CN104311570A - 一种含有香豆素结构的木脂素类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有香豆素结构的木脂素类化合物，该化合物的结构为：

Description

一种含有香豆素结构的木脂素类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种含有香豆素结构的木脂素类化合物，还涉及了该化合物的制备方法和应用。 

背景技术

五味子为五味子科(Schisandraceae)，双子叶植物，有南五味子属(Kadsura)和五味子属(Schisandra)两属，共50种，分布于东亚、东南亚及北美南部,我国两属均产之，约30余种,产于西南部至东北部,但主产地为西南部和中南部。五味子属(Schisandra)约有25种，我国有19种，分布于西南至东南部。 

目前，从五味子科植物中分离得到的化合物主要为两大类：三萜(Triterpenes)类化合物和木脂素(Lignans)。三萜类化合物大多为羊毛甾烷型和环阿尔廷型,由于其骨架易发生变化,且由于氧化度不同使这类三萜化合物结构复杂独特。木脂素多为联苯环辛烯类。现代药理学研究表明木脂素和三萜是该科植物的主要活性成分，近年来有报道从五味子属植物中分离到的木脂素在抗HBV方面具有一定的潜力。因此对该属植物的继续深入研究显得尤为重要。 

异型南五味子药材，俗称“血筒”，是湖南土家族“三十六血”药物之一，又名血七、血通、香血等，其性味甘，微辛，温，来源于五味子科南五味子属异型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb)Craib植物的藤茎，主产于我国西南部至南部。在湖南民间，该药常用来治疗风湿病和病毒性肝炎^[1]，常用于风湿痹痛、胃脘痛、经痛、风湿性关节炎等症，具有补血活血、祛风除湿、行气止痛的功效。 

目前研究表明，三萜类和木脂素类化合物是该植物的主要成分，三萜类化合物的活性主要表现为抗HIV和细胞毒性；木脂素成分的活 性结果显示具有抗脂质过氧化作用，抗HIV活性，同时证明具有PAF受体拮抗剂活性。 

乙型肝炎是一种由乙肝病毒(HBV)引起的严重疾病，也是世界上高发病率和高死亡率的疾病之一。乙肝病毒可能导致肝纤维化或硬化、肝癌、肝功能衰竭和死亡。全世界约有3.5亿乙肝病毒携带者，主要分布于亚洲、非洲和拉丁美洲地区，他们当中最终约有20％的携带者发展成不同程度的慢性肝炎和肝硬化，并且其中的一部分最后演变成原发性肝癌。 

目前，在临床上广泛使用的抗乙型肝炎病毒的药物主要有：干扰素、以拉米夫定(lamivudine)为主的核苷类似物、免疫调节剂如胸腺素和白介素-2、氧化苦参碱、联苯双酯等。核苷类药物是人类目前治疗病毒、艾滋病的重要手段。拉米夫定既可抗逆转录病毒又可抗肝炎病毒。目前在研的抗乙型肝炎病毒药物中，也有很多是核苷类化合物。研究表明，一些核苷类或其类似物药物在使用中已经出现耐药性。目前新开发的药物还是集中在核苷及其类似物方面。另一方面，从自然资源中寻找抗乙肝病毒药物的工作也一直在进行中。 

发明内容

本发明的目的是提供一种含有香豆素结构的木脂素类化合物。 

本发明提供了一种含有香豆素结构的木脂素类化合物，该化合物的结构为： 

本发明将该化合物命名为Coumarinlignan。 

所述化合物可以通过化学合成法进行合成，也可以通过生药提取法得到。 

本发明还提供了所述化合物的制备方法。 

所述方法为生药提取法，包括以下步骤：以异型南五味子药材为原料，经有机溶剂提取、萃取，用色谱柱洗脱、分离，得到所述目标化合物。 

具体的，所述方法包括以下步骤： 

1)将异型南五味子药材切片，用浓度为75～80％乙醇回流提取3～5次，每次1.5～2小时，合并提取液，减压浓缩得醇浸膏，用水溶解得到混悬液；将混悬液用石油醚重复萃取3～5次，合并石油醚层萃取液；将所得石油醚层萃取液用氯仿重复萃取3～5次，合并氯仿层萃取液，减压浓缩，得到萃取物； 

