干燥得到末端氨基化的低分子量PDMAEMA固体。
聚天冬氨酸β-苄酯通过与不同比例的末端氨基化的低分子量PDMAEMA进行胺解反应改性，得到星状的聚天冬氨酸-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯阳离子共聚物。α-环糊精聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物和末端氨基化的低分子量PDMAEMA按照不同比例置入50mL反应瓶中，加入DMSO溶解，在氮气保护搅拌条件下40℃反应48小时。之后，过量的乙二胺或乙醇胺加入反应瓶中，以胺解掉上一步反应未胺解掉的苯乙基，得到两种接枝PDMAEMA比例相同的但结构不完全相同的共聚物，之后加入大量的水透析(截留分子量3500)，冷冻干燥得到纯净的产物。
反应中α-环糊精接平均接4个胺基引发点，得到的α-环糊精接枝聚天冬氨酸-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯阳离子共聚物分子量(Mn)为69800，分子量分布为1.78。
实施例2
50℃氮气保护下连续反应，首先将50mg葡聚糖大分子引发剂(记为Dextran-NH2)加入无水二甲亚砜中溶解，然后将制备好的单体按照Dextran-NH2/BLA-NCA＝1:50(质量比)溶解在适量无水二甲亚砜中。将含有葡聚糖大分子引发剂的溶液加入干燥的反应瓶中，含有单体的溶剂加入其中，通氮气7min，放入50℃中搅拌反应3-5天。用乙醚沉淀直到形貌变为固体，加水洗涤两次冻干。将得到的葡聚糖接枝聚天冬氨酸基聚合物溶解在适量无水二甲亚砜中，按照重复单元/乙二胺＝1:8(摩尔比)的比例加入乙二胺，通氮气5min，室温下反应8-12小时，乙醚沉淀直到形貌变为固体，真空干燥除去剩余乙醚，取截留分子量为7000的透析袋，透析8小时，冻干即可得到葡聚糖接枝聚天冬氨酸基阳离子载体。
聚合物(Dextran-PAsp-ED)的数均分子量(Mn)为62200，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.51。
实施例3
用乙二胺(ED)引发单体(BLA-NCA)聚合得到线性聚天冬氨酸β-苄酯记为PBLA备用。同时α-环糊精引发剂引发单体(BLA-NCA)聚合得到星状聚合物记为α-CD-PAsp-DET，取一定量聚合物和摩尔数50倍单体单元的二乙基三胺(DET)，分别溶解在N-甲基吡咯烷酮中，冰浴降温至0℃，将两溶液混合，在冰浴中反应1小时，加入大量的去离子水，并加入盐酸调节pH值至溶液为中性。透析，冷冻干燥得到纯净的产物。
将得到的部位替换的线性聚天冬氨酸β-苄酯和二乙基三胺改性的星状的聚天冬氨酸，按照苯环和环糊精摩尔比1：1的比例放入一玻璃试管中，缓慢加热震荡，直到没有不溶物，随油浴缓慢降至室温，冷冻干燥即可得自组装的产物。
其中线性聚天冬氨酸β-苄酯(PBLA)的分子量为7500，分子量分布为1.25；星状α-环糊精接枝聚天冬氨酸β-苄酯阳离子聚合物α-CD-PAsp-DET分子量为11100，分子量分布为1.26。
实施例4
将α-环糊精用壳聚糖连接起来，然后接乙二胺(ED)引入引发点得到CS-CD-NH2多糖大分子引发剂，与单体(BLA-NCA)进行聚合反应得到壳聚糖-环糊精接枝聚天冬氨酸基聚合物，然后与乙二胺(ED)进行胺解反应得到壳聚糖-环糊精接枝聚天冬氨酸基阳离子药物载体。将对大部分癌细胞具有靶向性的叶酸(FA)通过与金刚烷胺(Ad)的反应得到FA-Ad,利用FA-Ad与环糊精空腔进行自组装使其带上靶向性得到壳聚糖-环糊精接枝聚天冬氨酸基可降解阳离子功能性载体。
实施例5
利用上述相同的方法合成葡聚糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯，然后利用含有多个胺基的庆大霉素进行胺解反应。庆大霉素具有优良的抗菌性能，实现了阳离子功能化。
实施例6
PEG4000两端胺基化，将α-环糊精串起来，通过单体BLA-NCA聚合反应封端，利用我们课题组已报道的ATRP方法在α-环糊精上接单体甲基丙烯酸甲酯(GMA)，通过开环反应形成阳离子药物载体。利用据天冬氨酸苄酯的优良降解性能，使带有聚合物的α-环糊精散开，从而起到快速释放DNA，显著降低毒性的作用。
Claims (5)
1.一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法，其特征在于，其具体反应条件为：
1)聚合反应：该聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体组成；多糖大分子引发剂上的胺基、有机溶剂、单体之间的摩尔比为(1:0.01:10)-(1:0.07：100)，反应温度为40-50℃；无水无氧环境下反应3-5天；反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，最后放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮得到多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物；
2)将步骤1)中初步得到的多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物的苄基与乙二胺或二亚乙基三胺按摩尔比为1:8-1:14溶于二甲基亚砜或吡咯烷酮中进行胺解反应，多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物与二甲基亚砜质量比为(1:7)-(1:11)，多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物与吡咯烷酮质量比为(1:10)-(1:20)；反应温度为室温，无氧无水条件下反应10-12小时；同样反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮，然后将产物溶解在水中，加水量与产物的比例为100-300mL/g，产物溶解后放入截留分子量为7000Mw的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建的可降解药物载体；
所述的多糖大分子引发剂的结构式如下：
R为多糖的羟基被取代后的骨架结构，F为含两个及以上氨基的胺类基团，n＝1-40；多糖为分子量6000-25000的葡聚糖、分子量为900-1200的环糊精、分子量为4000-20000的壳聚糖、分子量为8000-20000的普罗兰；所述的单体为天冬氨酸β-苄酯N-羰基内酸酐；所述的有机溶剂选自亚砜类、酰胺类、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、正己烷中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中各组分加入顺序为：先将多糖大分子引发剂和单体分别溶于有机溶剂，然后混合进行聚合反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酰胺类为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺；所述的亚砜类为二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、二己基亚砜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当有机溶剂为二甲基亚砜时，聚合反应体系中不包括二氯甲烷。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当反应体系中加入二氯甲烷时，有机溶剂为体积比为1:1的酰胺类有机溶剂与二氯甲烷的混合溶剂。
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