2)取步骤1)所得萃取物，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，以体积比为(4～1)：1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，收集洗脱液； 

3)取步骤2)所得洗脱液，减压浓缩后，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，以体积比为(2～1)：1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，收集洗脱液； 

4)取步骤3)所得洗脱液，减压浓缩后，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，以体积比为(6～2)：1的石油醚-丙酮为流动相进行洗脱，收集洗脱液； 

5)取步骤4)所得洗脱液，减压浓缩后，样品上MCI色谱柱，以体积比为(9.5～9)：1的甲醇-水为流动相进行洗脱，收集洗脱液，进行浓缩、干燥，目标化合物即得。 

其中，步骤2)～4)所述硅胶的粒径为80～100目；步骤5)所述MCI色谱柱的填料为聚苯乙烯和二乙烯苯基共聚物或聚甲基丙烯酸酯，所述填料的粒径为100～200目。 

步骤2)～5)任意步骤中流动相总体积为色谱柱体积的2～10倍。 

步骤2)～4)任意步骤所述洗脱，可以以单一比例的流动相进行洗脱，也可以依次以不同比例的流动相进行梯度洗脱后合并洗脱液， 从而减少以单一比例的流动相进行洗脱过程中目标化合物的损失。 

在依次以不同比例的流动相进行梯度洗脱的条件下，各比例的流动相的体积可以不同，也可以相同；各比例的流动相的体积优选为2倍色谱柱体积。 

步骤2)所述洗脱优选为：依次以四种不同比例的2倍色谱柱体积的流动相进行梯度洗脱，所述流动相依次分别为体积比4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯。 

步骤3)所述洗脱优选为：依次以两种不同比例的2倍色谱柱体积的流动相进行梯度洗脱，所述流动相依次分别为体积比2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯。 

步骤4)所述洗脱优选为：依次以五种不同比例的2倍色谱柱体积的流动相进行梯度洗脱，所述流动相依次分别为体积比6:1、5:1、4:1、3:1、2:1的石油醚-丙酮。 

本发明进一步保护所述化合物的应用。 

具体的，所述应用包括化合物在制备治疗乙型肝炎或神经系统疾病的药物中的应用。 

本发明提供的化合物在低浓度的条件下，对HBsAg和HBeAg表达有抑制作用，体现了良好的抗乙肝病毒活性；对肝星状细胞的生长有抑制作用，体现了良好的抗肝纤维化活性。 

本发明提供的化合物对神经细胞和PC12细胞有保护作用，体现了良好的神经保护活性；对预炎症细胞因子基因TNF-α和IL-1β的mRNA表达有抑制作用，体现了良好的抗神经炎症反应活性。 

附图说明

图1，为化合物的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱图。 

图2，为化合物的¹³C-NMR谱图。 

图3，为化合物的¹H-NMR谱图。 

图4，为化合物的HR-ESI-MS谱图。 

图5，为不同浓度的化合物对细胞增值的影响，其中，▲P<0.05，*P<0.05。 

图6，为不同浓度的化合物对细胞存活率的影响；其中，图6A为化合物对经无血清培养基处理后细胞存活率的影响，图6B为化合物对经H₂O₂处理后细胞存活率的影响；CL代表Coumarinlignan，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 

图7，为不同浓度的化合物对TNF-α和IL-1β基因表达的影响；其中，图7A为化合物对TNF-α的mRNA表达的影响，图7B为化合物对IL-1β的mRNA表达的影响；CL代表Coumarinlignan，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1：化合物的制备 

1、色谱柱条件： 

1)硅胶柱：填料为粒径100目的硅胶； 

2)MCI柱：填料为粒径100目的聚苯乙烯和二乙烯苯基共聚物。 

2、目标化合物Coumarinlignan的制备，包括以下具体步骤： 

1)取异型南五味子药材20kg，切片，用浓度为80％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得醇浸膏，用水溶解得到混悬液；将混悬液用石油醚重复萃取5次，合并石油醚层萃取液；将所得石油醚层萃取液用氯仿重复萃取5次，合并氯仿层萃取液，减压浓缩，得到萃取物； 

2)取步骤1)所得萃取物，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，依次以体积比分别为4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，所述各比例流动相的体积均为2倍柱体积，收集、合并洗脱液； 

3)取步骤2)所得洗脱液，减压浓缩后，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，依次以体积比分别为2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行 洗脱，所述各比例流动相的体积均为2倍柱体积，收集、合并洗脱液； 

4)取步骤3)所得洗脱液，减压浓缩后，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，依次以体积比分别为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1的石油醚-丙酮为流动相进行洗脱，所述各比例流动相的体积均为2倍柱体积，收集、合并洗脱液； 

5)取步骤4)所得洗脱液，减压浓缩后，样品上MCI色谱柱，以体积比为9：1的甲醇-水为流动相进行洗脱，所述流动相体积为5倍柱体积，收集洗脱液，进行浓缩、干燥，得到目标化合物8.2mg，纯度为98％。 

实施例2：化合物的制备 

目标化合物Coumarinlignan的制备，与实施例1相比，制备方法仅存在以下区别：步骤2)所述洗脱条件为：依次以体积比分别为2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，所述各比例流动相的体积均为2倍柱体积。所得目标化合物7.8mg，纯度为97.6％。 

实施例3：化合物的制备 

目标化合物Coumarinlignan的制备，与实施例1相比，制备方法仅存在以下区别：步骤2)所述洗脱条件为：以体积比为2:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，所述流动相的体积为3倍柱体积。所得目标化合物7mg，纯度为97.3％。 

实施例4：化合物的制备 

目标化合物Coumarinlignan的制备，与实施例1相比，制备方法仅存在以下区别：步骤3)所述洗脱条件为：以体积比为2:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，所述流动相的体积为2倍柱体积。所得目标化合物7.7mg，纯度为96.8％。 

实施例5：化合物的制备 

目标化合物Coumarinlignan的制备，与实施例1相比，制备方法仅存在以下区别：步骤4)所述MCI色谱柱填料为聚甲基丙烯酸酯，粒 径为100目；洗脱条件为：以体积比为3:1的石油醚-丙酮为流动相进行洗脱，所述流动相的体积为5倍柱体积。所得目标化合物6.5mg，纯度为97％。 

实验例1 

取实施例1所得化合物进行鉴定，鉴定结果如下所述： 

1)性状：白色片状晶体(氯仿-甲醇)； 

2)熔点：188-190℃； 

3)旋光度：+135.6(c 1.00,MeOH)； 

4)分子式：C₂₀H₁₆O₇； 

化合物的HR-ESI-MS谱图(图4)确定其分子量，参数为m/z391.07870[M+Na]+，计算值为391.07937； 

化合物的红外光谱图(图1)显示了3603cm^-1(羟基)和1697cm^-1(内酯键)的吸收峰； 

化合物的¹³C-NMR谱图(图2)和DEPT谱图显示有20个碳信号，包括4个亚甲基，7个次甲基和9个季碳； 

化合物的¹H-NMR谱(图3)显示有两个二氧亚甲基(δH 5.85,6.01)和6个芳香氢质子信号，其中，3个芳香氢(δH＝6.63,d,J＝7.9Hz,H-5'；δH＝6.57,dd,J＝7.9Hz,J＝1.2Hz,H-6'和δH＝6.65,d,J＝1.2Hz,H-2')为ABX系统质子信号，通过核磁数据与已报到的文献数据，可以推断其具有3,4-methylenedioxylignan骨架片段；另外3个芳香氢为单峰质子信号(δH 6.76,6.74和7.34),由此判断该化合物存在3,4-methylenedioxycoumarin结构单元； 

根据化合物的HMBC谱得到的数据(表1)可进一步确定3,4-methylenedioxylignan和3,4-methy-lenedioxycoumarin两个结构单元的存在；具体的，HMBC谱显示H-8'(δ3.15)与C-9(δ162.3)、C-9'(δ63.1)、C-8(δ125.6)、C-7(δ140.7)和C-7'(δ35.4)有远程相关，说明内酯环和C6-C3这两个骨架单元通过C-8和C-8'进行连接； 

表1：化合物10的¹H-NMR和¹³C-NMR核磁数据及HMBC的主要相关信号 

通过培养单体化合物晶体和X-ray单晶衍射实验，可以确定该化合物的绝对构型如下所示： 

实验例2 

1、实验材料： 

1)Coumarinlignan：实施例1所得； 

2)拉米夫定：购自苏州葛兰素史克制药有限公司； 

3)HepG2.2.15细胞株：取自中南大学中心实验室； 

4)小牛血清：购自杭州四季青生物工程材料有限公司； 

5)HBsAg、HBeAg检测ELISA试剂盒：购自上海科华生物技术有限公司； 

6)四甲基偶氮唑盐(MTT)：购自美国Sigma公司； 

7)倒置荧光显微镜：购自Leica公司； 

8)酶标仪：购自美国Thermo Forma公司。 

2、实验方法 

1)细胞培养：取对数生长期的HepG2.2.15细胞接种于96孔板，每孔接种1×10⁴个细胞，设3个复孔，细胞悬液体积为200μL，置于二氧化碳培养箱(5％CO₂,37℃)过夜贴壁后，加入含25μg/mL浓度的Coumarinlignan(或含1mg/ml浓度的拉米夫定)的完全培养基(DMEM，FBS 10％，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)培养2天； 

2)ELISA检测：取各孔中细胞上清液，按ELISA试剂盒规定步骤进行操作，用酶标仪(波长450nm)检测各孔的OD值，计算得到化合物对HepG2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg表达的抑制率； 

3)MTT检测：各孔加入MTT溶液(0.5mg/mL)200μL，继续孵育4h后弃上清，每孔加入DMSO 150μL，用酶标仪(波长570nm)测定各孔的OD值，细胞存活率＝(实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100％。 

3、实验结果 

1)化合物对HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg表达的影响参见表2-1。 

表2-1：化合物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 

由以上结果可知，低浓度的Coumarinlignan对HepG2.2.15细胞中 HBsAg表达的抑制率为57％，远大于高浓度的拉米夫定对HBsAg表达的抑制率10％；同时，低浓度的Coumarinlignan对HepG2.2.15细胞中HBeAg表达的抑制率为48％，与高浓度的拉米夫定对HBeAg表达的抑制率相同。上述结果表明，Coumarinlignan具有良好的抗乙肝病毒活性。 

2)化合对的HepG2.2.15细胞增殖的影响参见表2-2。 

表2-2：化合物对HepG2.2.15细胞增殖的影响 

由以上结果可知，低浓度的Coumarinlignan对HepG2.2.15细胞增殖有促进作用，细胞存活率提高了8％；高浓度的拉米夫定对HepG2.2.15细胞增殖有抑制作用，细胞存活率下降了13％。上述结果表明，Coumarinlignan具有良好的抗乙肝病毒活性。 

实验例3 

肝纤维化是不同病因所致的慢性肝病发展过程中共有的病例特征，其形成基质复杂，关键环节在于肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化。通过测定Coumarinlignan对乙醛刺激后的肝星状细胞(HSC-T6)增殖的影响，可检测该化合物的抗肝纤维化活性。 

1、实验材料 

1)Coumarinlignan：实施例1所得； 

2)肝星状细胞(HSC-T6)：购自中国科学院细胞库。 

2、实验方法 

1)细胞培养：在CO₂5％、温度37℃、湿度100％的条件下，用DMEM培养基(含1％青霉素-链霉素和10％FBS)进行细胞培养，每2天更换一次培养基；当细胞汇合后，用0.02％EDTA-0.05％胰蛋白酶溶液培养； 

2)MTT检测：将细胞接种于96孔板，每孔接种5×10⁴个细胞，孵育12个小时后，加入不同浓度的Coumarinlignan，每12h用200μM的乙醛刺激，孵育48小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续孵育4h,形成的蓝色染料用100μL DMSO溶解，用酶标仪(波长570nm)测定各孔的OD值； 

3)细胞抑制率的计算：抑制率IR(％)＝(模型组OD值—给药组OD值)/(模型组OD值–正常组OD值)×100％。 

3、实验结果 

如图5所示，随着Coumarinlignan浓度的增强，肝星状细胞的OD值下降，说明该化合物具有一定的抗肝纤维化活性；其中，化合物浓度为50μM/L时，对乙醛刺激后的HSC-T6细胞的抑制率达到了71％。 

实验例4 

1、实验材料 

1)Coumarinlignan：实施例1所得； 

2)PC12细胞：取自中科院上海药物研究所； 

3)BV-2小胶质细胞：取自中国药科大学； 

4)其它试剂：DMEM培养基(25mM葡萄糖)、胎牛血清(FBS)、NeuroBasal培养基、B27、双抗(青霉素和链霉素)、TRIzol、反转录试剂盒和Syber Green试剂盒均购自Invitrogen公司；脂多糖LPS、MTT均购自Sigma-Aldrich公司。 

2、实验方法 

1)神经细胞培养：从出生7-8天的SD大鼠中无菌分离得到小脑颗粒神经细胞(纯度＞95％)，以1×10⁶/mL接种于预先经0.1mg/mL多聚赖氨酸铺板的96孔培养板中，置于37℃含5％CO₂培养箱中培养，24小时后更换含10μM阿糖胞苷的培养液；待细胞培养6天分化成熟后，进行细胞实验； 

2)P12细胞培养：将PC12细胞培养在含有10％FBS、100U/mL青 霉素和100U/mL链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃含5％CO₂培养箱中培养； 

3)BV-2细胞培养：将BV-2细胞培养在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃含5％CO₂培养箱中培养； 

4)神经细胞保护实验：在小脑颗粒神经细胞培养第6天，药物组分别加入不同浓度的化合物Coumarinlignan，阳性药物组加入10mM的乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)，分别预孵育12小时后，模型组和药物组分别换成无血清(-B27)的培养液孵育24小时；以上反步骤完成后，每孔加入终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，用MTT法测定细胞存活率； 

5)PC12细胞保护实验：在PC12细胞接种后第2天，药物组分别加入不同浓度的化合物Coumarinlignan，阳性药物组加入10mM的N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)，分别预孵育12小时后，模型组和药物组分别换成含有500μM的过氧化氢(H₂O₂)的培养液作用24小时；以上步骤完成后，每孔加入终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，用MTT法测定细胞存活率； 

6)TNF-α和IL-1β基因表达检测：将BV-2细胞以5×10⁵/ml的密度接入6孔板，细胞接种24小时后换无血清培养基继续处理12小时，然后给予不同浓度的化合物Coumarinlignan预孵育2小时(阴性对照组给予等量的DMSO)，然后给予1μg/ml的LPS刺激，LPS孵育1小时后通过TRIzol裂解细胞，通过TRIzol试剂提取胞内总RNA；利用RT-PCR方法检测TNF-α和IL-1β基因的mRNA表达情况，以磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为内参，Real time-PCR反应程序为50℃/2min(step 1)，95℃/10min(step 2)，95℃/15s-60℃/60s(step 3)，其中step 3重复40个循环。 

3、实验结果 

1)Coumarinlignan的神经保护作用检测结果如图6所示。 

由图6A可知，空白对照组的正常细胞(大鼠小脑颗粒神经元)用DMSO处理的细胞存活率为100％，模型组换为无血清培养基(-B27)中细胞存活率为38.8±1.4％，阳性对照组加入10mM N-乙酰半胱氨酸处理的细胞存活率为53.7±1.2％，给药组加入不同浓度的化合物Coumarinlignan后细胞存活率分别达到了42.1±1.3％、49.6±1.1％、44.2±1.3％； 

由图6B可知，空白对照组的PC12细胞用DMSO处理的细胞存活率为100％，模型组换为H₂O₂处理后细胞存活率为61.9±3.8％，阳性对照组加入10mM的N-乙酰半胱氨酸处理的细胞存活率为87.8±3.8％，给药组加入不同浓度的化合物Coumarinlignan后细胞存活率分别达到了74.1±1.2％、65.5±1.4％、71.8±1.3％。 

2)Coumarinlignan的抗神经炎症活性检测结果如图7所示。 

由该结果可知，低浓度的Coumarinlignan抑制了脂多糖诱导的小胶质细胞的炎症反应指标-预炎症细胞因子基因TNF-α和IL-1β的mRNA表达，显示出了极好的抗神经炎症反应的活性。 

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (10)

1.一种含有香豆素结构的木脂素类化合物，其特征在于，该化合物的结构为：

2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以异型南五味子药材为原料，经有机溶剂提取、萃取，用色谱柱洗脱、分离，化合物即得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将异型南五味子药材切片，用浓度为75～80％乙醇回流提取3～5次，每次1.5～2小时，合并提取液，减压浓缩得醇浸膏，用水溶解得到混悬液；将混悬液用石油醚重复萃取3～5次，合并石油醚层萃取液；将所得石油醚层萃取液用氯仿重复萃取3～5次，合并氯仿层萃取液，减压浓缩，得到萃取物；

2)取步骤1)所得萃取物，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，以体积比(4～1)：1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，收集洗脱液；

3)取步骤2)所得洗脱液，减压浓缩后，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，以体积比(2～1)：1的石油醚-乙酸乙酯为流动相进行洗脱，收集洗脱液；

4)取步骤3)所得洗脱液，减压浓缩后，用硅胶拌样，样品上硅胶柱，以体积比(6～2)：1的石油醚-丙酮为流动相进行洗脱，收集洗脱液；

5)取步骤4)所得洗脱液，减压浓缩后，样品上MCI色谱柱，以体积比(9.5～9)：1的甲醇-水为流动相进行洗脱，收集洗脱液，进行浓缩、干燥，化合物即得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)～4)所述硅胶的粒径为80～100目；步骤5)所述MCI色谱柱的填料为聚苯乙烯和二乙烯苯基共聚物或聚甲基丙烯酸酯，所述填料的粒径为100～200目。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)～5)任意步骤中流动相总体积为色谱柱体积的2～10倍。

6.根据权利要求3～5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2)～4)任意步骤所述洗脱为：依次以不同比例的流动相进行梯度洗脱。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述洗脱为：依次以四种不同比例的2倍色谱柱体积的流动相进行梯度洗脱，所述流动相分别为体积比4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述洗脱为：依次以两种不同比例的2倍色谱柱体积的流动相进行梯度洗脱，所述流动相分别为体积比2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)所述洗脱为：依次以五种不同比例的2倍色谱柱体积的流动相进行梯度洗脱，所述流动相分别为体积比6:1、5:1、4:1、3:1、2:1的石油醚-丙酮。

10.权利要求1所述化合物或权利要求2～9任意一项所述方法制备得到的化合物的应用，其特征在于，所述应用包括在制备治疗乙型肝炎或神经系统疾病的药物中的应用。